Echerichia coli kasvu heterogeensus ja toksiin-antitoksiini süsteemid

TARTU ÜLIKOOLLoodus-ja tehnoloogiateaduskondMolekulaar-ja rakubioloogia instituutMolekulaarbioloogia õppetoolToomas MetsEcherichia coli kasvu heterogeensus ja toksiin-antitoksiinisüsteemidJuhendajad:Niilo Kaldalu, PhDÜlo Maiväli, PhDTartu 2010

SisukordSisukord........................................................................................................................................... 2Kasutatud lühendid.......................................................................................................................... 3Sissejuhatus ..................................................................................................................................... 41.Kirjanduse ülevaade ..................................................................................................................... 51.1.Fenotüübiline heterogeensus bakteripopulatsioonides .......................................................... 51.1.1. Bistabiilsus .................................................................................................................... 51.1.2. Bistabiilsuse tekkemehhanismid ................................................................................... 61.1.3. Müra ja bistabiilsus........................................................................................................ 81.1.4. Persistorid .................................................................................................................... 101.2. Toksiin-antitoksiin süsteemid............................................................................................. 121.2.1. Üldine ülevaade ........................................................................................................... 121.2.2. Toksiin-antitoksiin süsteemide jaotus ......................................................................... 142. Eksperementaalosa .................................................................................................................... 162.1. Materjal ja metoodika......................................................................................................... 162.1.1. Bakteritüved ja plasmiidid........................................................................................... 162.1.2. Söötmed....................................................................................................................... 172.1.3. Transformatsioon......................................................................................................... 182.1.4. Elektroporatsioon ........................................................................................................ 182.1.5. DNA eraldamine ja kloneerimine................................................................................ 182.1.6. Plasmiidi integreerimine bakteri genoomi................................................................... 192.1.7. HipA külmatundliku tüve HM22 kasvu uurimine....................................................... 202.1.8. Külma-ja kuumatundlike E.coli mutantide kasvu uurimine........................................ 202.1.9. BW25113 ja BW25113 ∆relBE tüvede statsionaarsest faasist väljumise võrdlemine.212.1.10. BW25113 ja BW25113 ∆relBE bakterite käitumise võrdlus aminohappenäljatingimustes............................................................................................................................. 212.1.11. Toksiinide üleekspressiooni võrdlus E. colis. ........................................................... 222.1.12. Voolutsütomeetriline analüüs.................................................................................... 222.2. Tulemused ja arutelu .............................................................................................................. 232.2.1. Mittejaguneva bakteripopulatsiooni teke peale HipA aktivatsiooni............................ 232.2.2. Külma-ja kuumatundlike E. coli mutantide kasvu uurimine....................................... 252.2.3. Bakterite jagunemine peale TA toksiinide üleekspressiooni....................................... 282.2.4. relBE ei mõjuta bakterite jagunemisvõimet statsionaarsest faasist väljudes............... 302.2.5. relBE ei mõjuta bakterite jagunemist peale aminohappenälga.................................... 34Kokkuvõte ..................................................................................................................................... 37Toxin-antitoxin systems and heterogeneity of growth in Echerichia coli..................................... 38Kasutatud kirjandus ....................................................................................................................... 392

Kasutatud lühendidAmp: ampitsilliin (ampicillin)Cam: klooramfenikool (chloramphenicol)CFU: kolooniat moodustavat ühikutCGSC: E. coli säilituskukltuuride keskus (The Coli Genetic Stock Center)DAP: diaminopimeelhape (diaminopimelic acid)E. coli: Escherichia coliB. subtilis: Bacillus subtilisGFP: roheline fluoretseeruv valk (green fluorescent protein)IPTG: isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiid (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)Kan: kanamütsiin (kanamycin)LB: Lurian-Bertani söödeMT: metsiktüüpSAP: kreveti aluseline fosfataas (shrimp alkaline phosphatase)SHT: seriinhüdroksamaat (serine hydroxamate)SOB: Super Optimal BrothTA: toksiin-antitoksiin (toxin-antitoxin)Tet: tetratsükliin (tetracycline)

SissejuhatusMaailm, mida bakterid ja teised mikroorganismid asustavad, on nende jaoks ohtlik paik. Needpisikesed organismid peavad toime tulema pidevalt muutuvas keskkonnas, mille temperatuur,soolsus, pH ja toitainete hulk kogu aeg varieeruvad. Lisaks ohustavad prokarüoote kaümbritsevas keskkonnas leiduvad antibiootikumid, bakteriofaagid, mutageenid, toksiinid,radiatsioon ja paljud teised ohtlikud ained ja tingimused. Vaenulikus ja pidevalt muutuvaskeskkonnas ellujäämiseks on bakteritel välja kujunenud mitmed strateegiad. Üheks strateegiakson stressivastus, mille puhul aktiveeritakse vastusena keskkonnastiimulile vajalikud geenid (Storzja Hengge-Aronis, 2000). Teine viis, mis aitab bakteritel erinevate stressiolukordadega kohaneda,on kultuuris eksisteeriv fenotüübiline varieeruvus. Selle näideteks on Bacillus subtilissporulatsioon, kannibalism ja geneetiline kompetentsus ning Escherichia coli antibiootikumideletolerantsed persistorrakud (Dubnau. D ja Losick. R, 2006). Bakteripopulatsioonis leiduvaderinevad stressitolerantsed rakud võivad olla olulised uute keskkondade koloniseerimisel,kliinilisite probleemide pikaajalisel püsimisel ja toiduainete saastamisel (Humpheson jt., 1988;Niven ja Mulholland, 1998; Pascual jt., 2001; Robinson jt., 2001; Vidal-Mas jt., 2001).Bakterite fenotüübiline varieeruvuse uurimine on oluline nii nende füsioloogia mõistmise kui kaselle meditsiinilise ja toidutööstusliku tähtsuse pärast. Käesolev bakalaureusetöö keskendubtoksiin-antitoksiin süsteemide ja fenotüübilise varieeruvuse seoste uurimisele. Kirjanduse osasantakse ülevaade bakteripopulatsioonis esinevatest fenotüübilise heterogeensuse vormidest janende saavutamise mehhanismidest. Seletatakse ka lahti, mis on toksiin-antitoksiin süsteemid jakirjeldatakse nende põhilisi vorme. Eksperimentaalse osa eesmärk oli uurida bakterite kasvuheterogeensust erinevates füsioloogilistes tingimustes, kasutades mudelorganismina E. colit.Suurema tähelepanu alla võeti toksiin-antitoksiin süsteemide roll bakterite jaguneva jamittejaguneva populatsiooni tekkimisel.4

1.Kirjanduse ülevaade1.1.Fenotüübiline heterogeensus bakteripopulatsioonides1.1.1. BistabiilsusBakterite võime erinevates niššides ellu jääda ja erinevaid stresse üle elada sõltub suurel määralnende geneetilisest infost. Tihti kasutab erinevaid ellujäämisstrateegiaid ainult osa kogubakteripopulatsioonist (Smits jt., 2006). Sagedasti on prokarüootide puhul alusetuks eelduseks, etkogu populatsioon reageerib keskkonnamuutustele ühesuguselt. Selle põhjuseks on asjaolu, etklassikaliselt nendes uuringutes kasutatavad tehnikad määravad mingite signaalide keskmiseidväärtusi üle kogu populatsiooni. Tänu uute uurimismeetodite (näiteks voolutsütomeetria jafloresentsmikroskoopia) kasutuselevõtule on olnud võimalik jälgida geneetiliselt identseidpopulatsioone ühe raku tasandil. Klonaalsel bakteripopulatsioonil on antud geeni unimodaalnegeeniekspressiooni variatsioon, mis on põhjustatud sünteesi määra ja geeniprodukti lagundamisefluktuatsioonidest. Antud müra on oluline teist tüüpi, mitte-unimodaalse variatsioonitekitamiseks. Selle variatsioonitüübi puhul tekivad alampopulatsioonid ja vahepealsed olekudjäävad peaaegu olematuteks. Seda fenotüübilist fenomeni nimetatakse bistabiilsuseks ja selleesilekerkimine on stohhastiline protsess (Dubnau. D ja Losick. R, 2006).On arusaadav, miks bistabiilsus bakteritele kasulik võib olla. Prokarüoodid ei oska tulevikkuennustada, kuid seda tüüpi heterogeensus lubab neil igaks juhuks populatsioonis hoida jubamuutuvateks keskkonnatingimusteks valmis olevaid rakke. Kogu populatsioonile oleks stressigatoimetulevate mehhanismide pidevalt töös hoidmine energeetiliselt liiga kulukas ja järsulekeskkonnamuutusele reageerimisaeg pole ellujäämiseks tihti piisav. Seetõttu ongi kasulikpopulatsioonis hoida teatud hulka juba stressiks valmis olevaid rakke (Dubnau. D ja Losick. R,2006). Teoreetilised analüüsid näitavad, et bistabiilsus on kõige optimaalsem protsessolukordades, kus keskkonnatingimused muutuvad järsult ja harva ning kohanemine vastavaltmuutustele keskkonnas on eelistatud olukorras, kus muutused leiavad aset sagedasti (Kussell jaLeibler, 2005). Mõnedel juhtudel ei pruugi heterogeensus olla pidevalt esinev protsess, vaidilmneb olukorras, kus stress on tõenäolisem. Sellise käitumise näideteks on B. subtilisesporulatsioon ja geneetiline kompetentsus (Dubnau. D ja Losick. R, 2006).5

1.1.2. Bistabiilsuse tekkemehhanismidBistabiilsus tekib unimodaalsest mürast regulaatorgeeni ekspressioonis. Kui antud geeniekspressioon ületab mingi läve, läheb kvantitatiivne muutus üle kvalitatiivseks: populatsioonjaguneb mitmeks erinevaks korraga eksisteerivaks rakutüübiks. Bistabiilne süsteem saabeksisteerida kahes erinevas olekus, aga mitte nende vahepealsetes seisundites. Sellise lahknemisetoimumiseks on välja pakutud kaks põhilist mehhanismi (Ferrell, 2002). Esimeses mehhanismison protsessi kontrolli regulaatorgeen positiivselt autoreguleeritud ja reageerib enda produktilemittelinearselt (Joonis 1.). Mittelineaarsus muudab vastuse regulaatori kontsentratsioonimuutustele hüpersensitiivseks. Rakud, mille regulaatorvalgu kogus ületab läve, pannaksepositiivse autoregulatsiooni tõttu veelgi rohkem seda valku tootma. Allavoolu asuvate geenideekspressioon muutub ja populatsioon jaguneb kaheks. Teine mehhanism koosneb kahestvastastikku üksteise sünteesi represseerivast repressorist (Joonis 1.). Kui Repressor2inaktiveeritakse (näiteks induktori lisamise tõttu) toodetakse Reperessor1-te ja lülitatakse väljaRepressor2-e süntees. Efekt on antud juhul sama, mis positiivse autoregulatsiooni puhul, sestRepressor1 hulga kasv põhjustab Repressor1 produktsiooni suurenemist. Kui Repressor2 peaksrepresseerima mingeid allavoolu jäävaid geene, siis antud olukorras, kus Repressor2 tootmine ontakistatud, toimub nende ekspressioon. Induktori eemaldamisel jääb tekkinud olukord püsima.Juhul kui ainult osa populatsioonist jõudis enne induktori süsteemist kadumist muutuda (näiteksmadala induktori kontsentratsiooni tõttu), jäävad erinevad rakutüübid populatsiooniskooseksisteerima kuni repressorite kontsentratsiooni fluktuatsioon jälle rakkude olekut muudab(Dubnau. D ja Losick. R, 2006). Neid kahte skeemi on leitud kasutatavat kombinatsioonisregulatoorsete elementidega in vivo E. colis (Gardner jt., 2000) ja pungvates pärmides (Becskeijt., 2001).6

Joonis 1. Kaks süsteemi, mis viivad rakus bistabiilse ekspressioonini. Esimene koosneb positiivsestautoregulatoorsest ringist (Becskei jt., 2001). Teine koosneb kahest üksteist mutuaalselt represseerivast repressorist(Gardner jt., 2000). Seest tühjad sümbolid kirjeldavad repressoreid ning seest täidetud ringid on aktivaatorid.Dubnau ja Losick, 2006 järgi.Esimest tüüpi bistaabilsuse tekkemehhanismi heaks näiteks on B. subtilise kompetentseksmuutumine. Mõned bakterid on võimelised keskkonnast omastama DNA-d jarekombinatsiooniga selle jäädavalt enda genoomi sisestama. See on geneetiliseltprogrammeeritud protsess, mida nimetatakse transformatsiooniks ning see vajab toimumiseksDNA transpordi-ja rekombinatsioonivalkude sünteesi (Chen jt., 2005). Rakke nimetataksekompetentseteks kui neis toodetakse vastavaid valke ja nad on võimelised transformatsiooniks. B.subtilises esineb kompetentsus statsionaarses faasis loomulikult. Seejuures sünteesib DNAtranspordiks vajalikke valke ainult umbes 10% kogu statsionaarse faasi kultuurist. Need rakud ongeneetiliselt ühesugused ning külvates samast kultuurist uuesti algsetes tingimustes välja niikompetentseid kui ka mittekompetentseid baktereid, saadakse jällegi mõlemal juhulstatsionaarsesse faasi jõudmisel 10% kompetentseid rakke (Dubnau. D ja Losick. R, 2006).B. subtilise kompetentsust määrav regulaator on transkriptsiooniaktivaator ComK, mis kontrollibkõigi allavoolu asuvate DNA transportvalkude ekspressiooni (van Sinderen jt., 1995). ComK onka positiivne autoregulaator, mida on otseselt vaja enda geeni transkriptsiooniks (van Sinderen jaVenema, 1994). ComK seondub comK promootorile dimeeride dimeerina ning eeldatavalt ontranskriptsioon seetõttu ComK kontsentratsiooni suhtes hüpersensitiivne (Hamoen jt.,1998)(Joonis 2.). Seega on täidetud mõlemad bistabiilsuse kriteeriumid: positiivneautoregulatsioon ja mittelineaarsus. Mitmes uuringus, kus seoti GFP ComK-ga, on näidatud, etfloresentsi bimodaalne jaotus sõltub positiivsest autoregulaarsest süsteemist, mis koosneb valkComK-st ja comK promootorist (Maamar ja Dubnau, 2005; Smits, 2005).7

.Joonis 2. Kompetentsuse regulatsioon B.subtilisel. ComK onkompetentsusespetsiifiline transkriptsiooniregulaator, mida on vaja iseenese geenitranskriptsiooniks. See positiivneautoregulatoorne tagasiside onkompetentsuse regulatsioonil keskselkohal. ComK seondub comK promootorilemis mõjutavad ComK sünteesi. Dubnau ja Losick 2006, järgi.dimeeride dimeerina. TramskriptsioonicomK-lt mõjutavad ka mitmed teisedvalgud, näiteks Rok ja CodY. Quromsensing viib valgu ComS sünteesile, miskaitseb ComK-d degradatsiooni eest.Joonisel on näidatud tähtsamad elemendid,Klassikaliseks teist tüüpi bistabiilse lüliti näiteks on faag lambda topeltnegatiivne tagasiside, miskontrollib antud viiruse lüsogeenset ja lüütilist olekut (Ptashne, 2004). Kui lambda repressori CIkontsentratsioon on kõrge, represseeribsee repressor Cro-d kodeeriva geenining sellega ka geenid, mis on seotudfaagi lüütilise faasiga. Sellisel juhul onviirus lüsogeenses olekus. Kuiülekaalus on Cro valk, represseerib seeCI-d kodeeriva geeni. Antud olukorrassaavad vabalt ekspresseeruda geenid,mis osalevad lambda lüütilises kasvus(Losick ja Desplan, 2008)(Joonis 3.).Joonis 3. . Faag lambda lüsogeense ja lüütilise tsükli regulatsioon.Losick ja Desplan, 2008 järgi.1.1.3. Müra ja bistabiilsusGeneetiliselt identsetes rakkudes samasuguses keskkonnas kasvamisel võib spetsiifiliste valkudetase transkriptsiooni ja translatsiooni stohhastiliste fluktuatsioonide tõttu rakuti varieeruda (Kærn8

jt., 2005; Paulsson, 2004; Rao jt., 2002). Seda fenomeni kutsutakse geeniekspressiooni müraksning kombineerituna mittelineaarse vastusega, arvatakse see olevat tähtsaks faktoriksbistabiilsuse saavutamisel.Müra jaotatakse kaheks: sisemine ja väline. Eksperimentaalselt on võimalik seda müra vaadeldakasutades reporteritena erinevaid florestseeruvaid valke. Sisemine müra tekib samas rakusolevate sama geeni erinevate reporterite vahel ja on põhjustatud geeniekspressioonil aset leidvatestohhastiliste protsesside poolt (transkriptsiooni ja translatsiooni protsessid). Väline müramõjutab ühes rakus asuvaid sama geeni erinevaid reportereid ühesuguselt, aga tekitab erinevusikahe erineva raku geeniekspressioonis. Välist müra põhjustavad geeniekspressiooni mõjutavatefaktorite erinev kontsentratsioon ja aktiivsus rakuti ning kohaliku keskkonna varieeruvus (Raserja O'Shea, 2005). Kasutades mudelorganismidena E. colit (Elowitz jt., 2002; Swain jt., 2002) jaSaccharomyces cerevisiaed (Raser ja O´Shea, 2004) leiti, et fenotüübilise varieeruvusetekkimisse panustavad nii sisemine kui ka välimine müra. Jälgides mikroskoobiga reporteriteekspressiooni ajas näidati, et sisemise müra fluktuatsioonid toimuvad pidevalt ja kiiresti, agavälimine müra tekib üle pikemate ajaperioodide (Rosenfeld jt., 2005). Sellest järeldub, et kiirestitoimivad regulatsioonisüsteemid (nagu positiivne autoregulatsioon) võivad olla müraletundlikumad. Tuginedes matemaatilistele geeniekspressiooni modelleeringutele, ennustati, etmüra on palju rohkem mõjutatud translatsioonist kui transkriptsioonist (Thattai ja vanOudenaarden, 2001). Kasutades B. subtilises valgu tootmise reporterina GFP-d, leiti sellele kakinnitust (Ozbudak jt., 2002). Uuring näitas, et müra B. subtilises suurenes peamiselttranslatsiooni efektiivsuse parandamisel. Samas oli eukarüootses organismis Saccharomycescerevisiae tehtud sarnases uuringus müra tekitamisel oluline roll ka transkriptsiooni tõhususel(Blake jt., 2003). Autorite arvates võib selle põhjuseks olla transkriptsiooni reinitsiatsioon,protsess, mis arvatakse toimuvat ainult eukarüootides.Müra tekkimisel on tähtsal kohal ka nii öelda lõpliku numbri efekt. Selle hüpoteesi järgi on müraolulisem protsessides, kus osaleb limiteeritud hulk molekule. Seda on näidatudeksperementaalselt mitmes mitmes fluoresents-reporter uuringus (Elowitz jt., 2002; Ozbudak jt.,2002; Swain jt., 2002). Kuna transkriptsioonifaktoreid sünteesitakse tihti väikses koguses, onantud järeldus bistabiilsuse jaoks oluline.9

Hoolimata oma stohhastilisest päritolust on müra siiski mitme mehhanismiga kontrollitav. Müraon paljudel juhtudel soovimatu protsess. Näiteks võib müra geneetilistes ja metaboolsetes radadesmõjuda liigi kohasusele laastavalt (Barkai ja Leibler, 2000; Paulsson, 2004; Rao jt., 2002; Vilarjt., 2002). Seepärast oleks loogiline oletada, et tähtsamates regulatoorsetes radades on müra paljuvähem kui vähemtähtsates süsteemides. Saccharomyces cerevisiae peal läbi viidud uuringusnäidati, et tõepoolest tekib esmatähtsate geenide ekspressioonis vähem müra kui enamiku teistegeenide omas (Fraser jt., 2004). Samas võib müra rakkudele ka kasulik olla: seda võidaksevõimendada mõne eelpool mainitud mehhanismi abil ja seeläbi kasutada ära bistabiilsusetekitamiseks (Ferrell, 2002; Hasty jt., 2000). Toetudes nendele faktidele ja mutantide uuringule,on välja pakutud, et müra on evolutsiooniliselt suunatav fenomen (Fraser jt., 2004). Müra hulgakontrolli all hoidmiseks on mitmeid võimalusi. Toetudes lõpliku numbri efektile, on võimalikmingi rakusisese raja molekulide kontsentratsiooni suurendamisega vähendada müra mõjuprotsessile. See strateegia on rakkudele kulukas ja seetõttu kasutatakse tihti teisi mehhanisme(Rao jt., 2002). Üks levinuimaid müraleevendavaid mehhanisme on negatiivne tagasiside(Heinrich ja Schuster, 1998; Rao jt., 2002; Smolen jt., 2000). Komponent mõjutab negatiivseltiseenese transkriptsiooni ja mõjutab sellega tugevalt fluktuatsioone enda produktsioonis. Onnäidatud, et E. coli koduhoidja funktsioonides domineerib negatiivne tagasiside (Thieffry jt.,1998). Bistabiilsuse seisukohalt on oluline protsess hüsterees (Ninfa ja Mayo, 2004). Näiteks onhüsterees vastutav viburite rotatsiooni suuna juhusliku muutumise vähendamiseks kemotaksisel(Bren ja Eisenbach, 2001). Bistabiilsuse seisukohalt on veel olulised ka avastused, et pikemadsignaaliülekande kaskaadid võivad müra võimendada ja ülesvoolu asuvad regulatoorsedsündmused võivad antud geeniekrspressiooni varieeruvusele suuremat mõju avaldada kui sellegeeni sisemine müra otseselt ise (Hooshangi jt., 2005; Isaacs jt., 2003; Pedraza ja vanOudenaarden, 2005).1.1.4. PersistoridPersistorid on paljudele antibiootikumidele tolerantsed rakud bakteripopulatsioonis ja neid onleitud kõigist siiani põhjalikult uuritud populatsioonidest (Lewis, 2001). Persistorid polemutandid, vaid metsiktüübi fenotüübilised variandid, mis reinnokuleerimisel toodavad sarnasetolerantsusega kultuuri (Bigger, 1944; Keren jt., 2004; Wiuff jt., 2005). E. colis püsib persistoritearv varajases eksponentsiaalses faasis konstantsena ning hilises eksponentsiaalses faasis javarajases statsionaarses faasis toimub selle märgatav suurenemine (Wiuff jt., 2005). Hoides10

aktereid eksponentsiaalses faasis, neid pidevalt uude söötmesse lahjendades, saavutati täielikpersistorite kadumine (Wiuff jt., 2005). Kasutades mikrofluiidika seadet näidati, et persistorid onväike mittekasvav osa bakteripopulatsioonist, mis eksisteerib seal juba enne antibiootikumidelisamist (Pedersen jt., 2002).Omadus olla tolerantne antibiootikumidele on eriti oluline bakterite biofilmide ellujäämisel(Costerton jt., 1999; Lewis, 2001; Xu jt., 2000). Biofilmid formeeruvad kui bakterirakudkinnituvad mingile pinnale ja kasvavad eksopolümeersesse maatriksisse kapseldunud massiks(Costerton jt., 1999). Biofilmid on vastutavad umbes 65% kõigi läänes inimestel esinevateinfektsioonide eest (Costerton jt., 2003). Nende seas on kateetrite, ortopeediliste seadmete,südameklappide, kuseteede ja tsüstilise fibroosi haigete kopsude infektsioonid (Parsek ja Singh,2003). Enamus patogeene (kui mitte kõik) suudavad biofilme moodustada. Kõige tuntumadbiofilme moodustavad organismid on ilmselt tsüstilise fibroosi haigetel ravimatut infektsioonipõhjustav Pseudomonas aeroginosa (Singh, 2000) ja püsikateetri seadmetel infektsioonepõhjustavad Staphylococcus aureus ning Staphylococcus epidermidis (Mack, 2004). Biofilmidalluvad antibiootikumidega ravile halvasti. Samas on nendest biofilmidest eraldatud rakudenamasti antibiootikumide tundlikud. Tähtis on fakt, et biofilmid ei kasva kõrgendatudantibiootikumide kontsentratsioonil ja seetõttu võib oletada, et neil ei ole võrreldes planktilisterakkudega suuremat resistentsust (Lewis, 2001). Biofilmide tolerantsus ravimitele on olnud üksmikrobioloogia raskesti lahendatavamaid probleeme, kuid lihtne bakteritsiidsuse määramiseeksperiment andis ootamatult selle mõistatuse kohta tähtsat infot (Brooun jt., 2000; Lewis, 2001;Spoering ja Lewis, 2001). Enamus biofilmi rakke on väga tundlikud bakteritsiidsetele ühenditelenagu fluorokinoloon tüüpi antibiootikumid ja metalli oksüaniaoonid, mis suudavad tappa niikiiresti kasvavaid kui ka aeglaselt jagunevaid ning mitte kasvavaid rakke (Harrison, 2005;Harrison jt., 2005; Spoering ja Lewis, 2001). See on oluline kuna suur osa biofilmi rakkejagunevad ilmselt aeglaselt või on statsionaarses faasis. Eksperimendis avastati väike rakkudealampopulatsioon, mis jäi ellu sõltumata antibiootikumide kontsentratsioonist (persistorid).Ellujäävate persistorite arv oli kõige suurem statsionaarses faasis. Tundub, et in vitro tingimusteson statsionaarne kultuur antibiootikumidele tolerantsem kui biofilm. In vivo on olukord ilmseltvastupidine. Antibiootikumid tapavad enamiku biofilmi ja planktilise rakke, jättes ellupersistorid. Immuunsüsteem suudab ellujäänud mittekasvavad planktilised prokarüoodid tappa.Biofilmide eksopolümeerne maatriks kaitseb aga baktereid immuunsüsteemi eest (Jesaitis, 2003;11

Leid jt., 2002; Vuong, 2004) ja biofilmis asuvad persistorid suudavad üle elada niiantibiootikumid kui ka immuunsüsteemi rünnaku. Kui antibiootikumide kontsentratsioonväheneb, taastavad persistorid biofilmi populatsiooni ja hakatakse uuesti planktilisi rakke tootmaning tekib uus ravimitele tundlik biofilmi infektsioon (Lewis, 2001).Persistorite molekulaarsete mehhanismide kohta pole palju teada. Enamus teavet geneetilisteefektide mõjust persistoritele tuleb E. coli hipBA operonis asuvate hipA alleelide uuringutest(Black jt., 1991; Black jt., 1994; Moyed ja Bertrand, 1983; Moyed, 1986; Scherrer ja Moyed,1988). Bakterite arv, kes suutsid ampitsiliiniga töötluse üleelada, kasvas kahe punktmutatsioonigamutandil hipA7 metsiktüübiga võrreldes 1000 korda (Korch jt., 2003). HipBA-st ja teistesttoksiin-antitoksiin süsteemidest tuleb põhjalikum ülevaade toksiin-antitoksiin süsteemide osas.1.2. Toksiin-antitoksiin süsteemid1.2.1. Üldine ülevaadeProkarüootne toksiin-antitoksiin (TA) lookus koosneb kahest geenist, mis asuvad metaboolseltstabiilset toksiini ja ebastabiilset antitoksiini kodeerivas operonis. Antitoksiin neutraliseerib tallevastava toksiini. TA süsteemid jaotatakse sõltuvalt antitoksiini olemusele kaheks (toksiin on alativalk). I tüüpi süsteemi antitoksiin on väike RNA, mis on komplementaarne toksiini mRNA-ga.Tüüp I antitoksiin reguleerib toksiini ekspressiooni inhibeerides selle translatsiooni. Tüüp Itoksiinid on väikesed hüdrofoobsed valgud, mis kahjustavad bakteri membraane. Tüüp IIsüsteemides on antitoksiin väike ebastabiilne valk, mis takistab toksiini moodustades temagatiheda kompleksi. Selles töös keskendutakse tüüp II TA süsteemidele. Kõikidel teadaolevatel IItüüpi TA süsteemidel autoreguleerib antitoksiin TA operoni transkriptsiooni seondudes N-terminaalses otsas asuvate motiividega (Salmon jt., 1994; Santos-Sierra jt., 2002; Smith jaMagnuson, 2004) ühele või mitmele operaatorile ja represseerib sellega transkriptsiooni (Davisjt., 1992; Eberl jt., 1992; Gotfredsen ja Gerdes, 1998; Magnuson jt., 1996; Marianovsky jt., 2001;Zhang jt., 2003). Toksiin on transkriptsiooni korepressor: TA kompleksid seonduvadoperaatoritele paremini kui antitoksiin üksi ja represseerivad transkriptsiooni efektiivsemalt(Gotfredsen ja Gerdes, 1998; Magnuson ja Yarmolinsky, 1998; Marianovsky jt., 2001; Zhang jt.,2003). Seetõttu on stabiilse rakkude kasvu juures transkriptsioon TA operonilt tugevaltrepresseeritud.12

TA süsteem võib moodustada bistabiilse lüliti. Näiteks hipBA süsteemi korral, kus HipB onantitoksiin, mis antagoniseerib toksiini HipA tegevust ja samas on see ka hipBA operonitranskriptsiooniliseks repressoriks ning antitoksiin on võrreldes toksiiniga ebastabiilne. HipAinhibeerib translatsiooni. Stohhastiline antitoksiini hulga vähenemine või toksiini hulgasuurenemine rakus viib translatsiooni aeglustumisele, mis vähendab hipBA operonirepresseerivate produktide hulka ja suurendab sellega transkriptsiooni. Valkude erinevastabiilsuse tõttu kasvab ebavõrdsus toksiini ja antitoksiini akkumulatsiooni vahel. Tulemuseks onkasvu arest: lüliti persistor olekusse. Seega oleks raku persistor olekusse lülitumise määr vastavtõenäosusega, et toksiini ja antitoksiini suhe ületab läve väärtuse (Dubnau. D ja Losick. R, 2006).TA süsteemid avastati algselt kui plasmiidide ellujäämist suurendavad üksused, miselimineerivad rakud, kes ei pärinud rakujagunemisel antud plasmiidi (Gerdes jt., 1986; Jaffe jt.,1985). See postsegregatsioonile tapmismehhanism toimib tänu toksiini ja antitoksiini erinevalestabiilsusele (Tsuchimoto jt., 1992; Van Melderen jt., 1994). Ilma plasimiidita tütarrakus vähenebpidevalt ebastabiilse antitoksiini hulk ning selle tulemusena vabaneb stabiilne toksiin, mis viibbakteri hukkumisele.Põhjalikud genoomi analüüsid on näidanud TA süsteemide jaotumises suurt mitmekesisust(Anantharaman ja Aravind, 2003; Pandey ja Gerdes, 2005; Sevin ja Barloy-Hubler, 2007).Mõned genoomid, nagu näiteks bakteritel Nitrosomonas europeae, Sinorhizobium meliloti jaMycobacterium bovis, sisaldavad üle 50 TA süsteemi. Samas mõnedel teistel prokarüootidel,nagu Rickettsia prowazeki, Campylobacter jejuni ja B. subtilis, on leitud väga vähe TA süsteemevõi need puuduvad üldse. Mingit korrelatsiooni bakterite elustiili, nende hõimkonna, kasvukiiruseja TA süsteemide hulga vahel ei leitud (Sevin ja Barloy-Hubler, 2007).Mõned kromosomaalsed TA süsteemid võivad olla integreerunud peremehe regulatoorsetessesüsteemidesse ja annavad sellega peremeesrakule või populatsioonile mõne uue kasulikeomaduse. On välja pakutud mitmeid süsteeme mille abil TA süsteemid bakteritele kasulikudvõivad olla. Programmeeritud rakusurma mudeli järgi tapetakse stressirikkas keskonnas MazFtoksiini abil 95% rakupopulatsioonist, mis varustab ellujäänud bakteripopulatsiooni toitainetega(Engelberg-Kulka jt., 2006). Kasvumodulatsiooni mudel põhineb E. coli relBE, mazEF ja chpBKsüsteemide uurimistulemustel (Christensen, 2003; Christensen jt., 2001). Selle mudeli põhiline13

seisukoht on, et aminohappenälja tingimustes inhibeeritakse bakteri kasv (prokarüoot jääb ellu).Persistorite mudelist oli juttu eespool.Välja on pakutud ka mudeleid, kus TA süsteemid aitavad peremeesorganismi temaregulatoorsetest süsteemidest osa võtmata. Sõltuvuse vastase mudeli kohaselt võivadkromosomaalsed TA süsteemid aidata enda peremeestel toime tulla plasmiidides asuvate TAsüsteemide põhjustatud postsegregatsioonilise raku tapmisega (Saavedra jt., 2008).Stabilisatsiooni mudeli järgi aitavad TA süsteemid ära hoida teiste, nendega samas superintegronisasuvate raku jaoks ohverdatavate, kuid kasu toovate geenide (näiteks antibiootikumideresistentsusgeenide) deletsioone (Rowe-Magnus jt., 2003).1.2.2. Toksiin-antitoksiin süsteemide jaotusTüüp II antitoksiinid jaotuvad hetkel aminohapete homoloogiale tuginedes üheksasse perekonda,millest kaheksa on kahekomponentsed ja üks on kolmekomponentne (Tabel 1.). Kõigi üheksaperekonna esindajaid on leitud nii plasmiididest kui ka kromosoomidest (Gerdes, 2000; Pandey jaGerdes, 2005). Kuna toksilisus on ebamäärane parameeter ja paljude valkude üleekspressioon onrakkude kasvule kahjulik, tuleb olla eriti hoolikas mingite valgupaaride liigitamisel TAsüsteemideks. Näiteks replikatsioonifaktori DnaC ületootmine on rakule toksiline kui temapartnervalku DnaB-d samuti samal ajal üle ei toodeta. See näitab, et DnaC ja DnaB suhe on tähtisoptimaalse replikatsiooni saavutamiseks ja DnaC poolse inhibitsiooni vältimiseks (Allen jaKornberg, 1991). Kuna need valgud peavad toksilise efekti saavutamiseks ületoodetud olema janende geenidel puudub homoloogia teiste TA geenidega, siis selliseid valgupaare ei loeta toksiinantitoksiinsüsteemideks.Tabel 1. TA perekonnad ja nende mõjutatavad protsessid. Täiendatud (Gerdes, 2005; Van Melderen,2009).TAperekondAntitoksiin Toksiin Toksiini sihtmärk Aktiivsus Mõjutatavrakuprotsessccd CcdA CcdB DNA güraas Tekitab kaksikahelalisi Replikatsioonkatkeid DNA-srelBE RelB RelE Transleeriv ribosoom Indutseerib mRNA TranslatsioonlõikamistparDE ParD ParE DNA güraas Tekitab kaksikahelalisi Replikatsioon14

katkeid DNA-shigBA HigA HigB Transleeriv ribosoom mRNA lõikamine TranslatsioonmazEF§ MazE MazF RNAd Endoribonukleaas Translatsioonphd/doc Phd Doc Transleeriv ribosoom Indutseerib mRNAlõikamistTranslatsioonvapBC VapB VapC RNAd Endoribonukleaas teadmataω-ε-ζ ε ζ teadmata fosfotransferaas teadmatahipBA HipB HipA EF-Tu proteiinikinaas translatsioon15

2. Eksperementaalosa2.1. Materjal ja metoodika2.1.1. Bakteritüved ja plasmiididKatsetes kasutati tabelis 2. kirjeldatud E. coli tüvesid ning tabelis 3. kirjeldatud plasmiide.Tabel 2. Kasutatavad bakteritüved. Tüvedel, mis pärinesid Yale ülikooli E. coli kollektsioonist (CGSC) on viitenamärgitud nende kood antud asutuses.E. coli tüvi genotüüp viideHM22BW25113dapA zde-264: :Tn10 hipA7F-, ∆(araD-araB)567, ∆lacZ4787(::rrnB-3), &lambda-,rph-1, ∆(rhaD-rhaB)568, hsdR514(Moyed jaBertrand, 1983)(Datsenko jaWanner, 2000)BW25113∆relBEBW23473PS266PS265KJ173JS10GM36F-, ∆(araD-araB)567, ∆lacZ4787(::rrnB-3), &lambda-, BW25113 milleltrph-1, ∆(rhaD-rhaB)568, hsdR514, ∆relBEeemaldatud relBE.F-, ∆(argF-lac)169, ∆uidA3::pir+, recA1, rpoS396(Am)?,(Haldimann jaendA9(del-ins)::FRT?, rph-1, hsdR514, rob-1, creC510Wanner, 2001)F-, [araD139]B/r, ∆(argF-lac)169, phoR9999, &lambda-,flhD5301, ∆(fruK-yeiR)725(fruA25), relA1, rpsL150(strR), rbsR22,ijRK498::Tn5, secE15(Cs) CGSC# 7144F-, [araD139]B/r, ∆(argF-lac)169, phoR9999, &lambda-,flhD5301, ∆(fruK-yeiR)725(fruA25), relA1, rpsL150(strR), rbsR22,zijRK498::Tn5, secE501(Cs) CGSC# 7143F-, ∆(araA-leu)7697, [araD139]B/r, ∆(codB-lacI)3, phoR82, zaj-2085::Tn10, secD29(Cs), galK16, galE15(GalS), &lambda-, e14-,relA1, rpsL150(strR), spoT1, mcrB1? CGSC# 7145F-, araC14, leuB6(Am), secA206(aziR), fhuA23, proA180,lacZ36, tsx-67, purE42, glnV44(AS), &lambda-, trpE38, lysA23,rpsL109(strR), ftsX2000(Cs), xylA5, mtl-1, metE70, thi-1 CGSC# 6480F-, thr-1, leuB6(Am), fhuA2, pro-33, lacY1, dnaX36(ts),glnV44(AS), gal-6, &lambda-, hisG1(Fs), rfbC1, galP63, xyl-7,mtlA2, ∆argH1, rplL9(L?), thi-1 CGSC# 6861HC123 Hfr(PO2A), fhuA22, ompF627(T2R), relA1, dnaN159(ts), metB1 CGSC# 6844Ax655F-, thr-1, araC14, leuB6(Am), ftsI2158(ts), ∆(gpt-proA)62, lacY1,tsx-33, qsr'-0, glnV44(AS), galK2(Oc), &lambda-, Rac-0,hisG4(Oc), rfbC1, mgl-50?, rpsL31(strR), kdgK51, xylA5, mtl-1,argE3(Oc), thi-1 CGSC# 6888KY1429F-, [araD139]B/r, ∆(argF-lac)169, &lambda-, flhD5301, ∆(fruKyeiR)725(fruA25),relA1, rpsL150(strR), zhh-50::Tn10,rpoH606(ts), rbsR22, ∆(fimB-fimE)632(::IS1), deoC1 CGSC# 6934CM5255E177NH4920F-, lacZ53(Am), &lambda-, thyA36, IN(rrnD-rrnE)1,rpsL151(strR), zig-1863::Tn10, polA4113(ts), deoC3 CGSC# 6546F-, thr-1, leuB6(Am), fhuA21, lacY1, glnV44(AS), &lambda-,rfbC1, thyA6, rpsL67(strR), glpR101?, dnaA177(ts), thi-1, deoC1 CGSC# 5029F-, thr-1, araC14?, leuB6(Am), ∆(gpt-proA)62, lacY1, tsx-33,glnV44(AS)?, galK2(Oc), &lambda-, hisG4(Oc), recA44(ts),rpsL31(strR), xylA5, mtl-1?, argE3(Oc), thi-1, deoB16 CGSC# 504116

Tabel 3. Kasutatud plasmiidid.plasmiid kirjeldusekspresseeritavtoksiin/valk induktor viidepKP3035 pBAD33::relE RelE arabinoos (Pedersen jt., 2002)pSC3326 pBAD33::chpAK MazF arabinoos (Pedersen jt., 2002)pBAD-YafQ pBAD30:: yafQ YafQ arabinoos (Motiejunaite jt., 2007)pTX3 pBAD33:: mqsR MqsR arabinoos (Kasari jt.)pTOX-ccdB pBAD33:: ccdB CcdB arabinoos Kaldalu N., avaldamatapTOX-hipA pBAD33:: hipA HipA arabinoos Kaldalu N., avaldamatapBAD-dnaJ pBAD22::dnaJ DNAJ arabinoos(Vazquez-Laslop jt.,2006)pBAD-pmrC pBAD18::pmrC pMRC arabinoos(Vazquez-Laslop jt.,2006)pET-gfpmut2-AGGAGG pET41a:: gfp GFP IPTG (Vimberg jt., 2007)pET19bAmpR, T7 promootor,multikloneerimissait - - NovagenpAH162 TetR, att (Φ80),multikloneerimissait- - (Haldimann ja Wanner,2001)pAH123 Int Φ80 - - (Haldimann ja Wanner,2001)2.1.2. SöötmedBakterite kasvatamiseks kasutati Lurian-Bertani (LB) söödet, Super Optimal Broth (SOB) söödet(Sambrook ja Russell, 2001) ning AB minimaal-söödet (Clark ja Maaløe, 1967). See sööde onväljasadenevatest sooladest vaba ja aitab vältida ka seriinhüdroksamaadi (SHT) väljasadenemist.A osa: 2.0 g (NH 4 )2SO 46.0 g Na 2 HPO 43.0 g KH 2 PO 43.0g NaCl0.011 g Na 2 SO 4Need soolad lahustatakse 200 ml Milli-Q vees.B osa: 0.2 g MgCl 20.010 g CaCl 20.0005g FeCl 3 x7H 2 ONeed soolad lahustatakse 200 ml Milli-Q vees.Lahused autoklaavitakse ja sööde segatakse kokku vahetult enne kasutamist: lahus A valatakselahuse B sisse ja nende suhe söötmes on vastavalt 1:4. Söötmele lisati alati süsiniku allikaksglükoosi nii, et selle lõplik sisaldus oleks 0,2%.17

Söötmetele oli sõltuvalt tüvest plasmiidi selektiivsuse tagamiseks lisatud, kas kanamütsiin (Kan)lõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml, CAM lõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml, või ampitsilliini(Amp) lõppkontsentratsiooniga 100 µg/ml. Osad tüved vajasid kasvamiseks ka tümiinilõppkontsentratsiooniga 50 µg/ml või DAPi (diaminopimeelhape) lõppkontsentratsiooniga 75µg/ml.2.1.3. TransformatsioonBakterite transformatsiooniks kompetentseks tegemiseks ja plasmiidide bakteritessetransformeerimiseks kasutati Douglas Hanahani kirjeldatud metoodikat (Hanahan, 1983). Rakudsulatati jääl ning neile lisati plasmiidi ja lasti jääl 30 min seista. Sellele järgnes kuumašokk 1minut ja 30 sekundit temperatuuril 42°C ja kiire jahutamine jääl. Lisati 1 ml LB söödet ninginkubeeriti tund 37°C juures. Kultuur plaaditi tardsöötmele.2.1.4. ElektroporatsioonBakterid külvati üleöö tardsöötmele 37°C juurde kasvama. Kõik elektroporatsioonil kasutatudlahused ja bakterid hoiti jääl. Hommikul lisati 1 ml 10% glütserooli lahusele Milli-Q veeskülvinõela otsa täis bakterikultuuri. Rakke pesti 3x 10% glütserooliga, tsentrifuugides neid üksminut 13500 rpm. Rakud suspendeeriti 40 µl 10% glütseroolis ja lisati plasmiidi. Bakteri japlasmiidi lahust elektroporeeriti kasutades Bio-Rad GenePulser Xcell-i. Elektroporatsioonilkasutati režiimi, kus elektroodide vahe oli 2 mm, mahtuvus 25 µF ning voolutugevus 2,5 kV.Pärast elektroporeerimist lisati segu 1 ml LB vedelsöötmesse ja inkubeeriti 1h 37°C juures.Rakususpensioon plaaditi ja inkubeeriti üleöö.2.1.5. DNA eraldamine ja kloneeriminePlasmiidi eraldamiseks transformeeriti see kompetentsetesse NOVA-XG rakkudesse. Rakkekasvatati üleöö 37°C juures LB vedelsöötmes ning plasmiidi eraldamiseks kasutati Invisorb SpinPlasmid Mini Two Kiti.GFP-d sünteesiva geeni viimine plasmiidi pAH162 teostati kahes etapis. Kloneerimiseks kasutatistandartset metoodikat. Kõik kasutatavad ensüümid ja puhvrid pärinesid firmalt Fermentas. Kõikpuhvrid olid reaktsioonisegus ühekordsed.18

Kloneerimise esimesel etapil viidi plasmiidi pET19b GFP-d sünteesiv geen, mis pärinesplasmiidist pET-GFPmut2-st. Mõlemaid plasmiide lõigati algul ensüümiga PaeI puhvris B jainkubeeriti 1 tund 37°C juures. Siis eraldati plasmiidid reaktsioonisegust kasutades MSB® SpinPCRapace Kiti ning lõigati R puhvris ensüümiga XhoI. Plasmiidi pET19b inkubeeriti 1 h 37°Cjuures ja siis lisati reaktsioonisegule SAPi (Shrimp Alkaline Phosphatase), et vältidalineariseeritud vektorplasmiidi retsirkulariseerumist. Plasmiidi pET-GFPmut2 inkubeeriti 2 h37°C juures. Restriktsiooni kontrolliti 1% preparatiivsel agaroosgeelil. Geelist eraldati insert javektor kasutades Invisorb® Spin DNA Extraction Kiti. Insert ligeeriti pET19b vektorissekasutades T4 ligaasi, T4 puhvris. Ligatsioon kestis 16 h 10°C juures.Kloneerimise teisel etapil viidi GFP-d sünteesiv geen pET19-GFP plasmiidist pAH162 plasmiidi.pAH162 töödeldi 1 h temperatuuril 37°C ensüümiga SmaI Tango puhvris ning siis 1 h SAPigasamuti 37°C juures. Plasmiidi pET19-GFP lõigati 1 h temperatuuril 37°C Tango puhvrisrestriktaasiga SspI ning siis 1 h temperatuuril 37°C Tango puhvris ensüümiga BspI. Ligeeriminetoimus sama skeemi järgi, mis esimesel kloneerimisel. Plasmiid transformeeriti E. coli tüvesseBW23473.Konstrukte kontrolliti GFP ekspressiooni järgi voolutsütomeetril BD LSR II.2.1.6. Plasmiidi integreerimine bakteri genoomi.Plasmiidi kromosoomi integreerimiseks kasutati kasutati Andreas Haldimanni ja Barry L.Wanneri kirjeldatud metoodikat (Haldimann ja Wanner, 2001). Helperplasmiid pAH123transformeeriti E. coli tüvesse BW25113.Helperplasmiidi sisaldavasse tüvesse elektroporeeriti kromosoomi integreeritav plasmiidpAH162. Tüve kasvatati üleöö 3 ml LB söötmes temepratuuril 30°C ning järgmisel päeval tehtikultuurist 200x lahjendus 10 ml SOB-se. Kasvatamine toimus 200 ml kolvis. Kultuur kasvatatitiheduseni 0,6 OD600 juures ning rakud tsentrifuugiti põhja kasutades Sigma 4k 15c tsentrifuugining rootorit 12170 pööretel 5000 5 min. Rakud resusupendeeriti 1 ml jahutatud 10% glütseroolilahuses Milli-Q vees. Neid tsentrifuugiti 1 min 13 500 rpm ning resuspendeeriti uuesti 100 µl10% glütseroolis. 50 µl lahusele lisati plasmiidi ning nende segu pipeteeriti kuivaelektroporatsiooni küvetti ja elektroporeeriti kasutades Bio-Rad GenePulser Xcell-i.19

Elektroporatsioonil kasutati režiimi, kus elektroodide vahe oli 2 mm, mahtuvus 25 µF ningvoolutugevus oli 2,5 kV. Pärast elektroporeerimist lisati segu 1 ml SOB vedelsöötmesse, missisaldab 0,2% glükoosi ja inkubeeriti 1 h 37°C juures ning siis veel pool tundi 42°C juures.Elektroporatsiooni produkt plaaditi LB Tet (tetratsükliin) 8 µg/ml tassile ja inkubeeriti üleöö37°C juures.Konstrukte kontrolliti GFP ekspressiooni järgi voolutsütomeetril BD LSR II.2.1.7. HipA külmatundliku tüve HM22 kasvu uurimine.Rakke kasvatati üleöö 3 ml LB 37°C juures. Üleöökultuurist tehti 100x lahjendused 3 ml LBsöötmesse. Peale 2 h 37°C juures kasvatamist lisati IPTG (isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiid)lõppkontsentratsiooniga 1 mM ja inkubeeriti veel 1,5 h samal temperatuuril. Võeti 1 ml kultuurining tsentrifuugiti 2 minutit 10000 rpm toatemperatuuril. Rakke pesti 1 ml LB-ga (jälletsentrifuugiti 2 min 10000 rpm toatemperatuuril). Bakterid resuspendeeriti 1 ml LB ja see lisati20 ml LB-le. Rakke kasvatati 2 h temeratuuril 30°C ja siis 3 h temperatuuril 37°C. Alatesbakterite 30°C juurde viimisest võeti iga poole tunni tagant proove. Samuti võeti iga poole tunnitagant 1 ml kultuuri spektrofotomeetril Heλiosβ OD600 juures kasvu jälgimiseks. Katse tehtikolmes korduses.2.1.8. Külma-ja kuumatundlike E.coli mutantide kasvu uurimine.Üheteistkümnesse kuuma-või külmatundlikusse E. coli tüvesse elektroporeeriti punktis 2.1.4.kirjeldatud metoodika alusel pET-gfpmut2 plasmiid. Osasid tüvesid polnud võimalikelektroporeerida ja neisse viidi plasmiid transformatsiooniga. Bakteritüvede PS265, PS266 jaM54 transforamtsioon viidi läbi punktis 2.1.3. kirjeldatud protokolli järgi.Bakterite kasvu uurisimiseks kasutati punktis 2.1.7. toodud protokolli mõningate erinevustega.Kuumatundlikke tüvesid hoiti tund 42°C juures ja külmatundlikke tund 30°C juures ja siisinkubeeriti neid temperatuuril 37°C . Proove võeti vastavalt 0 min, 60 min, 150 min ja 240 minajapunktides, kus nullajapunktiks oli bakterite inkubeerimise alustamine, kas 30 või 42°C juures.20

2.1.9. BW25113 ja BW25113 ∆relBE tüvede statsionaarsest faasist väljumisevõrdlemine.Tüvedest kasutati BW25113 ja tema ∆relBE versiooni, mis oli varem Tensoni laboris valmistehtud. Rakke kasvati autoklaavimata, läbi steriilse 0,2 µm filtri filtreeritud LB vedelsöötmes,millele oli pET-GFP mut2 selektsiooniks lisatud kanamütsiin lõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml.Statsionaarse faasi kultuuri kasvatamiseks inokuleeriti 3 ml LB söötmesse 100 µl DMSOsäilituskultuuri ja inkubeeriti seda 37°C juures. Peale 3 h kasvatamist lisati IPTGlõppkontsentratsiooniga 1mM.Bakterite väljumist statsionaarsest faasist jälgiti ajapunktides 9, 18, 31, 40, 55 ja 64 h. Sobivasajapunktis võeti 200 µl statatsionaarse faasi kultuuri ja sadestati rakud tsentrifuugides 2 min10000 rpm toatemperatuuril. Rakud resuspendeeriti 200 µl vedelsöötmes ja tehtiresuspendeeritud kultuurist 5 ml vedelsöötmesse 100x lahjendus. Rakke inkubeeriti 37°C juures.Proove võeti iga 30 min tagant 3 tunni jooksul alates rakkude värskesse söötmesse inkubeerimapanemisest. Katse tehti kolmes korduses.18 tunni ajapunkti vaadeldi ka kasutades statsionaarsest faasist võetud bakterite kasvatamiseksAB söödet, millele olid lisatud kõik aminohapped kontsentratsioonis 100 µg/ml.2.1.10. BW25113 ja BW25113 ∆relBE bakterite käitumise võrdlusaminohappenälja tingimustes.Söötmed. Üleskasvatamiseks säilituskultuurist kasutati LB söödet, millele plasmiidiselektsiooniks oli lisatud kanamütsiin lõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml. Katsete läbiviimiselkasutati AB minimaalsöödet millele oli samuti lisatud plasmiidi seletsiooniks kanamütsiinilõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml.Valiiniga aminohappenälja indutseerimine. Üleöö pandi mõlemad tüved 3 ml LB kasvama.Hommikul tehti 100x lahjendus 3 ml AB minimaalsöötmesse kuhu olid lisatud aminohappedlõppkontsentratsiooniga 50 µg/ml. Kultuure kasvatati 37°C juures 2 tundi ja lisati siis IPTGlõppkontsentratsiooniga 1 mM ning kasvatati samal temperatuuril veel 2 tundi. Siis eraldati 1 mlkultuuri ja tsentrifuugiti 2 minutit 10 000 pöörde juures. Sadet pesti eelsoojendatud ABminimaalsöötmega. Peale pesu resuspendeeriti bakterid 1 ml eelsoojendatud ABminimaalsöötmes ja lisati 14 ml eelsoojendatud minimaalsöötmele. Kultuur inkubeeriti 37°C21

juures ja võeti iga 30 minuti tagant ajapunkte alates bakterite 14 ml söötmele lisamisest. Samutivõeti iga poole tunni tagant 1 ml kultuuri spektrofotomeetril Heλiosβ OD600 juures kasvujälgimiseks. Tund aega pärast inkubeerimist lisati kultuurile valiini lõppkontsentratsiooniga 0,2mg/ml. Peale veel tundi kasvatamist lisati 10 ml eelsoojendatud minimaalsöödet millele olidlisatud kõik teised aminohapped peale valiini kontsentratsiooniga 0,2 mg/ml. Proove võeti veel 3h. Katse tehti kolmes korduses.Aminohappenälja indutseerimine seriinhüdroksamaadiga (SHT).3 ml LB-s kasvatatud üleöökultuurist tehti 100x lahjendus 3 ml AB söötmesse, millele olidlisatud kõik AH-d kontsentratsioonil 100 µg/ml. Kultuuri inkubeeriti 3,5 h 37°C ning lisati GFPinduktsiooniks IPTG lõppkontsentratsiooniga 1 mM. Pärast veel tundi kasvatamist pesti rakudIPTG-st (tsentrifuugiti 2 min 10000 rpm) ja rakud lisati 3 ml kõiki aminohappeid sisaldavasseAB söötmesse, mis sisaldas ka SHT 0,4 mg/ml ning inkubeeriti 1 h 37°C . Rakud tsentrifuugitipõhja (10 min, 5000g, 20C) ja pesti 1x võrdse mahu AB söötmega. Peale pesu resuspendeeritirakud 3 ml AB söötmes, mis sisaldas aminohappeid 100 µg/ml ning kasvatati 3 h loksutil. Proovevõeti iga poole tunni tagant alates SHT lisamisest. Katse tehti kolmes korduses.2.1.11. Toksiinide üleekspressiooni võrdlus E. colis.Toksiini plasmiidid viidi punktis 2.1.3. kirjeldatud transformatsiooni protokolliga punktis 2.1.4.kirjeldatud metoodika alusel konstrueeritud bakteritüvesse.Üleöö LB-s kasvatatud kultuurist tehti 500x lahjendus 3 ml LB + CAM lõppkontsentratsiooniga50 µg/ml ning inkubeeriti 37°C juures. Peale 2 h kasvatamist lisati IPTGlõppkontsenntratsiooniga 1mM ning inkubeeriti veel 2,5 h. Nüüd vahetati sööde välja tehes 10xlahjenduse 5 ml uude söötmesse, mis sisaldas CAM 50 µg/ml ning 0,2 % arabinoosi toksiinisünteesi indutseerimiseks. Peale 1,5 h inkubeerimist vahetati uuesti söödet (seekord ilmalahjenduseta): 5 ml LB, mis sisaldas CAM 50 µg/ml ning 0,2 % glükoosi toksiini sünteesiallasurumuseks. Ajapunkte võeti alates toksiini sünteesi indutseerimisest pooleteise tunni jooksuliga poole tunni tagant ning järgmise 3 tunni jooksul iga tunni järel.2.1.12. Voolutsütomeetriline analüüsBakterite kasvu heterogeensuse analüüs põhines Tensoni laboris väljatöötatud GFP lahjenemisemeetodil (Roostalu jt., 2008).22

Proovid koosnesid 50 µl 30% glütseroolist PBS-is ja 50 µl rakukultuurist (v.a. statsionaatsestfaasist väljumise võrdlemise katses, kus mõlemat komponenti oli 100 µl) ning säilitati -80 Cjuures.Analüüsiks sulatati proovid ning sonikeeriti rakkude kleepumise vältimiseks. Külmutatudproovidest tehti, kas 20 või 40 kordne lahjendus 1x PBSi lõppmahuga 200 µl ning neidanalüülsiti kasutades voolutsütomeetrit BD LSR II. Rakud loendati 50 µl proovist. Lõplikandmete analüüs teostati programmiga FlowJo.2.2. Tulemused ja arutelu2.2.1. Mittejaguneva bakteripopulatsiooni teke peale HipA aktivatsiooni.Bakteritüvi HM22 (hipA7) on külmatundlik tänu mutatsioonidele hipA geenis (Moyed jaBertrand, 1983; Korch jt. 2003). Temperatuuril 37°C kasvab see tüvi normaalselt, kuidtemperatuur 30°C põhjustab kasvu peatumist tänu HipA toksiini aktivatsioonile (Schumacher jt.2009). Katse eesmärgiks oli vaadata, kuidas HipA aktivatsioon mõjutab üksikute bakteritejagunemist, kasutades selleks GFP lahjenemise meetodit (Roostalu jt. 2008). Varem olid NiiloKaldalu poolt tehtud sarnased eksperimendid näidanud jaguneva ja mittejaguneva populatsioonitekkimist vastusena HipA aktivatsioonile.Katses indutseeriti 37°C juures kasvavas HM22 kultuuris GFP süntees. Seejärel viidi rakudinduktorita söötmesse ja hoiti kaks tundi temperatuuril 30°C. Rakkude 30°C juurde asetamine oliühtlasi ka proovide võtmise alguspunkt. Edasi kasvatati rakke 37°C juures ja jätkati proovidekogumist.Bakterite GFP-sisalduse voolutsütomeetriline analüüs näitas, et tekkisid kaks selgelt eristatavatalampopulatsiooni: jagunev ja mittejagunev. Joonised 4. ja 5. illustreerivad bakteripopulatsioonikasvu ja jagunemist. Joonistelt on näha, et osa rakke hakkas jagunema juba 30°C juures ningtemperatuuril 37°C suurenes jagunevate rakkude arv suurel hulgal. Siiski säilis ka pikaajalisemal37°C juures inkubeerimisel hulk mittejagunevaid baktereid.23

Joonis 4. Bakterite jagunemine peale hipA aktivatsiooni. Külmatundliku tüve HM22 (hipA7) GFP-d sisaldavadrakud viidi katse alguses (0 min) kaheks tunniks 30°C juurde, mis pärsib selle tüve kasvu. Seejärel viidi kultuur37°C juurde. Võetud proovide GFP sisaldust ja bakterite arvu analüüsiti voolutsütomeetril. Graafikul on näharakkude üldarv ning rakkude jaotus GFP sisalduse järgi. Rakud, mis sisaldavad suurel hulgal GFP-d pole jagunenudning rakud, milles GFP-d vähe, on GFP jaotumise tõttu jagunevate tütarrakkude vahel võimalik kasvavateksbakteriteks määrata.24

Joonis 5. HM22 kasvu jälgimine ühe raku tasemel GFP lahjenemise abil. Külmatundliku tüve HM22 (hipA7) GFP-dsisaldavad rakud viidi katse alguses (0 min) kaheks tunniks 30°C juurde, mis pärsib selle tüve kasvu. Seejärel viidikultuur 37°C juurde. Rakkude jagunemise jälgimine toimub GFP lahjenemise järgi: mida vähem rakud GFP-dsisaldavad, seda rohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesi induktori eemaldamist läbi teinud. Võetud proovideGFP sisaldust ja bakterite arvu analüüsiti voolutsütomeetril. J tähendab jagunevat populatsiooni ja MJmittejagunevat.2.2.2. Külma-ja kuumatundlike E. coli mutantide kasvu uurimine.Antud katse eesmrägiks oli üksiku raku tasemel vaadata, kas ka teistel külma-võitemperatuuritundlikel mutantidel peale HM22 (hipA7) tekib peale ebasoodsal temperatuurilviibimist jagunevate ja mittejagunevate bakterite populatsioon, kasutades selleks GFPlahjenemise meetodit (Roostalu jt., 2008).Uuriti ühteteistkümmet E. coli külma-võitemperatuuritundliku tüve: PS266 secE(cs), PS265 secE(cs), KJ173 secD(cs), JS10 ftsX(cs),GM36 dnaX(ts), AX655 ftsI(ts) E177 dnaA(ts), NH4920 recA(ts), CM5255 polA(ts), KY1429rpoH(ts), HC123 dnaN(ts) (tabel 2.).25

Katses indutseeriti 37°C juures kasvavas kultuuris GFP süntees. Seejärel viidi rakud induktoritasöötmesse ja hoiti sõltuvalt külma-või kuumatundlikusest tund temperatuuril 30°C või 42°C.Rakkude 30°C või 42°C juurde asetamine oli ühtlasi ka proovide võtmise alguspunktiks. Edasikasvatati rakke 37°C juures ja jätkati proovide kogumist.Bakterite GFP-sisalduse voolutsütomeetriline analüüs näitas, et kõik külmatundlikud tüved jakuumatundlikest tüvedest GM36 dnaX(ts), AX655 ftsI(ts) E177 dnaA(ts) ning NH4920 recA(ts)käitusid kasvamisel ühesuguselt: kõik rakud läksid kasvama ja kahte kasvamise kiiruse järgiselgelt eraldatavat populatsiooni ei täheldatud. Ebasobival temperatuuril oli bakterite kasv vägaaeglane, aga kasvuolude normaliseerumisel hakkasid bakterid kiiremini kasvama. Tüvel AX655ftsI(ts) toimus kohe peale katse algust järsk langus GFP-d sisaldavate partiklite arvus, ningsuurenes väga madala GFP hulgaga partiklite arv. Arvatavasti põhjustas antud asjaolu bakteritelüüsumine katse algul. Seda pole kontrollitud ning vajab täiendavat uurimist. Osad tüved(CM5255 polA(ts), KY1429 rpoH(ts), HC123 dnaN(ts)) moodustasid eeldatavalt filamente:täheldatati nende suurenemist otsehajuvuses ja külghajuvuses, kuid GFP tase rakus jäi samaks.Ka teistes töödes on täheldatud polA ja rpoH kuumatundlike mutantide puhul filamenteerumist(Monk jt., 1973; Raheb jt., 2007). Filamentide uurimist ja määramist voolutsütomeetria abil onkirjeldanud H. J. Wickens ja R. J. Pinney (Wickens jt., 2000). Mikroskoobi all ei ole neid veelvaadeldud. Tulemused on esitatud joonisel 6. ja joonisel 7.. Antud katse tulemustest võibjäreldada, et ebasobiv temperatuur ei tekita kõigis külma-või kuumatundlikes tüvedes kasvuheterogeensust.26

Joonis 6. Külma ja-temperatuuritundlike tüvede kasvu jälgimine üksikute rakkude tasemel GFP lahjenemise abil.GFP-d sisaldavad rakud viidi katse algul (0 min) tunniks ajaks nende kasvu pärsivale temperatuurile: külmatundliketüvede korral 30°C ja kuumatundlike korral 42°C. Seejärel viidi kultuur 37°C juurde. Rakkude jagunemisejälgimine toimus GFP lahjenemise järgi: mida vähem rakud GFP-d sisaldavad, seda rohkem jagunemisi on nad pealeGFP sünteesi induktori eemaldamist läbi teinud. Mustaga on tähistatud nullajapunkt, sinisega 60 min ajapunkt ningoranžiga on tähistatud 150 min ajapunkt. 1. paneelis on külmatundlikud tüved, 2. paneeli kuumatundlikud tüved ning3. paneelis kuumatundlikud tüved, mis moodustasid eeldatavasti filamente (täpsemalt joonis 7.). Mõnelhistogrammil on vasakul näha müra, mida ei õnnestunud geitimisel eemaldada.27

Joonis 7. Eeldatavalt filamente moodustavate kuumatundlike E. coli tüvede ja ühe normaalselt jagunevakuumatundliku tüve dotblotid. GFP-d sisaldavad rakud viidi katse algul (0 min) tunniks ajaks nende kasvu pärsivaletemperatuurile 42°C. Peale seda jätkati kasvatamist 37°C juures. Rakkude jagunemise jälgimine toimus GFPlahjenemise järgi: mida vähem rakud GFP-d sisaldavad, seda rohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesiinduktori eemaldamist läbi teinud..2.2.3. Bakterite jagunemine peale TA toksiinide üleekspressiooni.Kuna HM22 tüves oli toksiini aktivatsioonil täheldatud bakterite kasvus heterogeensuse teke,otsustati üksiku raku tasemel vaadata ka osade teiste toksiinide (RelE, MazF, MqsR, YafQ ja kailma mutatsioonita HipA) üleekspressiooni mõju bakterite kasvule. Vaadeldi ka toksiinide allamitte kuuluvate kasvupärsivate valkude üleekspressiooni mõju kasvu heterogeensusele (samutiüksikute rakkude tasemel). Nendeks valkudeks valiti tšaperon DnaJ ja fosfoetanoolamiini lipiidA-le ülekandev valk PmrC, kuna N. Vázquez-Laslop on leidnud, et vaadeldavate valkudeüleekspressioonil suureneb populatsioonis persistorite arv (Vazquez-Laslop jt., 2006).28

Üleekspressiooni mõju rakkude kasvamisele jälgiti GFP lahjenemise meetodi abil (Roostalu jt.,2008).BW25113 tüve kromosoomi sisestati GFP-d sünteesiv geen. Seejärel sisestati valmistatudrakkudesse viie toksiini ja kahe kõrges kontsentratsioonis raku kasvu pärssivat valkuekspresseerivad plasmiidid. Katses indutseeriti 37°C juures kasvavates kultuurides GFP süntees.Peale 2,5 h kasvatamist eemaldati GFP induktor ning indutseeriti toksiinide (või teiste valkude)süntees. See oli ühtlasi ka proovide võtmise alguspunktiks. Tunni aja pärast eemaldati induktorning jätkati kasvu jälgmist.Bakterite GFP-sisalduse voolutsütomeetriline analüüs näitas, et kõikide toksiinideüleekspressioon põhjustas bakterite kasvu aeglustumist ja mõningate puhul (RelE, YafQ) oli nähaka kaks selgelt eristatavat populatsiooni: üks kiiremini jagunev ja üks aeglasemalt jagunev(Joonis 8. ja Joonis 9.). Samas ei tekkinud kasvu heterogeensust HipA üleekspressiooni korral,mis HM22 tüves madalal temperatuuril aktiveerituna tekitas jaguneva ja mittejagunevapopulatsiooni. Võimalik, et TA süsteemide mõju rakkude kasvu heterogeensusele ontüvespetsiifiline või sõltuvuses keskkonnatingimustest. Selgus, et ka toksiinide alla mittekuuluvate valkude DnaJ-i ja PmrC üleekspressioonil tekkisid kaks kasvu järgi eristatavatpopulatsiooni: jagunev ja mittejagunev (joonise 8. ja joonisel 9.). Antud tulemusi vaadatestundub, et bakterikultuuri kasvus heterogeensuse tekitamine pole omane ainult TA süsteemidele.Joonis 8. Toksiinide ja teiste kasvu pärssivate valkude üleekspressioon mõju raku kasvule vaadelduna ühe rakutasemel GFP lahjenemise abil. GFP-d sisaldavates rakkudes indutseeriti tund aega TA süsteemi toksiinide või mitte29

TA süsteemi valkude sünteesi (0 min). Peale seda valgusünteesi induktor eemaldati ja rakke kasvatati edasi 37°Cjuures. Rakkude jagunemise jälgimine toimus GFP lahjenemise järgi: mida vähem rakud GFP-d sisaldavad, sedarohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesi induktori eemaldamist läbi teinud. Histogrammide kohal on märgitudüleekspresseeritud TA süsteemi toksiini nimi punasega ja TA toksiinide alla mittekuuluva valgu nimi rohelisega. AJigaon tähistatud aeglaselt jagunev, KJ-iga kiiresti jagunev, MJ-iga mitte jagunev ja J-iga jagunev populatsioon.Mustaga on tähistatud 0 min ajapunkt, sinisega 90 min ajapunkt ja oranžiga 150 min ajapunkt.Joonis 9. Toksiinide (märgitud punasega) RelE ja YafQ ning chaperoni (märgitud rohelisega) DnaJ üleekspressioonimõju raku kasvule vaadelduna ühe raku tasemel dotblotina. GFP-d sisaldavates rakkudes indutseeriti tund aega TAsüsteemi toksiinide või mitte TA süsteemi valkude sünteesi (0 min). Peale seda valgusünteesi induktor eemaldati jarakke kasvatati edasi 37°C juures. Rakkude jagunemise jälgimine toimus GFP lahjenemise järgi: mida vähemrakud GFP-d sisaldavad, seda rohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesi induktori eemaldamist läbi teinud. AJigaon tähistatud aeglaselt jagunev, KJ-iga kiiresti jagunev, MJ-iga mitte jagunev ja J-iga jagunev populatsioon.2.2.4. relBE ei mõjuta bakterite jagunemisvõimet statsionaarsest faasistväljudes.Peale statsionaarse faasi bakterite värskesse söötmesse viimist ei hakka kõik bakterid korragakasvama. Suur osa neist jääb mittejegunevaks (Joers jt., 2010; Roostalu jt., 2008). Sellemittejaguneva alampopulatsiooni hulka kuuluvad persistorid. On näidatud, et sellesmittejagunevas alampopulatsioonis on TA geenide, sealhulgas relBE transkriptsioonindutseeritud (viitab toksiinide aktivatsioonile) (Keren jt., 2004; Shah jt., 2006). Katseeesmärgiks oli võrrelda üksikraku tasemel metsiktüübi (MT) ja ∆relBE kasvamahakkamist30

statsionaarsest faasist väljumisel, kasutades selleks GFP lahjenemise meetodit (Roostalu jt.,2008).Katses indutseeriti 37°C juures kasvavastes metsiktüübi (MT) ja ∆relBE kultuuris GFP süntees.Vastaval ajapunktil võeti kultuurist osa rakke ja viidi induktorita värskesse söötmesse. Nendekasvu jälgiti 3 tunni jooksul. Proovide võtmise alguspunktiks oli bakterite värskesse söötmesseviimine. Kokku jälgiti bakterite kasvamahakkamist kuuest statsionaarse faasi ajapunktist: 9, 18,31, 40, 53 ja 64 h. Kõigis ajapunktides kasutati värske söötmena LB-d, aga 18 tunni ajapunktisvaadeldi kasvu ka AB söötmes.Bakterite GFP-sisalduse voolutsütomeetriline analüüs näitas, et katse käigus käitusid mõlemadtüved samamoodi: nende kasvus erinevusi ei täheldatud. LB söötmes läksid esimeses kahesstatsionaarse faasi ajapunktis (9 h ja 18 h) kõik rakud kohe kasvama (Joonis 10.). Järgmiseskahes LB söötme ajapunktis (31 h ja 40 h) hakkasid kasvama ainult osa rakke ning tekkis kakspopulatsiooni: jagunev ning mittejagunev (joonis 10. ja joonis 12.). Jagunevate rakkudekülghajuvus oli suurem kui mittejagunevatel rakkudel. Ilmselt on põhjuseks asjaolu, et kasvamaminnes antud rakud pikenevad. Kahes viimases ajapunktis (53 h ja 64 h) bakterid jälgitud ajajooksul kasvama ei läinud (joonis 11.). AB söötmes 18 tunni ajapunktil oli kasv aeglasem jamõlema tüve puhul tekkis mitu selgelt eristatavat aeglasemalt jagunevate ja kiiremini jagunevaterakkude populatsiooni (Joonis 11.). Tundub, et hoolimata relBE transkriptsiooni suurenemiseststatsionaarse faasi mittejagunevas alampopulatsioonis, ei mõjuta need geenid (vähemalt antudkatsetingimustes) statsionaarsest faasist väljumisel kasvu heterogeensust.31

Joonis 10. ∆relBE ja MT LB söötmes kasvamahakkamine statsionaarsest faasist väljumisel jälgituna ühe rakutasemel GFP lahjenemise abil histogrammidena: statsionaarse faasi ajapunktid 9 h, 18 h, 31 h ja 40 h. Statsionaarsekultuuri vanuse nullajapunktiks loetakse tema kasvamapanekut üleöökultuurist. GFP sünteesi induktori juuresolekulinkubeeriti rakke 37°C juures. Vastaval statsionaarse faasi ajapunktil eemaldati induktor ning rakud külvati värskessesöötmesse, mis oli ühtlasi ka kasvamahakkamise uurimise nullajapunktik. Rakkude jagunemise jälgimine toimusGFP lahjenemise järgi: mida vähem rakud GFP-d sisaldavad, seda rohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesiinduktori eemaldamist läbi teinud. Histogrammidel on mustaga märgitud MT ja punasega ∆relBE. J tähistabjagunevat populatsiooni ja MJ mittejagunevat.32

Joonis 11. . ∆relBE ja MT kasvamahakkamine statsionaarsest faasist väljumisel jälgituna ühe raku tasemel GFPlahjenemise abil histogrammidena: statsionaarse faasi LB söötmes kasvatamise ajapunktid 53 h ja 64 h ning ABsöötmes kasvatamise ajapunkt 18 h. Statsionaarse kultuuri vanuse nullajapunktiks loetakse tema kasvamapanekutüleöökultuurist. GFP sünteesi induktori juuresolekul inkubeeriti rakke 37°C juures. Vastaval statsionaarse faasiajapunktil eemaldati induktor ning rakud külvati värskesse söötmesse, mis oli ühtlasi ka kasvamahakkamise uurimisenullajapunktik. Rakkude jagunemise jälgimine toimus GFP lahjenemise järgi: mida vähem rakud GFP-d sisaldavad,seda rohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesi induktori eemaldamist läbi teinud. Histogrammidel on mustagamärgitud MT ja punasega ∆relBE. J tähistab jagunevat populatsiooni ja MJ mittejagunevat..33

Joonis 12. ∆relBE LB söötmes kasvamahakkamine statsionaarsest faasist väljumisel jälgituna ühe raku tasemel GFPlahjenemise abil dotblotina: statsionaarse faasi ajapunktid 31 h ja 40 h. Statsionaarse kultuuri vanuse nullajapunktiksloetakse tema kasvamapanekut üleöökultuurist. GFP sünteesi induktori juuresolekul inkubeeriti rakke 37°C juures.Vastaval statsionaarse faasi ajapunktil eemaldati induktor ning rakud külvati värskesse söötmesse, mis oli ühtlasi kakasvamahakkamise uurimise nullajapunktiks. Rakkude jagunemise jälgimine toimus GFP lahjenemise järgi: midavähem rakud GFP-d sisaldavad, seda rohkem jagunemisi on nad peale GFP sünteesi induktori eemaldamist läbiteinud. J tähistab jagunevat populatsiooni ja MJ mittejagunevat.2.2.5. relBE ei mõjuta bakterite jagunemist peale aminohappenälga.Katsed näitavad, et relE toksiin aktiveeritkase vastusena aminohappe näljale (Christensen jt.,2001). Nendes tingimustes suureneb ka märgatavalt relBE operoni transkriptsioon. Katseeesmärgiks oli vaadelda üksikraku tasemel relBE TA süsteemi mõju kasvu heterogeensuseleaminohappenälja tingimustes ja aminohappenäljast väljumisel, kasutades selleks GFPlahjenemise meetodit (Roostalu jt., 2008).Katses indutseeriti 37°C juures kasvavates kultuurides GFP süntees. Peale induktori eemaldamisttekitati aminohappenälg, kas valiini või seriinhüdroksamaadiga (SHT). Valiin inhibeeribisoleutsiini sünteesi (Umbarger ja Brown, 1955). SHT lisamine söötmele põhjustab aminohappeseriin nälja. SHT käitub serüül-tRNA süntetaasi konkureeriva inhibiitorina ja takistab sellegaseriin-tRNA laadimist (Tosa ja Pizer, 1971). Mõlema aminohappenälja tekitamise viisi korralhakati proove koguma peale GFP sünteesi induktori eemaldamist.34

Bakterite GFP-sisalduse voolutsütomeetriline analüüs näitas, et katse käigus käitusid mõlemadtüved samamoodi: nende kasvus erinevusi ei täheldatud. Tulemused on näidatud joonisel 13..Valiiniga tekitatud aminohappenälja katses võttis kasvamaminek kauem aega. Siiski läksidlõpuks kõik rakud kasvama ja jagunevat ning mittejagunevat populatsiooni ei tekkinud. SHT-gaindutseeritud aminohappenälja katses läksid samuti kõik rakud peale SHT eemaldamist kasvamaning kasvus heterogeensust ei täheldatud. Tundub, et hoolimata relE toksiini aktiveerimisestaminohappenälja korral, ei põhjusta see bakterite kasvu heterogeensust aminohappenäljastväljumisel.35

Joonis 13. ∆relBE ja MT kasvu võrdlusaminohappenälja tingimustes vaadeldunaühe raku tasemel GFP lahjenemise abil.GFP-d sisaldavates rakkudes indutseeritiaminohappenälg kas valiini või SHT-ga.Valiiniga indutseerimise puhul olinullajapunktiks rakkude lisamineaminohappevabasse AB söötmesse.SHT-ga indutseerimise puhul olinullajapunktiks SHT lisamine söötmele.Rakkude jagunemise jälgimine toimusGFP lahjenemise järgi: mida vähemrakud GFP-d sisaldavad, seda rohkemjagunemisi on nad peale GFP sünteesiinduktori eemaldamist läbi teinud.Histogrammidel on mustaga märgitudMT ja punasega ∆relBE.36

KokkuvõteKäesoleva töö eesmärgiks oli uurida üksikute rakkude tasemel bakterite kasvu sõltuvust TAsüsteemidest, kasutades mudelorganismina E. colit. Rakkude jagunemist jälgiti GFP lahjenemisemeetodi abil (Roostalu jt., 2008).Külmatundliku tüve HM22 (hipA7) uurimisel leiti, et madalal temperatuuril inkubeerimine, mispõhjustab HipA toksiini aktivatsiooni (Moyed ja Bertrand, 1983), tekitab antud bakteritüvesjaguneva ja mittejaguneva populatsiooni. Sellest nähtusest tulenevalt testiti ka teisi külma-võikuumatundlike tüvesid, kuid nende kasvus temperatuurimuutuse tagajärjel heterogeensust eitekkinud. Üksiku raku tasemel otsustati vaadata ka mitmete teiste toksiinide üleekspressioonimõju bakterite kasvule. Lisaks üldisele kasvu aeglustumisele täheldati kahe toksiini (RelE jaYafQ) üleekspressiooni puhul, et tekkis kaks kasvu järgi selgelt eristatavat populatsiooni: kiirestijagunev ja aeglaselt jagunev. Testiti ka teiste ülekspressiooni korral kasvupärsivate valkude(DnaJ ja PmrC) mõju ning leiti et ka nende üleekspressioon põhjustab bakterite kasvusheterogeensust. Sellest võib järeldada, et kasvus heterogeensuse tekitamine pole omane vaid TAsüsteemidele. Kuna relBE TA süsteemi transkriptsioon aktiveeritakse aminohappenäljatingimustes (Christensen jt., 2001) vaadeldi ka relBE mõju aminohappenäljast ja statsionaarsestfaasist väljumisele. Antud katsetes mingit relBE mõju ei täheldatud.37

Toxin-antitoxin systems and heterogeneity of growth inEcherichia coli.SummaryToomas MetsThe pre-existing phenotypic variation in bacterial population is important in coping with theconstantly changing environment. Many forms of stress tolerance (e.g. antibiotics tolerance) havebeen linked to this phenomenon and thus this issue is important for medicine and food industry.Lately there has been increasing evidence about the importance of toxin-antitoxin systems ingenerating heterogeneous populations in bacterial culture. Still, we have much to learn about theconnection between toxin-antitoxin systems and the ability of bacteria to cope with stress.The aim of current thesis was to investigate at a sinlge cell level the relationship between toxinantitoxinsystems and the bacterial growth. For monitoring of the cell growth GFP dilutionmethod was used (Roostalu et.al., 2008). Studying the growth of cold sensitive E. coli strainHM22 (hipA7) (Korch et.al., 2003) it was shown that in the given bacterial strain incubation onlow temperature gives rise to two distinct subpopulations: dividing and non-dividing. Driven bythis phenomenon the growth of other cold or temperature sensitive E. coli strains was studied, butno heterogeneity in growth after transfer to and from the nonpermissive temperature wasobserved. In investigating the effect of toxin overexpression to the growth heterogeneity on asingle cell level, it was found that in addition to slowing down the growth, overexpression of twotoxins (RelE and YafQ) generated a dividing and a non-dividing population of cells. Alsostudying the impact to growth heterogeneity of overexpressing some other ectopically growthinhibiting proteins revealed that producing heterogeneity in growth is not something unique toTA system, but also other proteins can induce differentiation of dividing and non-dividingsubpopulations. The transcription of relBE increases during aminoacid starvation (Christensen et.al., 2001). This observation encouraged us to study the effect of relBE to bacterial growthheterogenity while exiting the aminoacid starvation and stationary phase. No differences werefound while comparing the growth of wildtype and ∆relBE under these conditions.38

Kasutatud kirjandusAllen, G. C. ja Kornberg, A. (1991). Fine balance in the regulation of DnaB helicase byDnaC protein in replication in Escherichia coli. J Biol Chem 266: 22096-22101.Anantharaman, V. ja Aravind, L. (2003). New connections in the prokaryotic toxinantitoxinnetwork: relationship with the eukaryotic nonsense-mediated RNA decaysystem. Genome Biol 4.Barkai, N. ja Leibler, S. (2000). Circadian clocks limited by noise. Nature 403: 267-268.Becskei, A., Seraphin, B. ja Serrano, L. (2001). Positive feedback in eukaryotic genenetworks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO J 20:2528-2535.Bigger, J. W. (1944). Treatment of staphylococcal infections with penicillin. Lancet 2:497-500.Black, D. S., Kelly, A. J., Mardis, M. J. ja Moyed, H. S. (1991). Structure andorganization of hip, an operon that affects lethality due to inhibition of peptidoglycan orDNA synthesis. J Bacteriol 173: 5732-5739.Black, D. S., Irwin, B. ja Moyed, H. S. (1994). Autoregulation of hip, an operon thataffects lethality due to inhibition of peptidoglycan or DNA synthesis. J Bacteriol 176:4081-4091.Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R. ja Collins, J. J. (2003). Noise in eukaryotic geneexpression. Nature 422: 633-637.Bren, A. ja Eisenbach, M. (2001). Changing the direction of flagellar rotation in bacteriaby modulating the ratio between the rotational states of the switch protein FliM. J MolBiol 312: 699-709.Brooun, A., Liu, S. ja Lewis, K. (2000). A dose-response study of antibiotic resistancein Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother 44: 640-646.Chen, I., Christie, P. J. ja Dubnau, D. (2005). The ins and outs of DNA transfer inbacteria. Science 310: 1456-1460.Christensen, S. K. Pedersen, K. Hansen, F. G. Gerdes, K. (2003). Toxin-antitoxin locias stress-response-elements: ChpAK/MazF and ChpBK cleave translated RNAs and arecounteracted by tmRNA. J Mol Biol 332: 809-819.Christensen, S. K., Mikkelsen, M., Pedersen, K. ja Gerdes, K. (2001). RelE, a globalinhibitor of translation, is activated during nutritional stress. Proc Natl Acad Sci USA 98:14328-14333.39

Clark, D. J. ja Maaløe, O. (1967). DNA replication and the division cycle in Escherichiacoli. Journal of Molecular Biology 23: 99-112.Costerton, J. W., Stewart, P. S. ja Greenberg, E. P. (1999). Bacterial biofilms: acommon cause of persistent infections. Science 284: 1318-1322.Costerton, W., R., Veeh, M., Shirtliff, M., Pasmore, C., Post, G. ja Ehrlich. (2003).The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections.J Clin Investig 112: 1466-1477.Datsenko, K. A. ja Wanner, B. L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genesin Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645.Davis, T. L., Helinski, D. R. ja Roberts, R. C. (1992). Transcription and autoregulationof the stabilizing functions of broad-hostrange plasmid RK2 in Escherichia coli,Agrobacterium tumefaciens and Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol 6: 1981-1994.Dubnau. D ja Losick. R (2006). Bistability in bacteria. Molecular Microbiology 61: 564-572.Eberl, L., Givskov, M. ja Schwab, H. (1992). The divergent promoters mediatingtranscription of the par locus of plasmid RP4 are subject to autoregulation. Mol Microbiol6: 1969-1979.Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D. ja Swain, P. S. (2002). Stochastic geneexpression in a single cell. Science 297: 1183-1186.Engelberg-Kulka, H., Amitai, S., Kolodkin-Gal, I. ja Hazan, R. (2006). Bacterialprogrammed cell death and multicellular behavior in bacteria. PLoS Genet 2.Ferrell, J. E. (2002). Self-perpetuating states in signal transduction: positive feedback,double-negative feedback and bistability. Curr Opin Cell Biol 14.Fraser, H. B., Hirsh, A. E., Giaever, G., Kumm, J. ja Eisen, M. B. (2004). Noiseminimization in eukaryotic gene expression. PLoS Biol 2: 137.Gardner, T. S., Cantor, C. R. ja Collins, J. J. (2000). Construction of a genetic toggleswitch in Escherichia coli. Nature 403: 339-342.Gerdes, K., Rasmussen, P. B. ja Molin, S. (1986). Unique type of plasmidmaintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells. Proc Natl Acad SciUSA 83: 3116-3120.Gerdes, K. (2000). Toxin–antitoxin modules may regulate synthesis of macromoleculesduring nutritional stress. J Bacteriol 182: 561-572.Gerdes, K. Christensen S. K. and Løbner-Olesen. A. (2005). Prokaryotic toxinantitoxinstress responce loci. Nature 372: 371-382.40

Gotfredsen, M. ja Gerdes, K. (1998). The Escherichia coli relBE genes belong to a newtoxin–antitoxin gene family. Mol Microbiol 29: 1065-1076.Haldimann, A. ja Wanner, B. L. (2001). Conditional-replication, integration, excision,and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria. JBacteriol 183: 6384-6393.Hamoen, L. W., Van Werkhoven, A. F., Bijlsma, J. J. E., Dubnau, D. ja Venema, G.(1998). The competence transcription factor of Bacillus subtilis recognizes short A/T-richsequences arranged in a unique, flexible pattern along the DNA helix. Genes Dev 12:1539-1550.Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J MolBiol 166: 557-580.Harrison, J. J. (2005). Persister cells mediate tolerance to metal oxyanions inEscherichia coli. Microbiology 151: 3181-3195.Harrison, J. J., Turner, R. J. ja Ceri, H. (2005). Persister cells, the biofilm matrix andtolerance to metal cations in biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa. EnvironMicrobiol 7: 981-994.Hasty, J., Pradines, J., Dolnik, M. ja Collins, J. J. (2000). Noise-based switches andamplifiers for gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 97: 2075-2080.Heinrich, R. ja Schuster, S. (1998). The modelling of metabolic systems. Structure,control and optimality. Biosystems 47: 61-77.Hooshangi, S., Thiberge, S. ja Weiss, R. (2005). Ultrasensitivity and noise propagationin a synthetic transcriptional cascade. Proc Natl Acad Sci USA 102: 3581-3586.Humpheson, L., Adams, M. R., Anderson, W. A. ja Cole, M. B. (1988). Biphasicthermal inactivation kinetics in Salmonella enteridisPT4. Appl Environ Microbiol 64: 459-464.Isaacs, F. J., Hasty, J., Cantor, C. R. ja Collins, J. J. (2003). Prediction andmeasurement of an autoregulatory genetic module. Proc Natl Acad Sci USA 100: 7714-7719.Jaffe, A., Ogura, T. ja Hiraga, S. (1985). Effects of the ccd function of the F plasmid onbacterial growth. J Bacteriol 163: 841-849.Jesaitis, A. J. (2003). Compromised host defense on Pseudomonas aeruginosabiofilms: characterization of neutrophil and biofilm interactions. J Immunol 171: 4239-4339.Joers, A., Kaldalu, N. ja Tenson, T. (2010). The frequency of persisters in Escherichiacoli reflects the kinetics of wake-up from dormancy. J Bacteriol.41

Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J. ja Collins, J. J. (2005). Stochasticity in geneexpression: from theories to phenotypes. Nature Rev Genet 6: 451-464.Kasari, V., Kurg, K., Margus, T., Tenson, T. ja Kaldalu, N. The Escherichia coli mqsRand ygiT genes encode a new toxin-antitoxin pair. J Bacteriol 192: 2908-2919.Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y. ja Lewis, K. (2004). Persister cells andtolerance to antimicrobials. FEMS Microbiol Lett 230: 13-18.Keren, I., Shah, D., Spoering, A., Kaldalu, N. ja Lewis, K. (2004). Specializedpersister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli. J Bacteriol186: 8172-8180.Korch, S. B., Henderson, T. A. ja Hill., T. M. (2003). Characterization of the hipA7allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGppsynthesis. Mol Microbiol 50: 1199-1203.Kussell, E. ja Leibler, S. (2005). Phenotypic diversity, populationgrowth, and information in fluctuating environments. Science 309.Leid, J. G., Shirtliff, M. E., Costerton, J. W. ja Stoodley, A. P. (2002). Humanleukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms. InfectImmun 70: 6339-6345.Lewis, K. (2001). Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother 45: 999-1007.Losick, R. ja Desplan, C. (2008). Stochasticity and Cell Fate. Science 320: 64-68.Maamar, H. ja Dubnau, D. (2005). Bistability in the Bacillus subtilis K-state(competence) system requires a positive feedback loop. Mol Microbiol 56: 615-624.Mack, D. (2004). Mechanisms of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis andStaphylococcus aureus: functional molecules, regulatory circuits, and adaptiveresponses. Int J Med Microbiol 294: 203-212.Magnuson, R., Lehnherr, H., Mukhopadhyay, G. ja Yarmolinsky, M. B. (1996).Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1. J Biol Chem 271:18705-18710.Magnuson, R. ja Yarmolinsky, M. B. (1998). Corepression of the P1 addiction operonby Phd and Doc. J Bacteriol 180: 6342-6351.Marianovsky, I., Aizenman, E., Engelberg-Kulka, H. ja Glaser, G. (2001). Theregulation of the Escherichia coli mazEF promoter involves an unusual alternatingpalindrome. J Biol Chem 276: 5975-5984.42

Monk, M., Kinross, J. ja Town, C. (1973). Deoxyribonucleic acid synthesis in recA andrecB derivatives of an Escherichia coli K-12 strain with a temperature-sensitivedeoxyribonucleic acid polymerase I. J Bacteriol 114: 1014-1017.Motiejunaite, R., Armalyte, J., Markuckas, A. ja Suziedeliene, E. (2007). Escherichiacoli dinJ-yafQ genes act as a toxin-antitoxin module. FEMS Microbiol Lett 268: 112-119.Moyed, H. S. ja Bertrand, K. P. (1983). hipA, a newly recognized gene of Escherichiacoli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis. JBacteriol 155: 768-775.Moyed, H. S., and S. H. Broderick. (1986). Molecular cloning and expression of hipA, agene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition ofmurein synthesis. J Bacteriol 166: 399-403.Ninfa, A. J. ja Mayo, A. E. (2004). Hysteresis vs graded responses: the connectionsmake all the difference. Sci STKE 2004: 20.Niven, G. W. ja Mulholland, F. (1998). Cell membrane integrity and lysis inLactococcus lactis: the detection of a population of permeable cells in post-logarithmicphase cultures. Appl Microbiol84: 90-96.Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D. ja van Oudenaarden, A.(2002). Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genet 31: 69-73.Pandey, D. P. ja Gerdes, K. (2005). Toxin-antitoxin loci are highly abundant in freelivingbut lost from host-associated prokaryotes. Nucleic Acids Res 33: 966-976.Parsek, M. R. ja Singh, P. K. (2003). Bacterial biofilms: an emerging link to diseasepathogenesis. Annu Rev Microbiol 57: 677-701.Pascual, C., Robinson, T. P., Ocio, M. J., Aboaba, O. O. ja Mackey, B. M. (2001).The effect of inoculum size and sublethal injury on the ability of Listeria monocytogenesto initiate growth under suboptimal conditions. Lett Appl Microbiol 33: 357-361.Paulsson, J. (2004). Summing up the noise in gene networks. Nature 427: 415-418.Pedersen, K., Christensen, S. K. ja Gerdes, K. (2002). Rapid induction and reversal ofa bacteriostatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins. Mol Microbiol45: 501-510.Pedersen, K., K., C. S. ja Gerdes, K. (2002). Rapid induction and reversal of abacteriostatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins. Mol Microbiol45: 501-510.Pedraza, J. M. ja van Oudenaarden, A. (2005). Noise propagation in gene networks.Science 307: 1965-1969.43

Ptashne, M. (2004). A Genetic Switch. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring HarborLaboratorry Press.Raheb, J., Naghdi, S. ja Flint, K. P. (2007). Heat-Induced Synthesis of δ 32 inFlexibacter chinensis: The Role and Function in Cell Division. J Sci I R Iran 18: 115-121.Rao, C. V., Wolf, D. M. ja Arkin, A. P. (2002). Control, exploitation and tolerance ofintracellular noise. Nature 420: 231-237.Raser, J. M. ja O´Shea, E. K. (2004). Control of stochasticity in eukaryotic geneexpression. Science 304: 1811-1814.Raser, J. M. ja O'Shea, E. K. (2005). Noise in Gene Expression: Origins,Consequences, and Control. Science 309: 2010-2013.Robinson, T. P., Aboaba, O. O., Kaloti, A., Ocio, M. J., Baranyi, J. ja Mackey, B. M.(2001). The effect of inoculum size on the lag phase of Listeria monocytogenes. Int JFood Microbiol 70.Roostalu, J., Joers, A., Luidalepp, H., Kaldalu, N. ja Tenson, T. (2008). Cell divisionin Escherichia coli cultures monitored at single cell resolution. BMC Microbiol 8: 68.Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S. ja Elowitz, M. B. (2005). Generegulation at the single-cell level. Science 307: 1962-1965.Rowe-Magnus, D. A., Guerout, A. M., Biskri, L., Bouige, P. ja Mazel, D. (2003).Comparative analysis of superintegrons: engineering extensive genetic diversityin the Vibrionaceae. Genome Res 13: 428-442.Saavedra, De Bast, M., Mine, N. ja Van Melderen, L. (2008). Chromosomaltoxinantitoxin systems may act as antiaddiction modules. J Bacteriol 190: 4603-4609.Salmon, M. A., Van Melderen, L., Bernard, P. ja Couturier, M. (1994). The antidoteand autoregulatory functions of the F plasmid CcdA protein: a genetic and biochemicalsurvey. Mol Gen Genet 244: 530-538.Sambrook, J. ja Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Labaratory Manual. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbour Laboratory Press.Santos-Sierra, S., Pardo-Abarrio, C., Giraldo, R. ja Diaz-Orejas, R. (2002). Geneticidentification of two functional regions in the antitoxin of the parD killer system of plasmidR1. FEMS Microbiol Lett 206: 115-119.Scherrer, R. ja Moyed, H. S. (1988). Conditional impairment of cell division and alteredlethality in hipA mutants of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 170: 3321-3326.Sevin, E. W. ja Barloy-Hubler, F. (2007). RASTA-Bacteria: a web-based tool foridentifying toxin-antitoxin loci in prokaryotes. Genome Biol 8.44

Shah, D., Zhang, Z., Khodursky, A., Kaldalu, N., Kurg, K. ja Lewis, K. (2006).Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol 6: 53.Singh, P. K. (2000). Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs areinfected with bacterial biofilms. Nature 407: 762-764.Smith, J. A. ja Magnuson, R. D. (2004). Modular organization of the Phdrepressor/antitoxin protein. J Bacteriol 186: 2692-2698.Smits, W. K., Kuipers, O. P. ja Jan-Willem, V. (2006). Phenotypic variation in bacteria:the role of feedback regulation. Nature 4: 259-271.Smits, W. K., Eschevins, C.C., Susanna, K.A., Bron, S., Kuipers, O.P., and Hamoen,L.W. (2005). Stripping Bacillus: ComK auto-stimulation is responsible for the bistableresponse in competence development. Mol Microbiol 56: 604-614.Smolen, P., Baxter, D. A. ja Byrne, J. H. (2000). Modeling transcriptional control ingene networks — methods, recent results, and future directions. Bull Math Biol 62: 247-292.Spoering, A. L. ja Lewis, K. (2001). Biofilms and planktonic cells of Pseudomonasaeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol 183: 6746-6751.Storz, G. ja Hengge-Aronis (2000). Bacterial Stress Responses. Washington, DC:American Society for Microbiology Press.Swain, P. S., Elowitz, M. B. ja Siggia, E. D. (2002). Intrinsic and extrinsic contributionsto stochasticity in gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 99: 12795-12800.Zhang, J., Zhang, Y. ja Inouye, M. (2003). Characterization of the interactions withinthe mazEF addiction module of Escherichia coli. J Biol Chem 278: 32300-32306.Thattai, M. ja van Oudenaarden, A. (2001). Intrinsic noise in gene regulatory networks.Proc Natl Acad Sci USA 98: 8614-8619.Thieffry, D., Huerta, A. M., Perez-Rueda, E. ja Collado-Vides, J. (1998). From specificgene regulation to genomic networks: a global analysis of transcriptional regulation inEscherichia coli. Bioessays 20: 433-440.Tosa, T. ja Pizer, L. I. (1971). Effect of serine hydroxamate on the growth of Escherichiacoli. J Bacteriol 106: 966-971.Tsuchimoto, S., Nishimura, Y. ja Ohtsubo, E. (1992). The stable maintenance systempem of plasmid R100: degradation of PemI protein may allow PemK protein to inhibit cellgrowth. J Bacteriol 174: 4205-4211.Umbarger, H. E. ja Brown, B. (1955). Isoleucine and valine metabolism in Escherichiacoli. V. Antagonism between isoleucine and valine. J Bacteriol 70: 241-248.45

Van Melderen, L., Bernard, P. ja Couturier, M. (1994). Lon-dependent proteolysis ofCcdA is the key control for activation of CcdB in plasmid-free segregant bacteria. MolMicrobiol 11: 1151-1157.Van Melderen, L. De Bast, M. S. (2009). Bacterial Toxin-Antitoxin Systems: More ThanSelfish Entities? PLoS Genetics 5.van Sinderen, D. ja Venema, G. (1994). comK acts as an autoregulatory control switchin the signal transduction route to competence in Bacillus subtilis. J Bacteriol 176: 5762-6770.van Sinderen, D., Luttinger, A., Kong, L., Dubnau, D., Venema, G. ja Hamoen, L.(1995). comK encodes the competence transcription factor, the key regulatory proteinfor competence development in Bacillus subtilis. Mol Microbiol 15: 455-462.Vazquez-Laslop, N., Lee, H. ja Neyfakh, A. A. (2006). Increased persistence inEscherichia coli caused by controlled expression of toxins or other unrelated proteins. JBacteriol 188: 3494-3497.Wickens, H. J., Pinney, R. J., Mason, D. J. ja Gant, V. A. (2000). Flow cytometricinvestigation of filamentation, membrane patency, and membrane potential inEscherichia coli following ciprofloxacin exposure. Antimicrob Agents Chemother 44: 682-687.Vidal-Mas, J., Resina-Pelfort, O., Haba, E., Comas, J., Manresa, A. ja Vives-Rego, J.(2001). Rapid flow cytometry Nile red assessment of PHA cellular content andheterogeneity in cultures of Pseudomonas aeruginosa 47T2 (NCIB 40044) grown inwaste frying oil. Antonie Van Leeuwenhoek 80.Vilar, J. M., Kueh, H. Y., Barkai, N. ja Leibler, S. (2002). Mechanisms of noiseresistancein genetic oscillators. Proc Natl Acad Sci USA 99: 5988-5992.Vimberg, V., Tats, A., Remm, M. ja Tenson, T. (2007). Translation initiation regionsequence preferences in Escherichia coli. BMC Mol Biol 8: 100.Wiuff, C., Zappala, R. M., Regoes, R. R., N., G. K., Baquero, F. ja Levin, B. R. (2005).Phenotypic tolerance: antibiotic enrichment of noninherited resistance in bacterialpopulations. Antimicrob Agents Chemother 45: 1483-1494.Vuong, C. (2004). Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) protects Staphylococcusepidermidis against major components of the human innate immune system. CellMicrobiol 6: 269-275.Xu, K. D., McFeters, G. A. ja Stewart, P. S. (2000). Biofilm resistance to antimicrobialagents. Microbiology 146: 547-549.46