Susanna Tamman

TARTU ÜLIKOOLArstiteaduskondMikrobioloogia instituutSUSANNA TAMMANKlebsiella pneumoniae epidemioloogiline genotüpiseeriminemultiensüüm-multipleks AFLP-PCR meetodilBakalaureusetööJuhendaja MP Kristi HuikTARTU 2008

SisukordLühendid ja mõisted ...................................................................................................................3Sissejuhatus ................................................................................................................................41 Kirjanduse ülevaade ................................................................................................................51.1 Klebsiella spp. üldiseloomustus .......................................................................................51.1.1 Morfoloogia ja füsioloogia ........................................................................................51.1.2 Perekond Klebsiella liigid .........................................................................................51.1.3 Perekond Klebsiella levik..........................................................................................61.2 Klebsiella pneumoniae .....................................................................................................61.2.1 Klebsiella pneumoniae ja haiglainfektsioonid...........................................................61.2.2 Patogeensusfaktorid...................................................................................................7Kapsel .............................................................................................................................7Fimbriad .........................................................................................................................81.3 Klebsiella pneumoniae antibiootikumiresistentsus ..........................................................91.3.1 β-laktaam-antibiootikumid ........................................................................................91.4 Klebsiella pneumoniae tüpiseerimismeetodid................................................................101.4.1 Seroloogiline tüpiseerimine.....................................................................................111.4.2 Pulssvälja geelelektroforees (PFGE).......................................................................121.4.3 PCR (ing. k. Polymerase Chain Reaction) põhised tüpiseermismeetodid ..............131.5 Klebsiella pneumoniae Eestis.........................................................................................172 Eksperimentaalosa.................................................................................................................182.1 Eesmärgid .......................................................................................................................182.2 Materjal ja metoodika.....................................................................................................192.2.1 Tüvede isoleerimine ja säilitamine..........................................................................192.2.2 Bakteritüvede samastamine .....................................................................................192.2.3 Bakteriaalse DNA molekulaarne tüpiseerimine pulssvälja geelelektroforeesimeetodil ............................................................................................................................202.2.4 Bakteriaalse DNA molekulaarne tüpiseerimine multiensüüm-multipleks AFLP-PCR meetodil....................................................................................................................202.3 Tulemused ja arutelu ......................................................................................................232.3.1 Isoleeritud tüved ......................................................................................................232.3.2 PFGE .......................................................................................................................242.3.3 Multiensüüm-multipleks AFLP-PCR......................................................................242.3.4 Patsientide koloniastsioon .......................................................................................272.4 Järeldused .......................................................................................................................29Kokkuvõte ................................................................................................................................30Summary...................................................................................................................................31Kasutatud kirjandus ..................................................................................................................322

Lühendid ja mõistedAFLP — PCR-põhine tüpiseerimismeetod (ing. k. Amplified Fragment LengthPolymorphism)ATCC — Ameerika tüüpkultuuride kollektsioon (ing. k. American Type CultureCollection)ERIC-PCR — Tüpiseerimismeetod (ing. k. enterobacterial repetitive intergenicconsensus sequence PCR)ESBL — Laienenud spektriga β-laktamaas (ing. k. Extended Spectrum β-Lactamase),β-laktaamantibiootikume inhibeeriv ensüüm.Hospitaalinfektsioon — haiglanakkus, patogeenide haiglasisene kandumine üheltpatsiendilt teiselePCR-RFLP — PCR-põhine tüpiseerimismeetod (ing. k. PCR-restriction fragmentlength polymorphism)PFGE — Pulssvälja geel-elektroforees (ing. k. Pulsed Field Gel Electrophoresis).Genoomide tüpiseerimismeetodPuhang — nakkushaiguse suurenenud esinemissagedus spetsiifilises kohas teatudperioodilRAPD — PCR-põhine tüpiseerimismeetod (ing. k. random amplification ofpolymorphic DNA)REP-PCR — PCR-põhine tüpiseerimismeetod (ing. k. repetitive extragenicpalindromic sequence-based PCR)3

SissejuhatusKlebsiella pneumoniae on tinglik patogeen hõimkonnast Enterobacteraceae, miskuulub inimeste normaalsesse mikrofloorasse, kuid põhjustab raskeid ja sageli surmagalõppevaid infektsioone nõrgestatud immuunsüsteemiga inimestel. Kõige suurem tõenäosus K.pneumoniae infektsiooni tekkeks on haiglates, eriti intensiivraviosakondades. Peamisteksriskigruppideks K. pneumoniae nakkusele peetakse väga vanu ja väga noori patsiente,tõsiseim on probleem vastsündinute intensiivraviosakondades.Kuna paljud K. pneumoniae tüved on saavutanud resistentsuse üldkasutatavatele laiatoimespektriga antibiootikumidele, siis soodustab antibiootikumiraviintensiivraviosakondades viibivatel patsientidel veelgi vastuvõtlikkust K. pneumoniae’le jatõenäosust haiglasiseste eksogeensete nakkuste ehk hospitaalinfektsioonide levikuks.Hospitaalinfektsioonide uurimiseks kasutatakse mikroobide genotüpiseerimist, misvõimaldab eristada haigustekitaja tüvesid. Haiglakeskkonnast võetud proovidegenotüpiseerimise tulemusena on võimalik kindlaks määrata puhanguid põhjustavate tüvedereservuaare ja ülekandjaid.Kuna K. pneumoniae genotüpiseerimine kõige üldisemalt kasutataval pulssvälja geelelektroforeesimeetodil on ajakulukas ja tehniliselt keeruline, oli käesoleva töö eesmärgiksoptimeerida multiensüüm-multipleks (multienzyme multiplex) AFLP meetodit, mida seniEestis kasutatud ei ole. Nimetatud meetod hõlbustab Klebsiella põhjustatudhospitaalinfektsioonide epidemioloogilist uurimist, võimaldab tüvede haiglasisese ülekandekiiremat avastamist ja seetõttu ka edukamat puhangute ennetamist või mahasurumist. Lisakseelnimetatule uuriti K. pneumoniae kolonisatsiooni ja erinevate tüvede levikut Tallinnavastsündinute intensiivraviosakonda sattunud lastel.4

1.1.3 Perekond Klebsiella levikKlebsiella on looduses laialt levinud: neid leidub taimedel, pinnases ja vees ningimetajate normaalses mikroflooras (Podschun ja Ullmann, 1998).Perekonna Klebsiella esindajad on, erinevalt teistest enterobakteritest, võimelisedfikseerima molekulaarset lämmastikku ning neid võib leida elamas sümbioosismitteliblikõieliste taimedega. Mullast ja taimedelt isoleeritud tüved erinevad inimestelimaskesti koloniseerivatest tüvedest kapsli ehituse poolest, millest tulenevalt ei ole nadpatogeensed. Samas vees elavatel K. pneumoniae esindajatel on näidatud, et sarnaseltkliiniliste isolaatidega, on nad võimelised ekspresseerima virulentsusfaktoreid (Podschun jt.,2001).1.2 Klebsiella pneumoniaeSugukonna Enterobacteriacea liigid võivad põhjustada inimestel mädaseid põletikke,kopsupõletikku, ajukelmepõletikku, veremürgitusi ning haavade, soolestiku- ja kuseteedeinfektsioone. Klebsiella perekonna liigid põhjustavad 6–17% kõigist kuseteedeinfektsioonidest, 7–14% pneumooniatest, 4–15% septitseemiatest, 2–4%haavainfektsioonidest ja 4–17% intensiivravi osakondades esinevatest haiglanakkustest ning3–20% vastsündinute septitseemiatest (Podschun ja Ullmann, 1998). Ajukelmepõletikud javeremürgitused on enamasti tekkinud haiglas ja võivad olla letaalse lõppega (Murray, 2007).Perekonna Klebsiella esindajatest on kliiniliselt kõige olulisem K. pneumoniae(Brisse, 2004). Kui veel kümmekond aastat tagasi oli just see liik domineeriv keskkonnastsaadud kopsunakkuste põhjustajana, siis hilisemad uuringud on näidanud, et näiteks USA-son K. pneumoniae osakaal hospitaliseerimist vajavate kopsuhaiguste põhjustajate hulgasvähenenud alla 1%. Näiteks Lõuna-Aafrikas ja Taivanis on keskkonnast saadud Klebsiellapneumoniae nakkused (eriti alkohoolikute seas) endiselt tõsine probleem (Ko jt., 2002).1.2.1 Klebsiella pneumoniae ja haiglainfektsioonidKui keskkonnast saadud Klebsiella pneumoniae infektsioonide osakaal väheneb, siishaiglanakkuste põhjustamises on see liik maailmas domineeriv. Kõigist bakteriaalsetesthaiglainfektsioonidest Euroopas ja USA-s on 8% juhtudest põhjustajaks Klebsiella spp.,6

valdaval enamusel juhtudest on põhjustajaks just K. pneumoniae, tunduvalt vähemal määralon kliinilistest proovidest eraldatud K. oxytoca’t (Podschun ja Ullmann, 1998).Tingliku patogeenina on K. pneumoniae kõige ohtlikum nõrgenenudimmuunsüsteemiga inimestele. Riskifaktoriteks peetakse diabeeti, vähkkasvajaid ja kroonilistalkoholismi (Hansen jt., 2002). Lisaks nimetatule moodustavad omaette riskigrupivastsündinud, eriti suureks probleemiks on K. pneumoniae poolt põhjustatudhospitaalinfektsioonid vastsündinute intensiivravi osakondades (Podschun ja Ullmann, 1998).Klebsiella kolonisatsioonimäär kasvab proportsionaalselt patsientide haiglas viibimiseajaga. Kuna laia toimespektriga või mitme erineva antibiootikumi kooskasutamine on tihtimultiresistentsete Klebsiella tüvede väljaselekteerumise põhjuseks, peetakse justantibiootikumide kasutamist Klebsiella tüvede laialdase haiglasisese leviku põhjustajaks(Podschun ja Ullmann, 1998).Kuigi Klebsiella puhangute võimalikke põhjustajaid ja koldeid on erinevates haiglatesolnud mitmeid, on peamiseks ülekandjaks siiski haiglapersonal ning nakkuse koldekskoloniseerunud patsientide seedetrakt. (Gupta, 2004; van’t Veen, 2005). Seega on esmasekshaiglanakkuse ennetamise võimaluseks käte desinfitseerimine. Lisaks sellele soovitatakseülekande vältimiseks põetajate käte vahendusel eraldada nakatunud patsiendid tervetest.Klebsiella võib siseneda inimese organismi kateetrite ja veenisiseselt manustatavate vedelikekaudu, seega on haiglanakkuste ärahoidmiseks vajalik puhtus ja kateetrite piisavalt sagedanevahetus (Podschun ja Ullmann, 1998).1.2.2 PatogeensusfaktoridKlebsiella pneumoniae virulentsusfaktoriteks on kapsli polüsahhariidid,lipopolüsahhariidid, fimbriad ja raua hankimise süsteem. Kõige olulisemad neist on tüüp 1fimbriad, millel on tähtis roll peremehe algsel kolonisatsioonil, ja kapsli polüsahhariidid, mistöötavad barjäärina antibakteriaalsete reaktsioonide vastu, nagu näiteks fagotsütoos (Lai jt.,2000).KapselKlebsiella kapsli vajalikkust tema virulentsuse säilitamiseks näidati juba 1928. aastal,tõestades, et kapsel on vajalik märadel emakapõletiku tekitamiseks. Kapsel koosneb põhiliselt7

hüdrofiilsetest polüsahhariidsetest struktuuridest, mis kaitsevad bakterit fagotsütoosi jabakteritsiidsete seerumifaktorite eest (Podschun ja Ullmann, 1998).K. pneumoniae kapsel on keskmiselt 160 nm paksune ja koosneb kahest tihedaltpakitud polüsahhariidsest kihist. Kapsli sisemise poole kiud moodustavad tiheda ja hapra kihi,kus tihedad kimbud on välismembraani poolt vaadatuna kaldunud paremale, välimisel poolelmoodustavad kiud võrgutaolise struktuuri (Amako jt., 1988).On näidatud, et kapsli polüsahhariidsest koostisest sõltub tüvede patogeensus ningselle põhjuseks peetakse kapsli mannoosisisaldust, kuna makrofaagid tunnevad ära mannoosα-2/3-mannoosstruktuure ja aktiveerivad sellega fagotsütoosi (Brisse jt., 2004). Kapslitüübid,mis neid struktuure ei sisalda, on seetõttu patogeensemad, sest neid makrofaagid ära ei tunne(Yu jt., 2007). Leidub ka vähesel määral ilma kapslita tüvesid, mille patogeensus on teistegavõrreldes madalam (Schembri jt., 2005).FimbriadFimbriad ehk pilid on kuni 10 µm pikad, diameetriga 1 kuni 11 nm, polümeersest valgustpiliinist koosnevad struktuurid, mille molekulmass on 15 kuni 26 kDa. Klebsiella perekonnalesineb peamiselt kahte tüüpi fimbriaid:1) Tüüp 1 fimbriad on K. pneumoniae’l laialt levinud, sidudes peremehe glükoproteiinideküljes olevaid mannoose sisaldavaid trisahhariide. Need on olulised esmasel peremehekolonisatsioonil, olles vajalikud kinnitumiseks limas- või epiteelkoe rakkudeleurogenitaal-, respiratoor- ja seedetraktis.2) Tüüp 3 fimbriad vahendavad seondumist inimese kopsukudedele, seondudes valkudeleepiteelirakkude välispinnal(Lavender jt., 2005), ning vahendavad biofilmimoodustumist algsel kolonisatsioonil (Langstraat jt., 2001).Tüüp 1 fimbriaid peetakse kapsli kõrval kõige olulisemaks patogeensusfaktoriks K.pneumoniae’l, kuid uuringutes on näidatud, et kapsli olemasolu pärsib tüüp 1 fimbriatefunktsioneerimist. Kuna fimbriaid esineb võrdsel hulgal nii kapsliga kui kapslita tüvedel, siiskapsli pärssiv efekt fimbriate tööle ei seisne mitte valkude sünteesi mõjutamises, vaid pigemfüüsilises takistamises (Schembri jt., 2005).8

1.3 Klebsiella pneumoniae antibiootikumiresistentsus1.3.1 β-laktaam-antibiootikumidAntibiootikumid on elusorganismide (bakterite või seente) poolt produtseeritavad ained, mispidurdavad teiste mikroobide kasvu või surmavad neid ning pole terapeutilistes doosidesperemeesorganismile kahjulikud. Keemilise koostise järgi jaotatakse antibiootikumid 12rühma. Klebsiella pneumoniae nakkuse raviks kasutatakse β-laktaam-antibiootikume(Mikelsaar ja Karik, 1998).β-laktaam-antibiootikumide alla kuuluvad penitsilliinid, tsefalosporiinid,monobaktaamid ja karbapeneemid. Nende toime seisneb mikroobi rakuseinas peptidoglükaanisünteesi pärssimises, aktiveerides sellega rakuseinaga seotud hüdrolaasid, mis lõhustavadrakuseina peptidoglükaani. Protsessi tagajärjel tekivad rakuseinata protoplastid ning rakudlüüsuvad osmoosi tõttu (Mikelsaar ja Karik, 1998).1) Penitsilliinid on β-laktaamringi sisaldavad looduslikud või poolsünteetilisedantibiootikumid. Nad seostuvad transpeptidaasiga ja pidurdavad selle aktiivsust,mille tõttu sünteesitud peptidoglükaan ei ühine rakuseinaga, vaid väljutataksebakteri rakust lahustuva osana. Laienenud spektriga β-laktamaasid (ESBL, ing k.extended-spectrum β-lactamases) inaktiveerivad kõiki penitsilliine(Mikelsaar jaKarik, 1998).2) Tsefalosporiinid mõjuvad bakteritsiidselt nii Gram-positiivsetele kui Gramnegatiivsetelemikroobidele. Erinevatest külgahelatest sõltuva antimikroobseaktiivsuse järgi jaotatakse nad I, II, III ja IV põlvkonna tsefalosporiinideks. IIIpõlvkonna tsefalosporiinid on laia toimespektriga ning neid on kasutatud K.pneumoniae vastases ravis, kuid ESBL tootvad tüved inaktiveerivad ka IIIpõlvkonna tsefalosporiine. IV põlvkonna tsefalosporiin tsefepiim on resistentne β-laktamaasidele ning teda on võimalik kasutada ESBL tootva K. pneumoniaeinfektsiooni raviks (http://www.merck.com)3) Monobaktaamid ja karbapeneemid on eriti laia toimespektriga ja väga resistentsedβ-laktamaasidele (Mikelsaar ja Karik, 1998). Paljud multiresistentsed bakterid ontundlikud ainult karbapeneemidele, kuid tekkinud on ka neile antibiootikumideleresistentseid tüvesid (http://www.merck.com) ESBL tootvad Klebsiella tüved ontundlikud imipeneemile ja meropeneemile (Podschun ja Ullmann, 1998).9

Laia toimespektriga tsefalosporiinide kasutuselevõtt tõi algselt kaasa läbimurde Gramnegatiivsetebakterite poolt põhjustatud raskete infektsioonide ravis (Liu jt., 1998). Nendejärjest laienev kasutamine aga on põhjustanud resistentsete bakteritüvede esilekerkimise.K. pneumoniae resistentsust laia toimespektriga tsefalosporiinidele kirjeldatiesmakordselt juba 1983. aastal (Knothe jt., 1983). Resistentsust ilmutavatel isolaatidel ontäheldatud laienenud spektriga β-laktamaaside tootmist. Enamasti on resistentusgeenidekandjateks plasmiidid, mis on võimelised liikuma Enterobacteriaceae sugukonna erinevateliikide vahel (Podschun ja Ullmann, 1998). Tihtipeale paiknevad need geenidtransposoonides, lihtsustades veelgi nende bakteritevahelist ülekannet (Tumbarello jt., 2005).Multiresistentseid plasmiide sisaldavad tüved tekivad resistentsusgeenide kuhjumiselrakkudesse, mis omakorda viib multiresistentsete tüvede tekkimisele. Selliste tüvedetekkimise võimalus suureneb proportsionaalselt patsiendi haiglasviibimise ajaga jainvasiivsete protseduuride rohkusega (Podschun ja Ullmann, 1998).Laienenud spektriga β-laktamaase tootva K. pneumoniae puhangute arv ning nakkustesurmaga lõppemise osakaal intensiivravi osakondades, ka vastsündinute intensiivraviosakondades, on aja jooksul aina kasvanud (Gupta, 2004). Nimetatud puhangud on sagedasedkõikjal maailmas, kuigi nende iseloom varieerub regiooniti. (Tumbarello jt., 2005). Inglismaalja Prantsusmaal läbi viidud uuringud näitavad, et 14–16% haiglatest isoleeritud K.pneumoniae tüvedest toodavad ESBL (Sirot jt.,1992; Liu jt., 1992).Kõige edukamalt on ESBL tootva Klebsiella pneumoniae baktereemiaga patsientideravis kasutatud tsiprofloxatsiini ja karbapeneeme (Kang jt., 2004; Paterson jt., 2004).1.4 Klebsiella pneumoniae tüpiseerimismeetodidMikroobitüvede tüpiseerimisel on võimalik uurida1) teatud perioodil kogutud epidemioloogiliselt seotud tüvede geneetilist sugulust;2) haiguspuhangut põhjustavate tüvede hulka.Tüvede tüpiseerimine põhineb eeldusel, et epidemioloogilselt mitteseotud tüvedel onerinev genotüüp ja seotud tüvedel on sarnane genotüüp (Tenover jt. 1995). Patogeenidetüpiseerimine ja kloonide kindlakstegemine on oluline haiglanakkuste avastamiseks japeatamiseks, võimaldades kindlaks teha epidemioloogiliste tüvede reservuaare ja nakkuseülekandjaid (Bingen jt. 1993).10

Mikroobide tüpiseerimise kvaliteet sõltub tehnoloogia valikust ja eksperimenditulemuste tõlgendamisest. Meetod peab olema korratav ja piisavalt kõrge eristamisvõimega,tulemuste tõlgendamine peab olema lihtne ja ühene (Bingen jt. 1993).1.4.1 Seroloogiline tüpiseerimineSerotüpiseerimine on Klebsiella spp. tüpiseerimisele spetsialiseerunudlaboratooriumides kõige laiemalt levinud meetod, põhineb tüvede eristamisel kapsliantigeenide (K-antigeenide) baasil. Erinevaid K-antigeene on kirjeldatud 82, neist 77kasutatakse seroloogilisel tüpiseerimisel (Podschun ja Ullmann, 1998). Meetod põhinebantigeen-antikeha reaktsioonil ning selle läbiviimisel kasutatakse erinevat antiseerumit igaerineva kapslitüübi suhtes.K-antigeenide põhjal serotüpiseerimist on kasutatud alates 1920-ndatest aastatestKlebsiella isolaatide tüpiseerimiseks. Meetodi kõrge eristamisvõime tõttu annab ta võimaluseerinevatel ajahetkedel ja erinevatest kohtadest isoleeritud tüvede võrdlemiseks, ka võimaldabserotüpiseerimine vahet teha K. pneumoniae alaliikidel (Brisse jt., 2004).K-serotüpiseerimise eeliseks on serotüpiseerimise tulemusel saadav lisateavevirulentsuse kohta, kuna K. pneumoniae virulentsus sõltub kapslitüübist. Näiteks serotüübidK1 ja K2 on kõige virulentsemad, K7 ja K21 virulentsuse tase on võrreldes teisteserotüüpidega madalam (Brisse, 2004).Kapslitüüpidel võib esineda mitmeid vahevorme, mille tõttu serotüpiseerimine ei annaalati ühest tulemust. (Podschun ja Ullmann, 1998). Ka ei ole kõik Klebsiella tüved sel viisilidentifitseeritavad: erinevatel andmetel 8-23% Klebsiella tüvedest serotüpiseerimisel vastustei anna, seda juhul, kui neil esinevad K-antigeenid ei kuulu kasutatavate 77 hulka või tegemiston ilma kapslita tüvedega. Lisaks sellele on meetodi kasutamine aeganõudev ning tulemusedei ole alati üheselt interpreteeritavad (Brisse jt., 2004).Kuigi Klebsiella spp. on kirjeldatud ka 9 tüüpi O-antigeene (raku pinnapolüsahhariidid), kasutatakse neid serotüpiseerimisel harva, kuna nende määramise muudabkeeruliseks kapslite temperatuurikindlus ning erinevate serotüüpide vähese arvu tõttu oneristamisefektiivsus madal (Podschun ja Ullmann, 1998).O- ja K-serotüpiseerimise kombineerimisel on võimalik saavutada paremateristatavust kui K-serotüpiseerimisel, sest O-antigeenide põhjal on võimalik K-serotüüpe11

erinevatesse gruppidesse jagada ning seega võimendada tüvede eraldatavust (Hansen jt.,2002).1.4.2 Pulssvälja geelelektroforees (PFGE)PFGE on genoomi makrorestriktsiooni fragmentide analüüs, mis on saanud Klebsiellapneumoniae tüpiseerimisel põhimeetodiks. Meetod põhineb lihtsustatud kromosomaalseterestriktsioonifragmentide mustri tekitamisel. Restriktaasiga, K. penumoniae puhul enamastiXbaI, lõigatakse DNA võrdlemisi pikkadeks lõikudeks, mis eraldatakse spetsiaalseteelektroforeetiliste protseduuridega. 120 0 C nurga all paiknevate elektroodide abil tekitatakseelektriväli, voolu suunda muudetakse teatud ajavahemiku järel nii et DNA fragmendidliiguvad geelil otsejoones, kõrvalekaldeta. Meetod võimaldab eraldada fragmente suurses 200kbp kuni 12 Mbp.Bakteri DNA analüüsil PFGE meetodiga on kolm põhilist kasutuseesmärki:1) kromosoomi füüsilise kaardi koostamine;2) varem kloonimata lookusesse inserteeritud transposoonide kaardistamine;3) bakterite epidemioloogiline uurimine.PFGE analüüsi teostamiseks on vajalik tervikliku DNA-ahela olemasolu. Seetõttutraditsioonilised DNA eraldamise meetodid ei ole sobilikud, kuna põhjustavad DNAlagunemist. DNA isoleerimise käigus paigutatakse bakterirakud agaroosblokkidesse ninglüüsitakse blokkide töötlemisel ensüümide ja detergentidega, mille tulemusel DNA seotaksegeeli, teised rakukomponendid aga eemaldatakse (Tenover jt.,1995) Seejärel viiakse läbigeelelektroforees ning tüved eristatakse restriktsioonimustrite põhjal vastavalt kindlatelekriteeriumitele (Tabel 1).Tabel 1. PFGE analüüsi kriteeriumid restriktsioonifragmentide arvu alusel.Erinevus restriktsioonifragmentidearvus≤ 3 fragmentiTüvede sugulusasteSama tüvi4–6 fragmenti Tüved on suguluses≥ 7 fragmentiTüved ei ole omavahel suguluses12

PFGE on hea eristamisefektiivsuse ja korratavusega, kuid läbiviimise suure ajakuluning tehnilise keerukuse tõttu on see meetod edukalt kasutatav eelkõige väikse hulga proovidevõrdlemisel (Cartelle, 2004).1.4.3 PCR (ing. k. Polymerase Chain Reaction) põhised tüpiseermismeetodidPCR-l põhinevate tüpiseerimismeetodite eeliseks on nende kiirus ja vajadus vaidväikese hulga DNA järele. Meetodeid on katsetatud mitmeid, kuid ükski neist pole veelüldkasutatavaks kujunenud.PCR-RFLP (ing. k. PCR-restriction fragment length polymorphism)RFLP analüüsil amplifitseeritakse PCR abil kindel lookus bakteri genoomist, midaseejärel töödeldakse restriktaasidega. Saadud DNA lõigud eraldatakse agaroosgeelelektroforeesilning visualiseeritakse etiidiumbromiidi abil (Olive ja Bean, 1999).Nimetatud meetodi läbiviimine ei ole ajakulukas, tüvede eristamise võime on hea jastandardiseeritud tingimustes on tulemused hästi korratavad. Probleeme tekitab agarestriktsioonimustrite interpreteerimine, raskendades laboratooriumidevahelist teabevahetust(van Belkum jt., 2007).RAPD (ing. k. random amplification of polymorphic DNA)RAPD põhineb lokaalsete järjestuste polümorfismil, mis on seotud korduvatemotiividega bakteri genoomis, ning sobib seetõttu eelkõige esmaseks uuringuks sarnastetüvede kindlakstegemisel. Uuringul kasutatakse lühikesi, 9 kuni 10 nukleotiidi pikkuseidpraimereid, mis ei ole disainitud genoomi konkreetsete piirkondade jaoks. (Olive ja Bean,1999)RAPD läbiviimiseks ei ole vaja eelnevat informatsiooni bakteri genoomi kohta egaspetsiaalselt valmistatud praimereid ning tüvede eristamisvõimelt ei jää see meetod allaPFGE-le. RAPD peamiseks negatiivseks küljeks on tema halb korratavus (Cartelle jt., 2004),mis on tingitud ebaspetsiifilisusest praimerite seondumisel (Olive ja Bean, 1999).13

REP-PCR (ing. k. repetitive extragenic palindromic sequence-based PCR) ja ERIC-PCR (ing.k. enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR)1991. aastal kirjeldas Versalovic kaastöötajatega meetodit bakterigenoomidetüpiseerimiseks läbi tüvedele spetsiifiliste mustrite, mis saadakse DNA korduvelementideülespaljundamisel PCR meetodil. Tüpiseerimiseks kasutatakse peamiselt kahte tüüpikorduvelemente — REP (repetitive extragenic palindromic) elemente ja ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus) elemente. REP-PCR ja ERIC-PCR meetodipuhul kasutatakse vastavalt REP- või ERIC-elementidega seonduvaid praimereid ningamplifitseeritakse vastavalt kahe REP või kahe ERIC elemendi vaheline DNA piirkond(Versalovic jt., 1991).REP elemendid on 38 aluspaari pikkused tugevalt konserveerunud DNA lõigud, millejärjestuses on kuus täielikult degenereerunud positsiooni ning mis on enterobakterite hulgaslaialdaselt levinud.ERIC elemendid on 126 aluspaari pikkused järjestused DNA mittekodeerivas osas,mis sisaldavad tugevalt konserveerunud pöördkordusjärjestusi.REP ja ERIC põhinevate meetodite eeliseks on nende lihtsus ja kiirus, samuti üliheakorratavus. Klebsiella pneumoniae erinevate tüvede eristamise suhtes on tundlikum ERIC-PCR, REP-PCR tundlikkus on madalam. (Cartelle jt., 2004). Ka on neid meetodeid lihtnestandardiseerida, võimaldades seega erinevate laboratooriumide vahelist teabevahetust (Oliveja Bean, 1999).PCR-AFLP (ing. k. amplified fragment length polymorphism)AFLP meetodi töötas välja Vos kaastöötajatega 1995. aastal. Algselt kasutati sedameetodit taimegenoomide kirjeldamiseks, kuid üha enam on ta kasutusele võetud ka bakteriteuurimises. AFLP põhineb kogu genoomist saadud restriktsioonifragmentide selektiivselpaljundamisel PCR abil. Meetod koosneb kolmest etapist:1) DNA restriktsioon ja oligonukleotiidsete adapterite ligeerimine lõikekohtadesse;2) restriktsioonifragmentide selektiivne paljundamine PCR-il;3) paljundatud fragmentide analüüs geelelektroforeesil.Selektiivseks amplifikatsiooniks kasutatakse praimereid, mis seonduvad adapterile,restriktsioonisaidist alles jäänud nukleotiididele ja ulatuvad mõne nukleotiidi võrra14

estriktsioonifragmentidesse. Selle meetodi abil on võimalik analüüsidarestriktsioonifragmente PCR-il, omamata eelteadmisi DNA järjestuse kohta. Ka võimaldabsee meetod paljude erinevate restriktsioonifragmentide samaaegset amplifikatsiooni (Vos jt.,1995).AFLP analüüsiks kasutatakse tavaliselt kahte restriktaasi, millest üks lõikab keskmiseja teine kõrge sagedusega. Adapterid, mis restriktsioonifragmentidele lisatakse, disainitaksenii, et ligeerimisel ei saa taastekkida restriktsioonisaiti. See võimaldab restriktsiooni jaligeerimist läbi viia üheaegselt (Vos jt., 1995).Praimerid, mis PCR-il kasutatakse, on adapteritele spetsiifilised, kuid nende 3’ otsason ühe kuni kolme nukleotiidi pikkune lisa, mistõttu on restriktsioonifragmentideamplifikatsioon selektiivne (Vos jt., 1995).Saadud fragmendid eraldatakse elektroforeesil polüakrüülamiidgeelil. Selliselmeetodil saadud mustrid võimaldavad eristada bakteritüvesid, kuna saadud fragmentidepikkust ja hulka mõjutavad kolme tüüpi mutatsioonid bakteri genoomis:1) mutatsioonid restriktaaside lõikesaitides;2) mutatsioonid piirkondades, mis külgnevad restriktsioonisaitidega ning onkomplementaarsed praimerite pikendustega;3) restriktsioonifragmentide sisesed insertsioonid ja deletsioonid.AFLP on võrreldes teiste PCR-põhinevate meetoditega, nagu näiteks RFPL ja RAPD,paremini korratav, sest PCR-il kasutatav praimerite seondumistemperatuur on teistemeetoditega võrreldes tunduvalt kõrgem, suurendades seega spetsiifilisust (Savelkoul jt.,1999).Eristamisvõime on AFLP analüüsil väga hea, sest analüüsiks kasutatakse bakterigenoomi kogu ulatuses. Tänu kasutatavate praimerite disainile on meetod tundlikmutatsioonidele restriktsioonisaitides, restriktsioonisaitidele järgnevates nukleotiidides ninginsertsioonidele ja deletsioonidele restriktsioonisatide vahele jäävates piirkondades (Savelkouljt., 1999).AFLP läbiviimiseks on vaja ainult väike hulk DNA-d, mis peab küll olema puhas jakaheahelaline, kuid mille kindel kontsentratsioon ei avalda eriti mõju lõpptulemustele. Sellemeetodi ainsaks suuremaks miinuseks on restriktsioonifragmentide arv, mis tõstab külleristamisvõimet, kuid raskendab tulemuste analüüsi. (Savelkoul jt., 1999).15

Restriktsioonifragmentide analüüsiks agaroos-geelelektroforeesil kasutatakse AFPLmodifikatsiooni ainult ühe restriktaasi ja ühe praimeriga. Selle meetodiga saadud tulemusedvõivad aga sõltuda elektroforeesi kvaliteedist, erinevast katse teostajast ja fragmentidemääramise subjektiivsusest (van der Zee jt., 2002).Multiensüüm-multipleks (Multienzyme Multiplex) PCR-AFLP2002. aastal töötas van der Zee kaastöötajatega välja AFLP modifikatsiooni, kuskasutatakse nelja erinevat restriktaasi ja kaheksat praimerit, suurendades erineva pikkusegafragmentide hulka, kuid võimaldades nende lahutamist agaroos-geelelektroforeesil. Suuremahulga restriktaaside ja praimerite kasutamisel on kaks peamist eesmärki:1) optimeerida eristamisvõimet võrreldes ühte praimerit ja ühte restriktaasi kasutavameetodiga;2) lihtsustada tulemuste analüüsi ja vähendada subjektiivsust.Meetod on hea korratavusega, mis on tingitud kõrgetest praimeriteseondumistemperatuuridest ja seega PCR-i spetsiifilisusest, ja tüvede eristamise võimega.Nelja erineva restriktaasi kasutamine, millest kaks tunnevad ära võrdlemisi GC-rikkaid jakaks AT-rikkaid piirkondi, suurendab fragmentide hulka ja restriktsioonimustritekomplekssust, tõstes meetodi eristamisvõimet, kuid muutes teisalt vajalikuks spetsiaalsetearvutiprogrammide kasutamise tulemuste analüüsil (van der Zee jt., 2002). AFLPrestriktsioonimustrite alusel tüvede eristamise kriteeriumid on toodud tabelis nr 2.Tabel 2. Tüvede eristamine AFLP restriktsioonimustrite homoloogsuse põhjalHomoloogsusTüvede sugulusaste90–100% Sama tüvi60–90% Sama liik, erinevad tüved40–60% Sama perekond, erinevad liigid

1.5 Klebsiella pneumoniae EestisNagu mujal maailmas on Klebsiella pneumoniae ka Eestis üks levinumaidkopsupõletike (Leesik jt., 2006) ja uroinfektsioonide (Grünberg jt., 2005) ning haiglanakkustepõhjustajaid. Intensiivraviosakondades on K. pneumoniae levikult teisel kohal Enterobactersp. järel, moodustades kõigist patogeenidest 12%, lasteintensiivravi osakondades domineeribenterobakterite seas just K. pneumoniae: Tartus 23% ja Tallinnas 19% (Lõivukene jt., 2004).Kõige tõsisemat probleemi kujutab K. pneumoniae suuremates haiglates, mis tegelevad koguteeninduspiirkonna keerukamate haigusjuhtumitega (Lõivukene jt., 2005)Eesti haiglate intensiivravi osakondades on järjest tõsisemaks probleemiks muutunudK. pneumoniae ESBL tootvad tüved, mis on tõenäoliselt tingitud laiema spektrigaantibiootikumide kasutamisest. On näidatud, et 2004. aastal 23% kõigist isoleeritud K.pneumoniae tüvedest tootsid laienenud spektriga β-laktamaase. (Sepp jt., 2003; Karki, 2004).Üldiselt on Eestis levinud Gram-negatiivsed patogeenid antibiootikumi-tundlikumadkui mujal Ida-Euroopa riikides. Eestisiseselt bakterite antibiootikumitundlikkus varieerubpiirkonniti, sõltudes haigla suurusest, intensiivraviosakondade olemasolust,hospitaalinfektsiooni teenistuse efektiivsusest ja antibiootikumide kasutamisest (Lõivukenejt., 2005).K. pneumoniae leviku uurimiseks on Eestis siiani kasutatud pulssvälja geelelektroforeesi,kuid selle meetodi läbiviimise keerukus ja aja kulu muudavad selle kasutamisehospitaalinfektsioonide epidemioloogia uurimisel väheefektiivseks. Kuna K. pneumoniaeohtlikkus tänapäeval on seotud just haiglainfektsioonidega, on epidemioloogiliste uuringuteläbiviimise kiirus oluliseks faktoriks puhangute identifitseerimisel. Multienzyme multiplexAFLP-PCR meetodil tüpiseerimine on tunduvalt vähem ajakulukas ning võimaldab seegakiiresti identifitseerida haiglanakkusi põhjustavate tüvede reservuaare ja ülekandjaid, misomakorda paneb aluse edukamale võitlusele K. pneumoniae puhangute vastu siinseteshaiglates.17

2 Eksperimentaalosa2.1 EesmärgidKäesolev töö on üks osa TÜ ja Tallinna lasteintensiivravi osakonnast isoleeritudKlebsiella pneumoniae epidemioloogilisest uuringust. Töö konkreetsed eesmärgid olidjärgnevad:1) Viia läbi Klebsiella pneumooniae tüpiseerimine AFLP meetodil ja võrreldasaadud tulemusi pulssvälja geelelektroforeesi tulemustega;2) Tüpiseerida Tallinna lasteintensiivravi osakonnast isoleeritud Klebsiellapneumoniae tüved;3) Vaadata kahel perioodil (august 2006–veebruar 2007 ja märts 2007–detsember 2007) uuringusse kaasatud laste koloniseerimist Klebsiellapneumoniae tüvedega.18

2.2 Materjal ja metoodika2.2.1 Tüvede isoleerimine ja säilitamineUuringusse kaasati Tallinna vastsündinute intensiivraviosakonda sattunud lapsed, kesvastasid järgnevatele tingimustele:1) olid hospitaliseerimisel alla 72 tundi vanad;2) esinesid riskifaktorid neonataalse infektsiooni tekkeks;3) viibisid osakonnas vähemalt 24 tundi.Materjali koguti rektaal- ja kurgukaapest kohe pärast osakonda saabumist ningedaspidi kaks korda nädalas kuni intensiivravi osakonnas viibimise lõpuni või kuni 60.ravipäevani. Lastel, kellel tekkis sepsis, eraldati materjali ka verest.Uuringusse kaasati uuritavatelt lastelt esimene ja viimane eraldatud Klebsiellapneumoniae tüvi ning esimene ja viimane eraldatud ampitsilliinresistentne tüvi. Kuiintensiivraviosakonnas viibitud aeg ületas 10 päeva, kaasati uuringusse ka üks vahepealisoleeritud tüvi.Uuritavaid Klebsiella pneumoniae tüved säilitati temperatuuril -20 °C edasisteksuuringuteks.2.2.2 Bakteritüvede samastamineAlgseks Gram-negatiivsete bakterite isoleerimiseks kasutati poolkvantitatiivseidväljakülve MacConkey agarile, mida inkubeeriti temperatuuril 37 °C üks ööpäev.Ampitsilliinresistentsete Gram-negatiivsete tüvede isoleerimiseks kasutati MacConcey agarit,mis sisaldas 16 μg ampitsilliini. Erineva morfoloogiaga kolooniad külvati ümber veriagarilening inkubeeriti temperatuuril 37 °C veel üks ööpäev.Bakterite samastamiseks kasutati esmalt Grami järgi värvimist, seejärel enterobakteriteja mittefermentatiivsete bakterite eristamiseks oksüdaastesti. Oksüdaas-negatiivsete bakteritesamastamiseks kasutati väljakülve Kliegeri, Simmondsi, SIM ja uurea söötmele.Rutiinse algoritmi järgi isoleeritud Klebsiella pneumoniae liigilist kuuluvust kontrollitiAPI 20E testi (bioMerieux, Prantsusmaa) 22 erineva biokeemilise reaktsiooniga.19

2.2.3 Bakteriaalse DNA molekulaarne tüpiseerimine pulssvälja geelelektroforeesimeetodilPulssvälja geelelektroforees viidi läbi firma Bio-Rad (Prantsusmaa) protokollikohaselt. Tüved külvati veriagarile ja kasvatati üks ööpäev. Seejärel külvati üksik koloonia 4ml lihtpuljongisse, kasvatati loksutil 20 tundi temperatuuril 37°C ning seejärel tsentrifuugiti 2minutit 12000 pööret minutis. Sadenenud rakud resuspendeeriti 150 ml Cell Suspensionpuhvris temperatuuril 54°C.DNA eraldamine ja töötlemine viidi läbi Genepath kitiga (Bio-Rad, Prantsusmaa),kasutades ensüümi XbaI.Geelelektroforeesil kasutati masinat CHEF-DR II (Bio-Rad, Prantsusmaa).Elektroforees toimus temperatuuril 12°C 20 tundi, millele järgnes geeli värvimineetiidiumbromiidiga (10 mg/ml ) 15 minuti jooksul. Seejärel loputati geeli 40 minutitdestilleeritud veega. Elektroforeesi tulemusena saadud Klebsiella pneumoniaerestriktsioonimuster pildistati UV illuminaatoris ning mustreid analüüsiti programmigaGeneTools (SynGene, UK).2.2.4 Bakteriaalse DNA molekulaarne tüpiseerimine multiensüüm-multipleks AFLP-PCR meetodilUuritavatest tüvedest eraldati DNA QIAamp DNA Mini Kit’ga (QIAGEN, Saksamaa)vastavalt tootja protokollile. DNA elueeriti 400 µl puhvris ning säilitati -20 °C juuresedasiseks kasutamiseks.Restriktsioon-ligeerimisreaktsioon viidi läbi lõppmahus 30 µl, mis sisaldas 10 µlbakteri DNA suspensiooni, restriktsiooniensüüme EcoRI, PstI, XbaI ja NheI (kõiki 20 ühikut)(Fermentas, Leedu), 3 µl kümnekordset Tango puhvrit (Fermentas, Leedu), 1 ühik T4 DNAligaasi (Fermentas, Leedu) ja 20 pmol igat adapterit. Reaktsioonisegu inkubeerititemperatuuril 37 °C 3 tundi.Restriktsiooniprodukt sadestati 100 µl 2,5M ammooniumatsetaadi lahuses (96%etanoolis) üleöö temperatuuril -20 °C., millele järgnes tsentrifuugimine 13000 pööret minutis30 minutit ning kahekordne pesemine 200 µl 70% etanooliga. DNA lahustati üles 50 µl TEpuhvris.20

PCR viidi läbi lõppmahus 25 µl, mis sisaldas 2 µl restriktsiooniprodukti ja järgmisireagente vastavates kontsentratsioonides: 0,2 mM dNTP (igat nukleotiidi)(Ferments, Leedu),0,5 ühikut Taq polümeraasi (Fermentas, Leedu), 1,5 mM MgCl2 (Fermentas, Leedu) ja 10pmol kõiki praimereid. Reaktsiooni läbiviimiseks kasutati termotsüklerit Eppendorf MasterGradient. Praimerid ja termotükleri programm on toodud tabelites 3 ja 4. (van der Zee, 2002)Tabel 3. Töös kasutatud restrikaasid, neile vastavad adapterid ja praimeridRestriktaas Lõikesait Adapter PraimerXbaI5’T↓CTAGA5’CTAGTACTGGCAGACTCT5’AGAGTCTGCCAGTACTAGAAGATC↓T3’ATGACCG5’AGAGTCTGCCAGTACTAGNheI5’G↓CTAGC5’AGAGTCTGCCAGTACTAGCCGATC↓G5’AGAGTCTGCCAGTACTAGCGPstI5’CTGCA↓G5’CTCGTAGACTGCGTACATGCA5’GACTGCGTACATGCAGGG↓ACGTC3’CATCTGACGCATGT5’GACTGCGTACATGCAGAG5’GACTGCGTACATGCAGATEcoRI5’G↓AATTC5’AATTGGTACGCAGTCTAC5’GTAGACTGCGTACCAATTCCTTAA↓G3’CCATGCGTCAGATGCTCTabel 4. Töös kasutatud termotsükleriprogramm1. T=95 °C 00:01:002. T=94 °C 00:01:003. T=65 °C 00:01:004. T=72 °C 00:02:305. Go to 2 Rep. 396. T=72 °C 00:07:007. HOLD 4 °C21

10 µl PCR produkti analüüsiti UV valguses 1,5 %-lisel agaroosgeelil, pealegeelelektorforeesi ja DNA värvimist etiidiumbromiidiga. Saadud Klebsiella pneumoniaerestriktsioonimustrite hindamiseks kasutati visuaalset võrdlust ja programmi GeneTools(SynGene, UK). Klebsiella pneumoniae tüvede eristamiseks kasutatud kriteeriumid on toodudülalpool (vt. Krirjanduse ülevaade, lk.16).22

2.3 Tulemused ja arutelu2.3.1 Isoleeritud tüvedlapseltTallinna lasteintensiivravi osakonnast isoleeriti 43 Klebsiella pneumoniae tüve 14PFGE meetodil tüpiseeriti 9 puhanguga seotud proovi 5-lt lapselt.Multienzyme multiplex AFLP-PCR meetodil uuriti 44 tüve kokku 14 lapselt, nendehulgas kaks K. oxytoca tüve ning lisaks K. pneumoniae referentstüvi ATCC 700603.53,2% (n=25) uuritavatest Klebsiella pneumoniae tüvedest osutusidampitsilliinresistentseteks. Uuritud tüvede jaotumine ampitsilliinresistentsuse jaisoleerimiskoha aluse on toodud joonisel 1. Teistes maailma piirkondades on näidatudtunduvalt kõrgemat ampitsilliinresistentsete tüvede esinemissagedust kui meie töös. NäiteksUSA haiglates uuritud K. pneumoniae tüvedest ilmutasid resistentsust ampitsilliinile 98%(Edmond jt., 1999). Samas ei ole see üllatav, kuna on näidatud Eestis levivate haigustekitajatetunduvalt madalamat antibiootikumresistentsust võrreldes teiste riikidega (Lõivukene jt.2004).161412AmpitsillinresistentneAmpitsilliinile tundlikIsoleeritud proovide arv1086420KurgukaabeRektaalkaabeJoonis 1. Tüvede jaotumine ampitsilliinresistentsuse ja isoleerimispiirkonna järgi.23

2.3.2 PFGEPulssvälja geelelektroforeesiga uuriti 9 tüve 5-lt lapselt (A1–E1), kellel esinesidkliinilised näidustused. 5 tüve eraldati verest, 3 rektaalkaapest ja 1 kurgukaapest. Kõigi 9 tüverestriktsioonimustrid olid identsed, millest järeldub, et haiguse põhjustajaks oli sama tüvi(Joonis 2).A1 B1 C1 D1 E1Joonis 2. 5 patsiendilt (A1–E1) isoleeritud Klebsiella pneumoniae tüvede PFGE mustrid2.3.3 Multiensüüm-multipleks AFLP-PCRAFLP meetodil tüpiseeriti kokku 45 tüve, mille hulgas oli 42 patsientidelt isoleeritudKlebsiella pneumoniae tüve ning võrdluseks 2 K. oxytoca tüve ja K. pneumoniae referentstüvi(Joonis 3). 37 tüve isoleeriti ajavahemikul august 2006–veebruar 2007 ja 5 tüve ajavahemikulmärts 2007–detsember 2007.24

F I E B E B G HJoonis 3. Multienzyme multiplex AFLP-PCR restriktsioonimustrid. I — K. oxytoca; B, E, Gja F — patsientidelt isoleeritud K. pneumoniae tüved; H — K. pneumoniae referentstüviATTC600309K. pneumoniae tüpiseerimine AFLP meetodil ühtis PFGE tulemustega, andes kinnituse ühetüve poolt põhjustatud nakkuse levikule valitud viie patsiendi seas. Nende kahe meetodivõrdlus kinnitas AFLP sobivust K. pneumoniae tüpiseerimiseks. Valimi tüpiseerimisetulemused on toodud joonisel 4.Tüvede esinemissagedus50%45%40%35%30%25%20%15%10%5%0%A B C D E F GK. pneumoniae tüviJoonis 4. AFLP meetodil identifitseeritud genotüüpide protsentuaalne jaotus.25

Siiani vaid mõnes üksikus töös kasutatud AFLP meetod K. Pneumoniaetüpiseerimiseks, on aja jooksul järjest rohkem kasutusele võetud (Jonas jt., 2004). See tulenebmeetodi heast korratavusest, kiirusest ja intepreteeritavusest (van der Zee jt., 2002). Võrreldesteiste PCR-põhiste meetoditega on AFLP tunduvalt spetsiifilisem, milletõttu ka temausaldusväärsus on suurem kasutamaks seda hospitaalinfektsioonide identifitseerimiseks jafülogeneetiliseks analüüsiks (Jonas jt., 2004).Samade tüvede AFLP musterites on kirjeldatud väikeseid erinevusi, mis võivadtuleneda liigi geneetilistest muutustest, plasmiidide kaotusest või tehnilisest läbiviimisest(Janssen jt., 2001).AFLP meetod sobilik ka teiste Gram-negatiivsete bakterite tüpiseerimisel (Duim jt.,2001.) Lisaks eelnevale on AFLP fragmendid kergesti uuesti amplifitseeritavad ja seetõttu onlihtne viia läbi sekveneerimine, mis annab võimaluse uurida tüvedevahelisi spetsiifilisigeneetilisi erinevusi (Chalhoub jt., 1997)Ampitsilliinresistentsete isolaatide hulgas oli eristatav 5 tüve, ampitsilliinile tundlikehulgas 4 erinevat tüve (Tabel 5). Kokku oli võimalik eristada 7 erinevat tüve, 2restriktsioonimustri puhul ei olnud võimalik eristada ampitsilliinresistenseid ja ampitsilliiniletundlikke isolaate.Tabel 5. Ampitsilliinile resistentsete ja tundlike isolaatide arv tüvede kaupaTüviAmpitsilliinresistentsedisolaadid (n)Ampitsilliinile tundlikudisolaadid (n)KOKKU:A 11 6 17B 9 6 15C 0 4 4D 0 1 1E 3 0 3F 1 0 1G 1 0 1KOKKU: 25 17 4226

2.3.4 Patsientide koloniastsioonPerioodidel august 2006–veebruar 2007 ja märts 2007–detsember 2007 uuritikolonisatsiooni kokku 14 lapsel, vastavalt 10 ja 4. Teise perioodi patsientidelt isoleeritudtüved erinesid esimese perioodi omadest.Esimesel perioodil isoleeriti neli erinevat K. pneumoniae tüve. 10-st lapsest 5 olikoloniseeritud vähemalt 2 erineva tüvega. 90% (n=9) lastest oli vähemalt korrakoloniseeritud tüvega B, mis võib viidata patsientidevahelisele tüvede ülekandele (Joonis 4).Tüvega B koloniseeritud 9st lapsest viiel esinesid haigussümptomid. Nimetatud tüvede AFLPmustrite põhjal ei ole võimalik hinnata tüvede virulentsust erinevalt serotüpiseerimisest(Brisse, 2004).8Uuritud tüvede arv765432A B C D101 2 3 4 5 6 7 8 9 10PatsientJoonis 4. AFLP meetodil eristatud tüvede jaotuvus patsientide lõikes.Mitmetes uuringutes on näidatud, et tüvede reservuaariks on patsiendid, mitte agahaiglaruumide pinnad ja ülekandjateks meditsiinitöötajad (Gupta jt., 2004; Royle jt., 1999;van der Zwet jt., 2003). Kuna meie uuringusse ei kaasatud keskkonnaproove, ei saa välistadateistsuguste resrvuaaride olemasolu.Haiglaosakondade kolonisatsiooni uurimisel on vastakaid seisukohti. On neid, kes eisoovita haiglaosakondade kolonisatsiooni rutiinset järelvalvet, vaid pooldavad otsestpuhangute uurimist. Teised aga kinnitavad, et kolonisatsiooni uurimine on vajalik ningvarasemate tüvede uurimine annab küllaldaselt informatsiooni puhangutega seotud tüvedeepidemioloogia kohta. (Almuneef jt., 2001) Seda eriti tänapäeval, kus järjestproblemaatilisemaks on muutunud antibiootikumresistentsete tüvede esinemine intensiivravi27

osakondades (Lõivukene jt., 2005). Meie poolt uuritud K. pneumoniae tüpiseerimisetulemusel on enamik valimisse kaasatud lastes koloniseeritud ühe tüvega, kellest vaid pooltelesinesid haigussümptomid. Sellest tulenevalt peaks siiski rohkem tähelepanu pöörama kakolonisatsiooni epidemioloogilistele uuringutele, avastamaks võimalike puhanguteni viivaidtüvesid.28

2.4 JäreldusedKäesoleva töö järeldused on järgnevad:1) Klebsiella pneumoniae tüpiseerimise tulemused AFLP meetodiga olidkokkulangevad standardiks peetava pulss-välja geelelektroforeesitulemustega. Seetõttu sobib uuritud meetod K. pneumoniae tüpiseerimiseks.2) AFLP meetodiga tüpiseeriti Tallinna lasteintensiivravi osakonnastisoleeritud K. pneumoniae tüved. Esines 7 erinevat tüve, millestsagedaseimaks osutus tüvi A 42%-l isolaatidest.3) Uuringu esimesel perioodil (august 2006 – veebruar 2007) olid pooledpatsientidest koloniseeritud vähemalt kahe erineva K. pneumoniae tüvega.Kõige sagedamini esines tüvi B, mis võib viidata patsientidevaheliseleülekandele. Teise perioodi (märts 2007 – detsember 2007) patsientideltisoleeritud tüved erinesid esimese perioodi omadest.29

KokkuvõteKäesoleva töö eesmärkideks oli: (i) Viia läbi Klebsiella pneumooniae tüpiseerimineAFLP meetodil ja võrrelda saadud tulemusi pulsfieldi tulemustega; (ii) Tüpiseerida Tallinnalasteintensiivravi osakonnast isoleeritud K. pneumoniae tüved; (iii) Vaadata kahel perioodil(august 2006 – veebruar 2007 ja märts 2007 – detsember 2007) uuringusse kaasatud lastekolonisatsiooni K. pneumoniae tüvedega.Uuringusse kaasati Tallinna vastsündinute intensiivraviosakonda sattunud lapsed, kesvastasid järgnevatele tingimustele: (i) olid hospitaliseerimisel alla 72 tundi vanad; (ii) esinesidriskifaktorid neonataalse infektsiooni tekkeks; (iii) viibisid osakonnas vähemalt 24 tundi.Materjali koguti rektaal- ja kurgukaapest kohe pärast osakonda saabumist ning edaspidi kakskorda nädalas kuni intensiivravi osakonnas viibimise lõpuni või kuni 60. ravipäevani. Lastel,kellel tekkis sepsis, eraldati materjali ka verest. Tallinna lasteintensiivravi osakonnastisoleeriti 42 K. pneumoniae tüve 14 lapselt.Kogutud materjalist isoleeriti ja samastati K. pneumoniae ning uuritavatest tüvedesteraldati bakteriaalne DNA. Tüvede tüpiseerimise standardina kasutati pulss-väljageelelektroforeesi, millega võrreldi multiensüüm-multipleks AFLP meetodil tüpiseeritudtüvesid. AFLP tulemuste hindamine toimus UV valguses peale geelelektroforeesi, AFLPmustrite analüüs viidi läbi kastutades programmi GeneTools (SynGene, UK).PFGE ja AFLP meetodite võrdlemise tulemused kinnitasid AFLP kasutamisesobilikkust K. pneumoniae tüpiseerimiseks. Uuritavate isolaatide hulgas esines 7 erinevat K.pneumoniae tüve. Eristatava grupi moodustasid ampitsilliinresistentsed tüved. Esimeselperioodil (august 2006 – veebruar 2007) olid lapsed koloniseeritud valdavalt kahe tüvega.Enamik patsientidest oli koloniseeritud K. pneumoniae tüvega B, mis võib viidatapatsientidevahelisele ülekandele. Teise perioodi (märts 2006 – detsember 2007) tüved erinesidesimese omadest, mille põhjal loeti kahe erineva perioodi tüved epidemioloogiliseltmitteseotuteks.Töö üheks võimalikuks edasiarenduseks on haigla keskkonna proovide kogumine ninghaigla personali K. pneumoniae kolonisatsiooni uurimine. Samuti peaks suuremat tähelepanupöörama antibiootikumresistentsete tüvede ravimtundlikkuse määramisele.30

Epidemiological study of Klebsiella pneumoniaeby multienzyme multiplex AFLP-PCRSusanna TammanSummaryIntroduction: Klebsiella pneumoniae is an opportunistic pathogen from the genusEnterobacteraceae which causes nosocomial infections in intensive care units at hospitalsaround the world. Extensively studied everywhere, different methods of genotyping K.pneumoniae have been developed, the most widely used of which is pulsed-field gelelectrophoresis (PFGE), but as this method is time-consuming and technically difficult toconduct PCR-based methods are being standardised for use.The aim of this study were (i) to conduct genotyping of K. pneumoniae onmultienzyme multiplex AFLP-PCR and compare the results to the results of PFGE analysis;(ii) genotype K. pneumoniae strains isolated from a neonatal intensive care unit in Tallinn;and (iii) study the neonates’ colonization with K. pneumoniae on two periods (August 2006 –February 2007 and March 2007 – December 2007).The study is a part of a larger research to determine the factors influencing themicrobial colonisation of neonates in the NICUs in Tartu and Tallinn.Results and conclusions: The study showed that multienzyme multiplex AFLP-PCRis suitable for genotyping K. pneumoniae. Seven different strains were identified among totalnumber of isolates. During the first study period (August 2006 – February 2007) two strainswere prevalent. One of the strains (strain B) was found colonising the majority of the patients,indicating a possibility of bacterial transmission from patient to patient. Strains isolated fromthe patients on the second study period (March 2007 – December 2007) differed from thestrains isolated during the first period.The study suggests collecting samples from the hospital environment and medicalworkers to analyse their colonisation with K. pneumoniae in addition to the patients’colonization. More attention should also be paid to assessing antibiotic susceptibility of theresistant strains.31

Kasutatud kirjandusArtiklidAmako K., Meno Y., Takade A. Fine Structures of the Capsules of Klebsiella pneumoniaeand Escherichia coli K1. J Bacteriol. 1988 Oct; 170(10): 4960-4962.Bingen E.H., Desjardins P., Arlet G., Bourgeois F., Mariani-kurkdjian P., Lambert-Zechovsky N.Y., Denamur E., Philippon A., Elion J. Molecular epidemiology of plasmidspread among extended broad-spectrum Beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniaeisolates in a pediatric hospital. J Clin Microbiol 1993; 31: 179-184.Brisse S., Issenhuth-Jeanjean S., Grimont P.A.D. Molecular Serotyping of KlebsiellaSpecies Isolates by Restriction of the Amplified Capsular Antigen Gene Cluster. J ClinMicrobiol 2004; 42: 3388-3398.Cartelle M., del Mar Tomas M., Pertegfa S., Beceiro A., Angeles Dominguez M., VelascoD., Molina F., Villanueva R., Bou G. Risk Factors for Colonisation and Infection in aHospital Outbreak Caused by a Strain of Klebsiella pneumoniae with Reduced susceptibilityto Expanded-Spectrum Cephalosporins. J Clin Microbiol 2004; 42: 4242-4249.Chalhoub B.A., Thibault S., Laucou V., Rameau C., Hofte H., Cousin R. Silver stainingand recovery of AFLP amplification products on large denaturing polyacrylamide gels.Biotechniques1997; 22: 216-218, 220Drancourt M., Bollet C., Carta A., Rousselier P. Phylogenetic analyses of Klebsiellaspecies delineate Klebsiella and Raoultella gen. nov., with description of Raoultellaornithinolytica comb. nov., Raoultella terrigena comb. nov and Raoultella planticola comb.nov. Int J Syst Evol Microbiol 2001; 51: 925-932.Duim B., Vandamme P.A., Rigter A., Laevens S., Dijkstra J.R., Wagenaar J.A.Differentiation of Campylobacter species by AFLP fingerprinting. Microbiology; 147: 713-717Edmond M.B., Wallace S.E., McClish D.K., Pfaller M.A., Jones R.N., Wenzel R.P.Nosocomial Bloodstream Infections in United States Hospitals: A Three-Year Analysis. ClinInfect Dis 1999; 29: 239–244.Grünberg H., Vainumäe I., Traat A. Urotraktiinfektsioon lapseeas. Eesti Arst 2005; 84 (3):180-186.Gupta A., Della-Latta P., Todd B., San Gabriel P., Haas J., Wu F., Rubenstein D.,Saiman L. Outbreak of Extended-Spectrum Beta.Lactamase-Producing Klebsiellapneumoniae in a Neonatal Intensive Care Unit Linked to Artificial Nails. Infect Control HospEpidemiol. 2004 Mar; 25(3):210-215.Hansen D.S., Skov R., Benedi J.V., Sperling V., Kolmos H.J. Klebsiella typing: pulse-fieldgel electrophoresis (PFGE) in comparison with O:K-serotyping. Clin Microbiol Infect 2002;8: 397-404.Janssen P.J.D et al. New Approaches for the Generation and Analysis of Microbial TypingData. Elsevier, Amsterdam 2001, pp. 177-210Jonas D., Spitzmüller B., Daschner F.D., Verhoef J., Brisse S. Discrimination of Klebsiellapneumoniae and Klebsiella oxytoca phylogenetic groups and other Klebsiella species by useof AFLP. Res Microbiol 2004; 155(1): 17-2332

Kang C.I., Kim S.H., Park W.B., Lee K.D., Kim H.B., Kim E.C., Oh M.D., Choe K.W.Bloodstream Infections Due to Extended-Spectrum Beta-Lactamase-Producing Escherichiacoli and Klebsiella pneumoniae: Risk Factors for Mortality and Treatment Outcome, withSpecial Emphasis on Antimicrobial Therapy. Antimicrob. Chemother. 2004; 48: 4574-4581.Kang C.I., Kim S.H., Bang J.W., Kim H.B., Kim N.J., Kim E.C, Oh M.D., Choe K.W.Community-Aquired versus Nosocomial Klebsiella pneumoniae Bacteremia: ClinicalFeatures, Treatment Outcomes, and Clinical Implication of Antimicrobial Resistance. JKorean Med Sci 2006; 21: 816-822.Karki T. Ravimiresistentsus Eestis. Eesti Arst 2004Knothe H. et al. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitime, cefamandole andcefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcenscens. Infection1983;11:315-317Ko W.C., Paterson D.L., Sagnimeni A.J., Hansen D.S., Von Gottberg A., Mohapatra S.,Casellas J.M., Goossens H., Mulazimoglu L., Trenholme G., Klugman K.P., McCormackJ.G., Yu V.L. Community-Acquired Klebsiella pneumoniae Bacteremia: Global Differencesin Clinical Patterns. Emerg Infect Dis. 2002 Feb; 8(2): 160-166Lai Y.C., Yang S.L., Peng H.L., Chang H.Y. Identification of Genes Present Specifically ina Virulent Strain of Klebsiella pneumoniae. Infect Immun. 2000 Dec; 68: 7149-7151.Langstraat J, Bohse M, Clegg S. Type 3 Fimbrial Shaft (MrkA) of Klebsiella pneumoniae,but Not the Fimbrial Adhesin (MrkD), Facilitates Biofilm Formation. Infect Immun. 2001;69: 5805-5812Lavender H., Jagnow J.J., Clegg S. Klebsiella pneumoniae type 3 fimbria-mediatedimmunity to infection in the murine model of respiratory disease. Int J Med Microbiol. 2005Jun; 295(3):153-9.Leesik H., Ani Ü., Juhani A., Altraja A. Microbial pathogens of adult community-acquiredpneumonia in Southern Estonia. Medicina (Kaunas) 2006; 42(5): 384-394.Liu P.Y.F. et al. Survey of the prevalence of beta-lactamases amongst 1000 gram-negativebacilli isolated consecutively at the Royal London Hospital. J. Antimicrob. Chemother. 1992;30:429-447Liu P.Y.F., Tung J.C., Ke S.C., Chen S.L. Molecular epidemiology of extended-spectrumspectrum Beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolates in a district hospital inTaiwan. J Clin Microbiol 1998; 36: 2759-2762.Lõivukene K., Sepp E., Adamson V., Kallandi Ü., Otter K., Mägi H., Parts A., Rõõm A.,Naaber P. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ja Klebsiella pneumoniaetähtsus ja antibiootikumitundlikkus Eesti haiglate intensiivravi osakondades. Eesti Arst 2004;83 (8)Lõivukene K. Kermes K., Sepp E., Adamson V., Mitt P., Kallandi Ü., Otter K.,Pirožkova L., Kolesnikova V., Rõõm A., Kamõnina N., Timmas T., Kirs K., Voiko R.,Nemtseva G., Mägi H., Jürna M., Päro K., Laaring Ü., Abel K., Rudenko S., IvanovaM., Männik R., Naaber P. Invasiivsete patogeenide struktuur ja antibiootikumitundlikkus:olukord Eestis 2004. Eesti Arst 2005; 84 (8): 520–526Olive D.M., Bean P. Principles and Applications of Methods for DNA-Based Typing ofMicrobial Organisms. J Clin microbiol 1999 Jun; 37(6): 1661-1669.Paterson D.L., Ko W.C., Von Gottberg A., Mohapatra S., Casellas J.M., Goossens H.,Mulazimoglu L., Trenholme G., Klugman K.P., Bonomo R.A., Rice L.B., WagenerM.M., McCormack J.G., Yu V.L. Antibiotic Therapy for Klebsiella pneumoniae Bacteremia33

Implications of Production of Extended-Spectrum Beta-Lactamases. Clin Infect Dis. 2004;39: 31-37.Podschun R., Pietsch S., Höller C., Ullmann U. Incidence of Klebsiella species in surfacewaters and their expression of virulence factors. Appl Environ Microbiol 2001; 67: 3325-3327.Podschun R., Ullmann U. Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens: Epidemiology,Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors. Clin Microbiol Rev. 1998 Oct;11(4): 589-603.Royle J., Halasz S., Eagles G., Gilbert G., Dalton D., Jelfs P., Isaacs D. Outbreak ofextended spectrum beta lactamase producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal unit. ArchDis Child Fetal Neonatal Ed 1999;80:F64-F68Savelkoul P.H.M., Aarts H.J.M., de Haas J., Djikshoorn L., Duim B., Otsen M.,Rademaker J.L.W., Schouls L., Lenstra J.A. Amplified-Fragment Length PolymorphismAnalysis: the State of an Art. J Clin Microbiol 1999; 37: 3083-3091.Schembri M.A., Blom J., Krogfelt K.A., Klemm P. Capsule and Fimbria Interaction inKlebsiella pneumoniae. Infect Immun. 2005 Aug; 73(8): 4626-4633.Sepp E. Kõljalg S., Naaber P., Truusalu K., Štšepetova L., Metsvaht T., Sau L., JürnaM., Mägi H., Allik M., Mikelsaar M. Staphylococcus epidermidis ja Klebsiella pneumoniae– võimalikud hospitaalinfektsioonide tekitajad Eesti lasteintensiivravi osakondades. Eesti Arst2003; 82 (4): 239-248.Sirot D.L., Goldstein F.W., Soussy C.J., Courtieu A.L., Husson M.O., Lemozy J.,Meyran M., Morel C., Perez R., Quentin-Noury C., Reverdy M.E., Scheftel J.M.,Rosembaum M., Rezvani Y. Resistance to cefotaxime and seven other Beta-lactams inmembers of the family Enterobacteriaceae: a 3-year survey in France. Antimicrob. AgentsChemother. 1992; 36:1677-1681Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H.,Swaminathan B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsedfieldgel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin microbiol 1995; 33: 2233-2239.Tumbarello M., Spanu T., Sanguinetti M., Citton R., Montuori E., Leone F., Fadda G.,Cauda R. Bloodstream Infections Caused by Extended-Spectrum-Beta-Lactamase-ProducingKlebsiella pneumoniae: Risk Factors, Molecular Epidemiology, and Clinical Outcome.Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 498-504.van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N.K.,Fussing V., Green. J, Feil E., Gerner-Smidt P., Brisse S., Struelens M. Guidelines for thevalidation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. ClinMicrobiol Infect. 2007 Oct;13 Suppl 3:1-46.van der Zee A., Steer N., Thijssen E., Nelson J., van’t Veen A., Buiting A. Use ofMultienzyme Multiplex PCR Amplified Fragment length Polymorphism Typing in Analysisof Outbreaks of Multiresistand Klebsiella pneumoniae in an Intensive Care Unit. J Clinmicrobiol. 2003; 41: 798-802.van der Zwet W.C., Parlevliet G.A., Savelkoul P.H.M., Stoof J., Kaiser A.M., KoelemanJ.G.M. and Vandenbroucke-Grauls C.M.J.E. Nosocomial outbreak of gentamicinresistantKlebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit controlled by a change inantibiotic policy. J Hosp Infect 1999; 42 (4): 295-302.van't Veen A., van der Zee A., Nelson J., Speelberg B., Kluytmans A.J.W., BuitingA.G.M. Outbreak of Infection with a Multiresistant Klebsiella pneumoniae Strain Associated34

with Contaminated Roll Boards in Operating Rooms. J Clin Microbiol 2005 Oct; 43 (10):4961-4967.Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. NucleicAcids Research 1990; 18: 7213-7218.Versalovic J., Koeuth T., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences ineubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research1991; 19: 6823-6831.Vos P. et al. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 1995;23: 4407-4414.Yu V.L., Hansen D.S., Ko W.C., Sagnimeni A., Klugman K.P., von Gottberg A.,Goossens H., Wagener M.M., Benedi V.J. Virulence Characteristics of Klebsiella andClinical Manifestations of K. pneumoniae Bloodstream Infections. Emerg Infect Dis. 2007Jul; 13(7): 986-993.RaamatudMikelsaar M, Karik T. Meditsiiniline mikrobioloogia 1998; 1: 99-109 (B-laktaamid)Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Landry M.L., Pfaller M.A. Manual of ClinicalMicrobiology. ASM Press, 2007:(1),698-715Veebiaadressidhttp://www.merck.com/mmpe/sec14/ch170/ch170c.html35

TÄNUSÕNADKäesolev bakalaureusetöö on valminud Tartu Ülikooli Mikrobioloogia Instituudis. Töövalmimise eest tänan väga oma juhendat Kristi Huiki ning Ülle Parmu, Radko Avi ja kõikiteisi, kes nõuandeid ja toetust jagasid.36