TARTU ÜLIKOOL

SISUKORDSisukord .......................................................................................................................... 2Lühendid ........................................................................................................................ 3Sissejuhatus .................................................................................................................... 41. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ..................................................................................... 51.1. Tupe mikrofloora .................................................................................................. 51.1.1. Koostis ......................................................................................................... 51.1.2. Tähtsus ........................................................................................................ 61.1.3. Mõjutavad tegurid ....................................................................................... 71.1.4. Korüneformsed bakterid kui tupe mikrofloora komponent ......................... 81.1.4.1. Korüneformsete bakterite morfoloogia ja klassifikatsioon ......... 81.1.4.2. Liigiline koostis ja hulgad tupes .................................................. 91.2. Meessuguteede mikrofloora ................................................................................. 91.2.1. Meessuguteede normaalne mikrofloora..................................................... 101.2.2. Meessuguteede mikrofloora prostatiidi korral ........................................... 101.2.3. Korüneformsed bakterid kui meessuguteede mikrofloora komponent ..... 112. EKSPERIMENTAALOSA ...................................................................................... 122.1. Töö eesmärgid .................................................................................................. 122.2. Materjal ja meetodid ....................................................................................... 122.2.1. Uuritavad mehed ja naised ........................................................................ 122.2.2. Uuritavad korüneformsete bakterite tüved .............................................. 132.2.3. Korüneformsete bakterite samastamine ................................................... 142.2.4. Statistiline analüüs .................................................................................... 142.3. Tulemused ja arutelu ..................................................................................... 152.3.1. Korüneformsed bakterid tupes.................................................................... 152.3.2. Korüneformsed bakterid spermas tervetel ja prostatiidiga meestel ............ 162.3.3. Korüneformsed bakterid prostatiidiga meeste ning kontrolluuritavatenaispartneritel ...................................................................................................... 172.3.4. Erinevate meetodite võrdlus suguteede korüneformsete bakteritesamastamisel ....................................................................................................... 182.3.4.1. Erinevate praimerite võrdlus ..................................................... 182.3.4.2. Sekveneerimise ja API meetodil samastamise võrdlus ............ 20KOKKUVÕTE .............................................................................................................. 22RESÜMEE/SUMMARY ............................................................................................... 23TÄNUAVALDUSED ..................................................................................................... 25KASUTATUD KIRJANDUS ........................................................................................ 26LISAD ............................................................................................................................ 302

LÜHENDID16S rRNA – Prokarüootse ribosoomi 30S väikse subühiku osaAPI – Analüütiline profiiliindeks (Analytical Profile Index according to fermentation patternof carbohydrates by Corynebacterum (bioMérieux))BLAST - Basic Local Alignment Search ToolBV – Bakteriaalne vaginoosC. – CorynebacteriumHIV – Inimese immuunpuudulikkuse viirus (Human immunodeficiency virus)HPV – Inimese papilloomviirus (Human papillomavirus)HUMB - Inimese mikrobioota biopank (Human Microbiota Biobank)NCBI - The National Center for Biotechnology InformationPCR – Polümeraasi ahelreaktsioon (Polymerase chain reaction)WBC – Valgeverelibled ehk leukotsüüdid (white blood cells)3

SISSEJUHATUSInimese normaalne mikrofloora ehk mikrobioota on keeruline ökosüsteem, mis koosnebumbes 10 14 erinevast mikroobirakust. Enamik inimese mikroobe asub soolestikus, kuidnormaalne mikrobioota on olemas ka suguteedes, suus, hingamisteedes ja nahal. Meiemikroobid osalevad mitmesugustes protsessides ning kaitsevad meid võõraste mikroobideeest. Samas võivad nad osaleda ka haiguste tekkes.Nii nais- kui ka meessuguteede normaalses mikrobiootas moodustavad ühe olulise osakorünebakterid. Tegemist on väikeste pleomorfsete eosteta ja kihnuta grampositiivsetepulkbakteritega, mis asetsevad sageli lühikeste ahelatena või hiina kirjamärke meenutavatekogumikena.Korünebaktereid on seni väga vähe uuritud. Neid on peetud kommensaalseteks bakteriteks,mille rolli kohta normaalses mikrobiootas on vähe andmeid. Samas on neid baktereidviimaste aastate jooksul järjest rohkem seostatud ka haigustega.TÜ Mikrobioloogia Instituudis on mees- ja naissuguteede mikrobiootat mitmete aastate välteluuritud ning nende tööde käigus on instituudi kultuurikollektsiooni kogunenud arvukaltmikroobitüvesid, sh korünebaktereid. Käesolevas töös selgitati nende liigilist koostist.4

taksonoomias toimunud olulised muutused – mitmed liigid on grupeeritud omaetteperekondadesse, nagu Arthrobacter, Cellulomonas, Dermabacter, Rhodococcus jpt., mismoodustavad heterogeense, kuid morfoloogiliselt seotud korüneformsete bakterite grupi.Korüneformsed bakterid kuuluvad hõimkonda Actinobacteria (Bernasconi et al., 2004).1.1.4.2. Liigiline koostis ja hulgad tupesVaginaalse ökosüsteemi normaalseks komponendiks on sageli mitmesugused korüneformsedbakterid, tavaliselt esinevad nad väikeses hulgas. Rutiinsetes mikrobioloogilistes uuringutesneile eriti tähelepanu ei pöörata ning nende liigilisest koostisest on väga vähe teada.Gardnerella vaginalis’t, mida on rohkem uuritud, võib väikeses hulgas leida tervete naistetupes, kuid bakteriaalse vaginoosi korral muutub ta domineerivaks liigiks (de Figueiredo Leiteet al., 2010). Naiste tupest on leitud ka anaeroobset korüneformse morfoloogiaga bakteritPropionibacterium, mida on mitmetes varasemates publikatsioonides identifitseeritud kuikorünebakterit. Näiteks Corynebacterium parvum on nüüdseks ümber nimetatudPropionibacterium acnes’iks (Eady et al., 1994).1.2. Meessuguteede mikroflooraMehe suguteed koosnevad munanditest, epididüümisest, seemnejuhast, eesnäärmest jakusejuhast. Munandid asetsevad munandikotis ning koosnevad seemnetorukestest, mistoodavad spermatosoide. Seemnetorukesi ümbritsev kude sisaldab rakke, mis toodavadmeessuguhormoon testosterooni. Kusejuha on lihaseline toru, läbi mille väljutatakse kehasturiin ja sperma. Sperma siseneb kusejuhasse ejakulatsiooni ajal. Eesnääre on lihaselinepüramiidikujuline eksokriinne nääre kusepõie all ja ümbritseb vööna kusejuha.Seemnepõiekesed asetsevad mõlemal pool eesnääret. Eesnäärme ja seemnepõiekeste poolttoodetav vedelik moodustab osa ejakulaadist (väljutatud spermast). Eesnäärme sekreetmuudab spermatosoidid liikumisvõimeliseks ja aitab neutraliseerida tupe happelisust.Eesnäärme sekreet moodustab väikese osa uriinist ning on ejakulaadi põhikomponendiks(20%-30%). Tervete meeste eesnäärmesekreet on kergelt happeline (pH 6.2...6.5). Seekombineerub teiste näärmeeritistega ning moodustab kergelt aluselise pH-ga (7.8…8.0)sperma (McCance et al., 2006; Haugen et al., 1998).9

1.2.1. Meessuguteede normaalne mikroflooraMeessuguteedes on normaalne mikrofloora olemas ureetras. Selles leidub nii aeroobseid kuika mikroaerofiilseid ja anaroobseid mikroorganisme. Kõige sagedamini on leitud strepto-,entero- ja stafülokokke, difteroide ning anaeroobseid kokke ja pulkbaktereid. Mikroflooratleidub ka välisgenitaalide nahal. Ülemised meessuguteed, sealhulgas eesnääre, peavad olemanormaalselt mikroobivabad. Kuna uriin ja sperma läbivad ureetra, siis tervetel meestelsisaldavad nad eelkõige ureetra normaalsest mikrofloorast pärinevaid liike, kusjuuresmikroobide kontsentratsioon ja erinevate liikide arv on madal (Szöke et al., 1998; Kermes etal., 2003; Türk et al., 2010).Rehewy kaasautoritega (1979) uurisid tervete meeste spermat ning leidsid sealtStaphylococcus epidermidis’e, Staphylococcus aureus’e, Corynebacterium sp, Mycoplasmahominis’e ja Ureaplasma urealyticum’i. Montagnini Spaine’i ning kaasautorite (2000)uurimuste kohaselt domineerivad terve kusiti ja eesnäärme sekretsioonis järgmisedmikroorganismid: koagulaas-negatiivsed stafülokokid, Streptococcus viridans,Corynebacterium sp. ja Enterococcus sp..1.2.2. Meessuguteede mikrofloora prostatiidi korralProstatiit ehk eesnäärmepõletik on sage haigus – 2-14% täiskasvanud meestest esinebprostatiidi sümptomeid ning seda põeb kuni 50% meestest mingil eluperioodil. Prostatiit onolulisel kohal ka mehepoolse viljatuse põhjuste hulgas. Samas on tegemist halvasti uuritudhaigusega, mille etioloogia on suuresti teadmata. Rutiinsete uuringute käigus leitaksepatsientide eesnäärme-spetsiifilistest materjalidest (prostatasekreet, prostata-massaži järgneuriin, sperma) ainult ühel juhul kümnest traditsioonilisi uropatogeene (gramnegatiivsedEnterobacteriaceae sugukonna bakterid või grampositiivsed enterokokid), üheksal juhulkümnest jääb haigusetekitaja leidmata.Samas on eesnäärme biopsiauuringud näidanud prokarüootse DNA olemasolu eesnäärmesenamikul prostatiidi juhtudel. Seetõttu on prostatiidi tekitajatena kahtlustatud ka paljusidmittekultiveeritavaid või raskestikultiveeritavaid baktereid. TÜ mikrobioloogia instituudi jaTÜK Androloogiakeskuse koostöös tehti kompleksne uuring, mis hõlmas ka rutiinsediagnostika raamidest väljapoole jäävaid mikroobe (sh anaeroobsed, bakterid, mükoplasmadning korünebakterid). Tööst selgus, et prostatiidipatsientide spermas esinevad arvukadpolümikroobsed kooslused, kus on oluline osakaal anaeroobsetel bakteritel ja10

2. EKSPERIMENTAALOSA2.1. Töö eesmärgidKäesoleva uurimistöö eesmärgiks oli selgitada mees- ja naissuguteedes sisalduvatekorüneformsete bakterite liigiline koostis. Selleks püstitati järgmised uurimisülesanded:Hinnata korüneformsete bakterite liigilist koostist nii nais- kui meessuguteedes;Võrrelda meessuguteede korüneformsete bakterite liigilist koostist prostatiidigameestel ning kontrolluuritavatel;Võrrelda naissuguteede korüneformsete bakterite liigilist koostist prostatiidiga meesteja tervete meeste naispartneritel.2.2. Materjal ja meetodid2.2.1. Uuritavad mehed ja naisedKäesolevas töös uuritud korüneformsed bakterid pärinevad kahelt uuritavate grupilt. Meesteltkoguti spermaproove ning naistelt tupesekreeti.Esimese grupi moodustasid 17 mees-naine paari, kes pöördusid paari viljatuse kaebusegaTartu Ülikooli Kliinikumi Androloogiakeskusesse aastatel 2009-2010. Uuritavate meestevanus oli keskmiselt 31,6 (25…40) aastat, naiste vanus 29,9 (21…39) aastat. Viiel mehel 17-st leiti tugev leukotsütospermia (>1 miljoni WBC/ml), mille alusel diagnoositi põletikulineprostatiit. Ülejäänud 12 meest olid prostatiidi sümptomiteta ja olulise leukotsütospermiata.Naispartnerite inklusioonikriteeriumiks oli partnersuhe uuringugruppi kuuluva mehega >12kuu jooksul. Eksklusioonikriteeriumiks oli muuhulgas mõlema partneri jaoksantibiootikumravi viimase kolme kuu jooksul ning naispartnerite jaoks hormoonsüsteemimuutev ravi (Borovkova et al., 2011). Kuna meil viljakate paaride võrdlusgruppi ei ole, siisantud töös me viljatuse mõju suguteede bakteritele ei käsitle.Teise uuritavate grupi moodustasid 109 meest, kes osalesid kroonilise prostatiidiprospektiivses uuringus Tartu Ülikooli Kliinikumi Androloogiakeskuses aastatel 2003-2005.Uuring hõlmas kroonilise prostatiidiga mehi ning kontrolluuritavaid. Prostatiidiga meestevanuseks oli keskmiselt 28,5 aastat ning kontrolluuritavate keskmiseks vanuseks oli 20,012

aastat. Kõik uuringus osalevad isikud olid vähemalt 18-aastased. Ükski uuritav polnud saanudantibakteriaalset teraapiat 3 kuu jooksul (Türk et al., 2007). Mõlemaks uuringuks saadi lubaTartu Ülikooli Inimuuringute Eetika Komiteelt. Uuritavate isikuandmed kodeeriti ja need eikuulu avalikustamisele; isikuandmed ja mõõtmistulemused hoitakse eraldi. Uuringusosalemine oli vabatahtlik, kõik osalejad said uuritava infolehe ning täitsid nõusoleku vormi.2.2.2. Uuritavad korüneformsete bakterite tüvedTöös kasutatud korüneformsete bakterite tüved pärinesid Tartu Ülikooli MikrobioloogiaInstituudi mikroobitüvede kollektsioonist (HUMB). Kokku uuriti 42 tüve, neist 13 pärinesidnaistelt ja 29 meestelt (Tabel 1). Varasemalt oli osa tüvesid samastatud biokeemiliselt,kasutades kommertsiaalset kit’i API Coryne (bioMérieux).Tabel 1. Uuringus kasutatud korüneformsete bakterite tüvedLiik (biokeemilise samastamise alusel)* Tüvede arv #MehedNaisedCorynebacterium seminale 4Corynebacterium jeikeium 1Corynebacterium striatum/ amycolatum 1 1Corynebacterium afermentans/ coyleae 1Corynebacterium propinquum 1Corynebacterium grupp G 5Dermabacter hominis 2Cellulomonas spp/Microbacterium spp 2Brevibacterium spp 1 1Korüneformsed bakterid, mis olid biokeemiliseltsamastamata või mille samastamine ebaõnnestus12 10* Tabelis olevad liiginimed on saadud varasemal biokeemilisel samastamisel.# Mees-naine paaride grupis uuriti 13 tüve, mis pärinesid 9 naiselt ja 8 tüve, mis pärinesid 7 mehelt. Prostatiidiuuringu grupis uuriti 21 tüve, mis pärinesid 18 mehelt. Neist prostatiidiga mehi oli mees-naine paarideuuringus 2 ning prostatiidi uuringus 8.13

2.2.3. Korüneformsete bakterite samastamineUuritavaid baktereid kasvatati esmalt värskelt valmistatud veriagaril 24 h 37°C juuresvastavalt iga konkreetse tüve kasvueelistusele mikroaeroobses või aeroobses termostaadisning seejärel tehti puhta bakterimassi saamiseks ümberkülv Gouldi meetodil veriagarile, midainkubeeriti samuti 24 h. Järgneval päeval vaadeldi agarsöötmel välja kasvanud erinevaidpesatüüpe: hinnati nende puhtust ning hulka. Erinevat tüüpi pesadest tehti Grami meetodilvärvitud äigepreparaat bakterikultuuri puhtuse kontrollimiseks. Mikroskoobis hinnatimikroobi põhivormi – värvumust Grami järgi, morfoloogiat ja asetust. Vajadusel korrati külviveriagarplaadile.DNA eraldamiseks kasvatati korüneformseid baktereid veriagarplaadil 24 h 37°C juures.Bakterite genoomne DNA eraldati QIAamp DNA Mini Kit’iga vastavalt tootja protokollile(Qiagn, GmbH, Saksamaa) ning säilitati -80 °C juures.Korüneformsete bakterite samastamine toimus sekveneerimismeetodil. PCR reaktsiooniteostamisel kasutati kaht erinevat praimerite paari 16S rRNA geenide amplifitseerimiseks:1) broad-range bakteriaalsed praimerid (5’-GTTAAGTCCCGCAAGGA-3’ ja 5’-AGGAGGTGATCCAGCC-3’) 440 bp pikkuse 16S rRNA produkti valmistamiseks lisas 1kirjeldatud PCR tingimuste järgi;2) latter praimerid (5’-CGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCG-3’ ja 5’-CGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTC-3’) 516 bp 16S rRNA produkti valmistamiseks(Adderson et al., 2008).Sekveneerimisreaktsioon viidi läbi kasutades Sequenase Sequencing kit’i (Amersham,Slough, UK) vastavalt tootja ettekirjutustele. Sekveneerimistulemuste abil määrati bakteriteliigid kasutades BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programmi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.html [3]).2.2.4 Statistiline analüüsStatistiliseks analüüsiks kasutati arvutiprogramme Excel (Microsoft Corp., Redmond, OR,USA) ja SigmaStat (Systat Software, Inc., CA, USA). Gruppidevaheliste erinevustearvutamiseks kasutati Fisher exact testi.14

2.3. Tulemused ja arutelu2.3.1. Korüneformsed bakterid tupesMees-naine paaride grupis uuriti 13 tüve, mis pärinesid 9 naiselt. Tabelis 2 on ära tooduduuritud naiste tupest leitud korünebakterite liigid, samuti nende esinemissagedus uuritavategrupis ja hulk tampooni kohta. Kokku leiti naistelt 5 erinevat korüneformsete bakterite liiki,kõige sagedasem liik oli Corynebacterium amycolatum. Ühel naisel leiti Corynebacteriumglucuronolyticum, mis on tänaseks ümber nimetatud C. seminale’ks ja mis on sage liikmeessuguteedes (Riegel et al., 1995; Türk et al., 2007).Tabel 2. Korüneformsete bakterite liigiline koostis ja hulk nais- ja meessuguteedesTüvede arv(mikroobi hulk ml või tampooni kohta+)Liik* Tupesekreedis SpermasArthrobacter cumminsii 1 (10000) 1 (10000)Actinomyces neuii 1 (100)Brevibacterium mcbrellneri 1 (100)Brevibacterium lutescens 1 (5000)Brevibacterium sp. 1 (1000)Corynebacterium glucuronolyticum (C. seminale) 1 (100000) 5 (1000..100000)Corynebacterium ureicelerivorans 1 (10000)Corynebacterium minutissimum 1 (100) 4 (100.. 5000000)Corynebacterium amycolatum 5 (10000..1000000) 1 (100000)Corynebacterium aurimucosum 2 (5000..100000)Corynebacterium freneyi 1 (5000)Corynebacterium glutamicum 1 (100)Corynebacterium sp. 1 (100000)Dermabacter hominis 2 (100)Dermabacter hominis/Arthrobacter sp. 2 (100000)Propionibacterium avidum/acnes 2 (100)Propionibacterium sp. 1 (5000)Zimmermannella alba/ faecalis 1 (100000)Paenibacillus glucanolyticus # 2 (1000..50000)Micrococcus luteus # 2 (100..50000)Uncultured bacterium # 1 (100)* Liik on määratud sekveneerimise teel# Meestelt isoleeritud 29-st korüneformse morfoloogiaga tüvest osutus 4 teistesse perekondadesse kuuluvateks(Micrococcus on grampositiivne kokk, Paenibacillus on grampositiivne eostega pulkbakter) ja 1 tüve eiõnnestunud sekveneerimisel samastada (vastus: uncultured bacterium).+ Hulgad määratud külvimeetodil15

2.3.2. Korüneformsed bakterid spermas tervetel ja prostatiidiga meestelTabelis 2 on ära toodud uuritud meessuguteedest leitud korünebakterite liigid, samuti nendeesinemissagedus uuritavate grupis ja hulk ml sperma kohta. Kokku leiti meestelt 14 erinevatkorüneformset bakterit, mida on oluliselt rohkem kui naistel. Sagedasemad liigid olid meestelCorynebacterium glucuronolyticum ehk C. seminale ja Corynebacterium minutissimum.Meeste ja naiste liigilise koostise erinevuse üheks põhjuseks võib olla keskkonna erinevus –naiste tupekeskkond on happeline (pH normaalselt alla 4.7), meeste sperma aga kergeltaluseline.Corynebacterium glucuronolyticum’i ehk C. seminale tüüptüvi isoleeriti Strasbourgis,Prantsusmaal prostatiidiga patsiendi spermast (Riegel et al., 1995). Prostatiidihaigel esineb seetüvi tavaliselt kõrges kontsentratsioonis, kuigi teda leitakse ka tervetelt meestelt (Türk et al.,2007). C. seminale iseloomustus pärineb aastast 1995. See tüvi on tundlik kloramfenikoolining rifampiini suhtes (Funke et al., 1996). Türk kaasautoritega (2010) tõid oma uuringutekäigus välja, et C. seminale on tundlik ka beetalaktaamantibiootikumide suhtes.Tabelis 3 on esitatud korüneformsete bakterite võrdlev esinemine prostatiidiga meestel jakontrolluuritavatel. Prostatiidiga patsientide spermas leidus järgmisi liike: Arthrobactercumminsii, C. ureicelerivorans, C. aurimucosum, Zimmermannella alba ning Dermabacterhominis/Arthrobacter sp. Tervete meeste spermas leidus Actinomyces neuii, C. amycolatum,C. freneyi, Dermabacter hominis, Brevibacterium lutescens ning C. glutamicum. Mõlemasgrupis leiti C. seminale ning C. minutissimum. Heterogeense liigilise koostise ja sellesttulenevate üksikute liikide madalate esinemissageduste tõttu olid gruppidevahelisederinevused mitteolulised (p>0.05) ning erinevate liikide seos prostatiidiga vajaks täiendavaiduuringuid.Tabel 3. Korüneformsete bakterite esinemine prostatiidiga patsientidel ning tervetel meestelLiikProstatiidigapatsientidespermas#Tervete meestespermas#Arthrobacter cumminsii 1Actinomyces neuii 1Corynebacterium glucuronolyticum (C. seminale) 1 4Corynebacterium ureicelerivorans 1Corynebacterium minutissimum 1 3Corynebacterium amycolatum 1Brevibacterium sp. 116

Corynebacterium freneyi 1Dermabacter hominis 2Dermabacter hominis/Arthrobacter sp. 2Corynebacterium aurimucosum 2Brevibacterium lutescens 1Corynebacterium glutamicum 1Zimmermannella alba/ faecalis 1# Tüvede arv2.3.3. Korüneformsed bakterid prostatiidiga meeste ning kontrolluuritavatenaispartneritel17-st mees-naine paarist oli viiel mehel prostatiit. Nende viie prostatiidiga mehenaispartneritest olid korüneformsed bakterid uurimiseks kättesaadavad neljalt naiselt. Nendelnaistel leiti kahte liiki: C. minutissimum ja C. amycolatum. Ülejäänud 12 paarinaispartneritest olid korüneformsed bakterid uurimiseks kättesaadavad 5 naiselt. Nendelnaistel leiti järgmisi liike: Propionibacterium avidum/acnes, Brevibacterium mcbrellneri, C.minutissimum, C. glucuronolyticum ja Arthrobacter cumminsii (Tabel 4). Kahel mees-nainepaaril oli mõlemalt partnerilt isoleeritud korüneformsete bakterite tüvesid võimalik võrrelda.Ühel paaril, kus mehel ei olnud prostatiiti, leiti spermast C. seminale ning C. freneyi, temanaispartneril leidus Propionibacterium sp. Teisel paaril, kus mehel oli prostatiit, leiti mehespermast C. ureicelerivorans, tema naispartneri tupesekreet sisaldas C. amycolatum’it.Prostatiidiga meeste ning tervete meeste naispartnerite suguteede koostise põhilisekserinevuseks oli Corynebacterium amycolatum, mida leidus uuritud paaride 5 prostatiidigamehe naispartnerist uurimiseks kättesaadavast neljast naisest kõigil neljal, kuid seda liikikorünebakterit ei leitud ühteltki viiest naisest, kelle mehel ei olnud prostatiiti (p=0.008).Corynebacterium amycolatum’it kirjendati esimest korda 1988. aastal ning isoleeriti inimesenahalt (Collins et al., 1988; Knox et al., 2002). Seda liiki on leitud ka infektsioosseendokardiidiga patsientidelt, kellel oli soodustava tingimusena eelnev südamehaigus võikunstlikud südameklapid. Samuti on seda liiki leitud teiste kliiniliste infektsioonide, shbakterieemia ja peritoniidi korral ning ta on tunnistatud oluliseks patogeeniks. Endokardiidipuhul soovitatakse patsientide raviks vankomütsiini ja rifampitsiini kombinatsiooni, millesuhtes C. amycolatum on tundlik (Knox et al., 2002; Esteban et al., 1999). C. amycolatumi’iesinemine ja kliiniline tähtsus prostatiidiga meestel ja selle ülekanne partnerite vahel vajakstäiendavaid uuringud.17

Tabel 4. Korüneformsete bakterite liigid prostatiidiga patsientide ning kontrolluuritavatenaispartneritelLiikProstatiidiga meestenaispartneridTervete meestenaispartneridArthrobacter cumminsii 1Corynebacterium glucuronolyticum 1Corynebacterium sp. 1Corynebacterium minutissimum 1Corynebacterium amycolatum 5 *Brevibacterium mcbrellneri 1Propionibacterium sp. 1Propionibacterium avidum/acnes 2* Corynebacterium amycolatum’ i 5 tüve pärinesid neljalt naiselt.2.3.4. Erinevate meetodite võrdlus suguteede korüneformsete bakteritesamastamisel2.3.4.1. Erinevate praimerite võrdlusSuguteede korüneformsete bakterite samastamisel kasutati kahte praimeripaari. Tabel 5 näitabmõlema praimeripaariga saadud sekveneerimise tulemusi ning ka protsentuaalsetkokkulangevust NCBI (The National Center for Biotechnology Information) andmebaasiga.Enamiku tüvede puhul (19 tüve) langesid tulemused kokku. Mitmel juhul andis erinevatepraimeripaaridega teostatud sekveneerimine lähedased liigid, näiteks Zimmermannella alba jaZimmermannella faecalis.Esimene kasutatud praimeripaar ehk latter primers (Adderson et al., 2008) andis päris mitmelkorral vastuseks Uncultured bacteria. Teine praimeripaar ehk broad-range bacterial primers(Adderson et al., 2008) aga andis sama tulemuse vaid ühel korral ja kahel korralsekveneerimine tulemusi ei andnud. Ülejäänud tüvede puhul sekveneerimine õnnestus ningsaadi ka arvestatavad tulemused hea kokkulangevusprotsendiga. Seega on broad-rangebacterial primers kasutamine korünebakterite samastamisel eelistatavam.18

Tabel 5. Sekveneerimistulemuste võrdlus kahe erineva praimeripaari kasutamiselTüvedeLatter primers %* Broad-range bacterial %*arvprimers2 Arthrobacter cumminsii 99 Arthrobacter cumminsii 99..1001 Actinomyces neuii subsp. neuii 100 A. neuii subsp. anitratus 1006 C. glucuronolyticum (C. 99..100 C. glucuronolyticum (C. 99..100seminale)seminale)1 Uncultured bacterium clone 100 C. ureicelerivorans

2.3.4.2. Sekveneerimise ja API meetodil samastamise võrdlusVarasemalt oli 42 uuritavast tüvest 25 samastatud API meetodil. Tabelis 6 on toodudsekveneerimistulemuste ja API meetodil biokeemilise samastamise tulemuste võrdlus.API meetod andis sekveneerimisega sama tulemuse 6 juhul (24%), seega on kokkulangevusüpris väike. Samuti oli tüvesid, mille samastamine API meetodil tulemust ei andnud. Kõigeparem kokkulangevus oli Corynebacterium seminale ehk C. glucuronolyticum’i puhul – APItulemused leidsid sekveneerimisel kinnitust 4 juhul 5-st. Ühel juhul oli kokkulangevusCorynebacterium amycolatum’i ja ühel juhul Dermabacter hominis’e osas.Tabel 6. Samastamistulemuste võrdlus kasutades sekveneerimist ja API meetoditTüvenumberLatter primersBroad-range bacterialprimersAPI testCM2CN3A-17CM12-1CN3B-18SP16BArthrobacter cumminsiistrain Z486Uncultured bacteriumclone ncd2819g03c1Corynebacterium freneyistrain M3Uncultured bacteriumclone ncd141a03c1Corynebacteriumminutissimum strainNCTC 10288Arthrobactercumminsii strain 1515Corynebacteriumamycolatum strainNCFB 2768Corynebacteriumfreneyi isolate 3171Corynebacteriumamycolatum strainNCFB 2768Corynebacteriumminutissimum strainNCTC 10288Cellumonas spp /Microbacterium sppCorynebacteriumjeikeium/BrevibacteriumsppCorynebacteriumstriatum/CorynebacteriumamycolatumCorynebacteriumjeikeium/Corynebacteriumstriatum/CorynebacteriumamycolatumCorynebacterium grupp G03026B Corynebacteriumglucuronolyticum isolate98-0098Corynebacteriumglucuronolyticumisolate 98-0098Corynebacteriumseminale ehk C.glucuronolyticum12034F Dermabacter hominis Dermabacter hominis Dermatobia hominis04016D Uncultured bacterium Brevibacterium sp. Corynebacterium01007QSP9Fclone ncd2467c01c1Uncultured bacteriumclone ncd2757f05c1Uncultured bacteriumclone ncd2791f06c1TUT1201Corynebacteriumminutissimum strainNCTC 10288Corynebacteriumaurimucosum ATCC700975propinquumun-ID-able *Corynebacterium grupp G20

03019C03019AMicrococcus luteus strainCJ-G-TSA7Brevibacterium lutescenstype strain CF87TMicrococcus luteusisolate CV44Brevibacterium sp.TUT1201Corynebacterium sppCorynebacterium spp01007ASP1CUncultured bacteriumclone ncd2791f06c1Uncultured bacteriumclone ncd2791f06c1Zimmermannella albastrain IFO 15616Corynebacteriumaurimucosum ATCC700975Uncultured bacteriumclone nbu190b10clZimmermanellafaecalis isolateSCH0410Corynebacteriumglucuronolyticumisolate 98-0098Arthrobacter sp. SPC26Corynebacterium grupp GCorynebacterium grupp GSP6CCorynebacteriumaferm/Corynebacteriumcoyleae03016B CorynebacteriumCorynebacteriumglucuronolyticum isolateseminale ehk C.98-0098glucuronolyticum10040R-1 Dermabacter hominisCorynebacteriumstrain RA7seminaleSP41C Dermabacter hominis Dermabacter hominis Dermabacter hominis02016C Uncultured bacteriumclone ncd2757f05c110040G Dermabacter hominisstrain RA702005P-1 Corynebacteriumglucuronolyticum isolate98-0098SP12B-1SP12B-2SP30BCN13B-1Micrococcus luteus strainBGCC 1079Corynebacteriumglucuronolyticum isolate98-0098Paenibacillusglucanolyticus strainFR1_105Corynebacteriumamycolatum* un-ID-able unidentifiable (võimatu tuvastada)CorynebacteriumglutamicumArthrobacter sp. SPC26Corynebacteriumglucuronolyticumisolate 98-0098Micrococcus sp. OS5Corynebacteriumglucuronolyticumisolate 98-0098Paenibacillusglucanolyticus SP.Cz89Corynebacteriumamycolatum strainNCFB 2768un-ID-ableCellulomonasspp/Microbacterium sppCorynebacteriumseminale ehk C.glucuronolyticumBrevibacteriumCorynebacteriumseminale ehk C.glucuronolyticumCorynebacterium grupp GBrevibacterium spp21

KOKKUVÕTESuguteede mikrofloora on väga keeruline ning mitmekesine ökosüsteem. Selle muutusedvõivad otseselt mõjutada inimeste tervislikku seisundit. Nii mees- kui ka naissuguteedemikrofloora sisaldab sageli mitmeid korüneformseid baktereid. Neid baktereid on peetudosaks inimese normaalsest mikrofloorast. Rutiinsetes mikrobioloogilistes uuringutespööratakse neile vähe tähelepanu ning nende liigilisest koostisest on väga vähe teada.Käesoleva uurimistöö eesmärgiks oligi selgitada mees- ja naissuguteedes sisalduvatekorüneformsete bakterite liigiline koostis.Uuritavateks olid mees-naine paarid, kes pöördusid paari viljatuse kaebusega Tartu ÜlikooliKliinikumi Androloogiakeskusesse ning mehed, kes osalesid kroonilise prostatiidiprospektiivses uuringus (nii kroonilise prostatiidiga mehed kui ka kontrolluuritavad) TartuÜlikooli Kliinikumi Androloogiakeskuses. Isoleeritud korüneformsete bakterite tüvedsamastati sekveneerimismeetodil, kasutades kahte erinevat praimeripaari, ning võrreldi varemläbi viidud biokeemilise samastamise (API meetod) tulemustega.Suguteede korüneformsete bakterite samastamisel kasutati kahte praimeripaari – latterprimers ja broad-range bacterial primers (Adderson et al., 2008), neist viimane andisparemaid tulemusi. Kokkulangevad tulemused sekveneerimise ja biokeemilise samastamisevahel saadi vaid veerandil tüvedest, parim kokkulangevus oli C. seminale osas.Naistel esines 5 erinevat korüneformsete bakterite liiki ja meestel 14 liiki, seega oli liigilinekoostis küllaltki heterogeenne. Kõige sagedasemad liigid olid naistel C. amycolatum ningmeestel C. glucuronolyticum ehk C. seminale ja Corynebacterium minutissimum. Need kaksliiki esinesid nii tervetel kui prostatiidiga meestel. Lisaks leiti prostatiidiga patsientide spermasveel Arthrobacter cumminsii, C. ureicelerivorans, C. aurimucosum, Zimmermannella albaning Dermabacter hominis/Arthrobacter sp. ja tervete meeste spermas Actinomyces neuii, C.amycolatum, C. freneyi, Dermabacter hominis, Brevibacterium lutescens ning C. glutamicum.Prostatiidiga meeste naispartnerite ning kontrolluuritavate naispartnerite võrdlusel osutussuurimaks erinevuseks C. amycolatum’i esinemine neljast neljal prostatiidihaigete meestenaispartneril, samas ei leitud seda liiki tervete meeste partneritelt. Veel leiti naisteltArthrobacter cumminsii, Brevibacterium mcbrellneri, C. seminale, C. minutissimum,Propionibacterium avidum/acnes ning mõned korüne- ja propionibakterid, mis õnnestusmäärata ainult perekonna tasemele. Töö järgmises etapis oleks vajalik nii korüneformsetebakterite kui ka teiste mikroobide kvantitatiivne määramine otse patsiendilt võetudalgmaterjalidest, kasutades mass-sekveneerimismeetodeid.22

SUMMARYSpecies composition of coryneform bacteriain male and female genital tractJulia KuznetsovaThe microbiota of genital tract is a very complex and varied ecosystem. Shifts in thisecosystem may affect the health of the host. Both male and female genital tract microbiotamay consist of different coryneform bacteria. These bacteria have been considered as normalhabitants of human microflora but they may act also as opportunistic pathogens in somecases. Not much attention has been paid to them and we do not know much about thedifferent species inside the genital tract.The aim of this research was to clarify the composition of coryneform bacteria species inmale and female genital tract.The coryneform bacteria originated from the infertile couples as well as the men with orwithout chronic prostatitis consulting Andrology Centre of Tartu University Hospital.Isolated strains were sequenced using 2 different primer pairs and were compared to theresults of biochemical likening carried out before (API Coryne).During sequencing the coryneform bacteria the 2 primer pairs – latter primers and broadrangebacterial primers (Adderson et al., 2008) were used. The last one gave us betterresults.The results between sequencing and API method biochemical likening were coincide only inquarter of cases, the best concurrency was in case of C. seminale.In our research we found out that there were 5 different species of coryneform bacteria in thefemale genital tract and 14 species in the male genital tract. So we may say that the contentwas pretty heterogeneous. The most frequent species were C. amycolatum in women and C.glucuronolyticum (C. seminale) and Corynebacterium minutissimum in men. These twospecies were found in both men’s group, with prostatitis and controls. In addition, from thesperm samples of prostatitis patients we found Arthrobacter cumminsii, C. ureicelerivorans,C. aurimucosum, Zimmermannella alba and Dermabacter hominis/Arthrobacter sp., andfrom the samples of controls Actinomyces neuii, C. amycolatum, C. freneyi, Dermabacterhominis, Brevibacterium lutescens and C. glutamicum.23

The most noticeable difference between the female partners of men with and withoutprostatitis was the occurrence of C. amycolatum – this species was found in all cases offemale partners of prostatitis patients, but it was not found in the genital tract of controls’female partners. Other species found in the female genital tract were Arthrobacter cumminsii,Brevibacterium mcbrellneri, C. seminale, C. minutissimum, Propionibacterium avidum/acnesand some corynebacterium and propionibacterium species that we could appoint only on thelevel of genus.The next step of this reasearch should contain mass sequencing what helps us to determinethe quantity of coryneform bacteria and other microbes using the material taken directly fromthe patients.24

TÄNUAVALDUSEDAvaldan tänu oma juhendajatele dotsent Reet Mändarile, teadur Jelena Štšepetovale ningvaneminsener Viia Kõivule. Tänan abi ja praktiliste nõuannete eest Silver Türki, Tiiu Rööpi,Eleri Lappi, Signe Oolepit ja Agnes Laasimeri. Tänan uuritava materjali kogumiseaeganõudva töö eest Natalja Borovkovat, Margus Punabit, Paul Korrovitsi, Kristo Ausmeest jaKadri Poolakut.Uurimus valmis Eesti Haridus- ja Teadusministeeriumi (sihtfinantseeritav teema Nr.SF0180132s08, teaduskollektsioonide meede 180.1800.1800 art. 4500) ja EAS (grant Nr.EU30200) toel.25

KASUTATUD KIRJANDUS[1] Adderson EE, Boudreaux JW, Cummings JR, Pounds S, Wilson DA, Procop GW, HaydenRT. Identification of Clinical Coryneform bacterial isolates. J Clin Microbiol. 2008Mar;46(3):921-7. Epub 2007 Dec 26.[2] Antonio M. A., Hawes S. E. and Hillier S. L. (1999). The identification of vaginalLactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of womencolonized by these species. J. Infect. Dis. 180, 1950-1956.[3] Bernasconi E, Valsangiacomo C, Peduzzi R, Carota A, Moccetti T, Funke G. Arthrobacterwoluwensis subacute infective endocarditis: case report and review of the literature. ClinInfect Dis. 2004 Feb 15;38(4):e27-31. Epub 2004 Jan 28.[4] Borovkova N, Korrovits P, Ausmees K, Türk S, Jõers K, Punab M, Mändar R. Influenceof sexual intercourse on genital tract microbiota in infertile couples. Anaerobe. 2011Dec;17(6):414-8. Epub 2011 Apr 29.[5] Collins MD, Burton RA, Jones D. Corynebacterium amycolatum sp. nov., a new mycolicacid-less Corynebacterium species from human skin. FEMS Microbiol Lett 1988;49:349-52.[6] Donders G. G. (2007) Definition and classification of abnormal vaginal flora. Best Pract.Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 21 (3), 355-73.[7] de Figueiredo Leite SR, de Amorim MM, Calábria WB, de Figueiredo Leite TN, deOliveira VS, Ferreira Júnior JA, de Alencar Ximenes RA. Clinical and microbiologicalprofile of women with bacterial vaginosis. Rev Bras Ginecol Obstet. 2010 Feb;32(2):82-7.[8] Eady EA, Eileen Ingham. Propionibacterium acnes—friend or foe? Reviews in MedicalMicrobiology (1994) Volume: 5, Issue: 3.[9] Esteban J, Nieto E, Calvo R, Fernández-Roblas R, Valero-Guillén PL, Soriano F.Microbiological characterization and clinical significance of Corynebacteriumamycolatum strains. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (1999) 18 :518–521.26

[10] Funke G, Pünter V, von Graevenitz A. Antimicrobial susceptibility patterns of somerecently established coryneform bacteria. Antimicrobial agents and chemotherapy, Dec.1996, p. 2874–2878 Vol. 40, No. 120066-4804/96/$04.0010[11] Funke G, Graevenitz A, Clarridge JE, Bernard KA. Clinical microbiology of coryneformbacteria. Clinical Microbiology Reviews 1997; 10: 125–159.[12] Haugen TB, Grotmol T. pH of human semen. Int J Androl. 1998 Apr;21(2):105-8.[13] Kermes K, Punab M, Lõivukene K, Mändar R. Anaerobic seminal fluid micro-flora inchronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome patients. Anaerobe. 2003 Jun;9(3):117-23.[14] Knox KL, Holmes AH. Nosocomial endocarditis caused by Corynebacteriumamycolatum and other nondiphtheriae corynebacteria. Emerging Infectious Diseases. Jan2002 Vol. 8, No. 1.[15] Korrovits P, Punab M, Türk S, Mändar R. Seminal microflora in asymptomaticinflammatory (NIH IV category) prostatitis. Eur Urol. 2006 Dec;50(6):1338-44;discussion 1344-6. Epub 2006 May 23.[16] Linhares IM, Giraldo PC, Baracat EC. New findings about vaginal bacterial flora. RevAssoc Med Bras 2010; 56(3): 370-4.[17] McCance KL, Huether SE. Pathophysiology, the biologic basis for disease in adults andchildren. 5th Edition. Mosby, St. Louis. (2006)[18] Montagnini Spaine D, Mamizuka EM, Pereira Cedenho A, Srougi M. Microbiologicaerobic studies on normal male urethra. Urology 2000 Aug 1;56(2):207-10.[19] Pavlova SI, Kilic AO, Kilic SS, So JS, Nader-Macias ME, Simoes JA, Tao L. Geneticdiversity of vaginal lactobacilli from women in different countries based on 16S rRNAgene sequences. J Appl Microbiol. 2002;92(3):451-9.[20] Punab M., Lõivukene K., Kermes K. and Mändar R. (2003b) The limit ofleukocytospermia from the microbiological viewpoint. Andrologia. 35, 271-278.[21] Rehewy MS, Hafez ES, Thomas A, Brown WJ. Aerobic and anaerobic bacterial flora insemen from fertile and infertile groups of men. Arch Androl. 1979 May;2(3):263-8.27

[22] Riegel P, Ruimy R, de Briel D, Prevost G, Jehl F, Bimet F, Christen R, Monteil H.Corynebacterium seminale sp. nov., a new species associated with genital infections inmale patients. Journal of Clinical Microbiology 1995; 33: 2244– 2249.[23] Schwebke JR, Richey CM, Weiss2 HL. Correlation of Behaviors with MicrobiologicalChanges in Vaginal Flora. J Infect Dis. 1999 Nov;180(5):1632-6.[24] Spiegel CA, Amsel R, Holmes KK. Diagnosis of bacterial vaginosis by direct gram stainof vaginal fluid. J Clin Microbiol. 1983 Jul;18(1):170-7.[25] Szöke I., Török L., Dósa E., Nagy E. and Scultéty S. (1998) The possible role ofanaerobic bacteria in chronic prostatitis. Int. J. Androl. 21 (3), 163-8.[26] Zhou X, Bent SJ, Schneider MG, Davis CC, Islam MR, Forney LJ. Characterization ofvaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independentmethods. Microbiology 2004 Aug;150(Pt 8):2565-73.[27] Zhou X, Brown CJ, Abdo Z, Davis CC, Hansmann MA, Joyce P, Foster JA, Forney LJ.Differences in the composition of vaginal microbial communities found in healthyCaucasian and black women. ISME J. 2007 Jun;1(2):121-33. Epub 2007 May 10.[28] Zhou X, Hansmann MA, Davis CC, Suzuki H, Brown CJ, Schütte U, Pierson JD, ForneyLJ. The vaginal bacterial communities of Japanese women resemble those of women inother racial groups. FEMS Immunol Med Microbiol. 2010 Mar;58(2):169-81. Epub 2009Oct 3.[29] Teixeira G, Carvalho F, Arantes R, Nunes A, Moreira J, Mendonça M, Almeida R,Farias L, Carvalho MA, Nicoli J. Characteristics of Lactobacillus and Gardnerellavaginalis from women with or without bacterial vaginosis and their relationships ingnotobiotic mice. J Med Microbiol. 2012 Apr 26. [Epub ahead of print][30] Türk S, Korrovits P, Punab M, Mändar R. Coryneform bacteria in semen of chronicprostatitis patients. International Journal of Andrology 2007; 30: 123–8.[31] Türk S, Kermes K, Lõivukene K, Raukas E, Korrovits P, Punab M, Mändar R. Spermamikrofloora kroonilise prostatiidi korral. Eesti Arst 2010; 89: 83−94.[32] Türk S, Punab M. Mändar R. (2009). Antimicrobial Susceptibility Patterns ofCoryneform Bacteria Isolated from Semen. The Open Infectious Diseases Journal 3: 31-36.28

[33] Vallor AC, Antonio MA, Hawes SE, Hillier SL. Factors associated with acquisition of, orpersistent colonization by, vaginal lactobacilli: role of hydrogen peroxide production. JInfect Dis. 2001 Dec 1;184(11):1431-6. Epub 2001 Oct 30.[34] Valore EV, Park CH, Igreti SL, Ganz T. Antimicrobial components of vaginal fluid. AmJ Obstet Gynecol. 2002 Sep;187(3):561-8.[35] Witkin SS, Linhares IM, Giraldo P. Bacterial flora of the female genital tract: functionand immune regulation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2007 Jun;21(3):347-54.Epub 2007 Jan 9.Kasutatud veebiaadressid[1] http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/115-9.jpg - Jiangnan University Library[2] http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:Corynebacteriumdiphteriae.jpg -MicrobeWiki[3] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.html - Genetic Sequence Database29

LISADLisa 1. PCR’i protokollPCR’i reaktsioon viidi läbi mahus 50 μl, mis sisaldas 5 μl 10x PCR puhvrit, 1.5 mM MgCl 2 ,0.2 desoksünukleosiid-trifosfaadi segu (dATP, dGTP, dTTP and dCTP), 10 μmol mõlematpraimerit, 1,25 U Taq DNA polümeraasi ja 2 μl eraldatud DNA’d. Proovid amplifitseeritikasutades Eppendorf Mastercycler gradientPCR masinat (Eppendorf AG, Hamburg,Germany) järgmistel tingimustel:1. Esmane denaturatsioon 94°C 5 min2. Denaturatsioon 94°C 30 sek3. Praimerite seondumine 50°C 30 sek4. Ekstensioon 72°C 1 min5. Korrata alates 2. punktist 34 tsüklit6. Lõppekstensioon 72°C 5 min7. Hoida 4°C juures Joonis 3. PCR’i produktide geelelektroforees*Kokku tehti 35 tsüklit. Seejärel kanti PCRi produktid etiidiumbromiidi (0.1 μl/ml) sisaldavale1,2% agaroosgeelile ning lisati 1 kb suurusmarker (Fermentas, Leedu). Forees toimuskonstantse 150 V pinge juures, saadud mustreid võrreldi ultraviolettvalguses.*Joonisel 3 on märgitud latter praimeritega läbi viidud PCR’i reaktsiooni produktid geelil 1 kb suurusmarkeriga.30