Echerichia coli kasvu heterogeensus ja toksiin-antitoksiini süsteemid

juures ja võeti iga 30 minuti tagant ajapunkte alates bakterite 14 ml söötmele lisamisest. Samutivõeti iga poole tunni tagant 1 ml kultuuri spektrofotomeetril Heλiosβ OD600 juures kasvujälgimiseks. Tund aega pärast inkubeerimist lisati kultuurile valiini lõppkontsentratsiooniga 0,2mg/ml. Peale veel tundi kasvatamist lisati 10 ml eelsoojendatud minimaalsöödet millele olidlisatud kõik teised aminohapped peale valiini kontsentratsiooniga 0,2 mg/ml. Proove võeti veel 3h. Katse tehti kolmes korduses.Aminohappenälja indutseerimine seriinhüdroksamaadiga (SHT).3 ml LB-s kasvatatud üleöökultuurist tehti 100x lahjendus 3 ml AB söötmesse, millele olidlisatud kõik AH-d kontsentratsioonil 100 µg/ml. Kultuuri inkubeeriti 3,5 h 37°C ning lisati GFPinduktsiooniks IPTG lõppkontsentratsiooniga 1 mM. Pärast veel tundi kasvatamist pesti rakudIPTG-st (tsentrifuugiti 2 min 10000 rpm) ja rakud lisati 3 ml kõiki aminohappeid sisaldavasseAB söötmesse, mis sisaldas ka SHT 0,4 mg/ml ning inkubeeriti 1 h 37°C . Rakud tsentrifuugitipõhja (10 min, 5000g, 20C) ja pesti 1x võrdse mahu AB söötmega. Peale pesu resuspendeeritirakud 3 ml AB söötmes, mis sisaldas aminohappeid 100 µg/ml ning kasvatati 3 h loksutil. Proovevõeti iga poole tunni tagant alates SHT lisamisest. Katse tehti kolmes korduses.2.1.11. Toksiinide üleekspressiooni võrdlus E. colis.Toksiini plasmiidid viidi punktis 2.1.3. kirjeldatud transformatsiooni protokolliga punktis 2.1.4.kirjeldatud metoodika alusel konstrueeritud bakteritüvesse.Üleöö LB-s kasvatatud kultuurist tehti 500x lahjendus 3 ml LB + CAM lõppkontsentratsiooniga50 µg/ml ning inkubeeriti 37°C juures. Peale 2 h kasvatamist lisati IPTGlõppkontsenntratsiooniga 1mM ning inkubeeriti veel 2,5 h. Nüüd vahetati sööde välja tehes 10xlahjenduse 5 ml uude söötmesse, mis sisaldas CAM 50 µg/ml ning 0,2 % arabinoosi toksiinisünteesi indutseerimiseks. Peale 1,5 h inkubeerimist vahetati uuesti söödet (seekord ilmalahjenduseta): 5 ml LB, mis sisaldas CAM 50 µg/ml ning 0,2 % glükoosi toksiini sünteesiallasurumuseks. Ajapunkte võeti alates toksiini sünteesi indutseerimisest pooleteise tunni jooksuliga poole tunni tagant ning järgmise 3 tunni jooksul iga tunni järel.2.1.12. Voolutsütomeetriline analüüsBakterite kasvu heterogeensuse analüüs põhines Tensoni laboris väljatöötatud GFP lahjenemisemeetodil (Roostalu jt., 2008).22