Inimese embrüonaalsete tüvirakkude kasvatamine maatriksitel ning ...

TARTU ÜLIKOOL
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL
Kadri Ligi
Inimese embrüonaalsete tüvirakkude kasvatamine maatriksitel ning
rakuliini H9 kasvatamine laminiin 511-l
Bakalaureusetöö
Juhendaja: Dotsent Sulev Ingerpuu
Tartu 2010

Sisukord
Kasutatud lühendid .....................................................................................................4
Sissejuhatus ..................................................................................................................6
I Kirjanduse ülevaade
1. Rakuväline maatriks. Selle ehitus ja komponendid ...........................................7
1.1. Rakuväline maatriks ja basaalmembraan. Üldine ehitus ..................................7
1.2. Rakuvälise maatriksi komponendid, mis ei kuulu basaalmembraani
koosseisu.........................................................................................................8
1.2.1. Fibronektiin..............................................................................................8
1.2.2. Vitronektiin..............................................................................................8
1.3. Basaalmembraani olulisimad komponendid ja nende retseptorid. ...................9
1.3.1. Laminiinid................................................................................................9
1.3.1.1. Laminiinide struktuur .....................................................................9
1.3.1.2. Laminiinide ekspressioon kudedes. ..............................................11
1.3.1.3. Laminiinidele seonduvad molekulid.............................................11
1.3.2. Kollageen ...............................................................................................12
1.3.3. Nidogeen................................................................................................13
1.3.4. Proteoglükaanid ja glükoosaminoglükaanid..........................................13
1.3.5. Integriinid...............................................................................................14
1.3.6. Düstroglükaan........................................................................................15
2. Embrüonaalseid tüvirakke ümbritsev rakuväline maatriks ...........................16
2.1.Basaalmembraanid varajases embrüos ja embrüoidkehades ...........................16
2.2.Rakuvälise maatriksi valgud ning neile vastavad retseptorid hiire embrüos,
embrüoidkehades ja hESC-des .......................................................................17
2.2.1 Laminiinide ekspressioon hiire embrüos, embrüoidkehades ja
hESC-des ................................................................................................17
2.2.1.1. Laminiinide ekspressioon hiire embrüos ......................................18
2.2.1.2. Laminiinide ekspressioon hiire embrüoidkehades........................18
2.2.1.3. Laminiinide eksrpressioon hESC-des...........................................18
2.2.2. Düstroglükaani ekspressioon hiire embrüos ja embrüoidkehades.........19
2.2.3. Integriinide ekspressioon hiire embrüos, embrüoidkehas ja hESC-des.19
2.2.3.1.Integriinide ekspressioon hiire embrüos ja embrüoidkehades.......19
2.2.3.2. Integriinide ekspressioon hESC-des .............................................20
2.2.4.Nidogeeni ekspressioon hiire embrüotes ja embrüoidkehades...............20
2.2.5.Kollageenide ekspressioon hiire embrüos, embrüoidkehades
ja hESC-des.............................................................................................20
2.2.6.Fibronektiini ekspressioon hiire embrüotes ja hESC-des.......................21
3. hESC-de koekultuuris kasvatamine...................................................................22
3.1.hESC-de toiterakkudel kasvatamine................................................................22
3.1.1.hESC-de hiire embrüonaalsetel fibroblastidel kasvatamine ...................22
3.1.2.hESC-de inimese rakkudel kasvatamine.................................................22
3.1.2.1. hESC-de inimese fibroblastidel kasvatamine ...............................22
3.1.2.2. hESC-de autogeensetel fibroblastidel kasvatamine......................24
3.1.2.3. hESC-de inimeserakkudel (v.a. fibroblastid) kasvatamine...........25
3.2. hESC-de ilma toiterakkudeta kasvatamine.....................................................25
3.2.1.hESC-de rakuvälise maatriksi komponentidel kasvatamine...................25
3.2.1.1. hESC-de Matrigelil kasvatamine ..................................................26
3.2.1.2. hESC-de inimese rakuvälise maatriksi valkude kombinatsioonil
kasvatamine ...................................................................................26
3.2.1.3.hESC-de inimese rakuvälise maatriksi valkudel kasvatamine.......27
3.2.1.3.1. hESC-de fibronektiinil kasvatamine..................................27
2

3.2.1.3.2. hESC-de laminiinil kasvatamine .......................................27
3.2.1.3.3. hESC-de vitronektiinill kasvatamine .................................28
3.2.1.3.4. hESC-de kollageenil kasvatamine .....................................28
3.2.2. hESC-de toiterakkudeta ja valgulise maatriksita kasvatamine ..............28
II Eksperimentaalne osa
4. Materjal ja metoodika .........................................................................................30
4.1.Laminiini 511 puhastamine rakuliini A549 sekreedist ....................................30
4.1.1.Rakuliini A549 kasvukeskkonna töötlemine enne laminiini
väljapuhastamist......................................................................................30
4.1.2.Afiinsuskromatograafia kolonni valmistamine.......................................30
4.2.Laminiini 511 kontsentratsiooni määramine ...................................................31
4.3.hESC-de Matrigelil ja Lm511-l kasvatamine ..................................................31
4.4. Immunofluorestsents (IF). ..............................................................................32
5. Tulemused.............................................................................................................33
5.1. Puhastatud Lm511 kontsentratsiooni määramine ...........................................33
5.2.Lm511 klaasile kinnitumise kontrollimine ......................................................33
5.3. hESC-de Lm511-l ja Matrigelil kasvatamine .................................................34
5.3.1.Kolooniate üldmorfoloogia ja pluripotentsusmarkerite ekspressioon ....34
5.3.2.Laminiini subühikute süntees .................................................................37
6. Arutelu ..................................................................................................................39
Kokkuvõte...................................................................................................................41
The Cultivation of Human Embryonic Stem Cells on Various Matrixes and the
Cultivation of the Cell Culture Line H9 on Laminin 511. Summary....................42
Tänusõnad ..................................................................................................................43
Kasutatud kirjandus..................................................................................................44
Kasutatud veebiaadressid .........................................................................................50
3

Kasutatud lühendid
AH - aminohape
BCA – bicinchonic acid, ingl.k
BM – basaalmembraan
BSA – bovine serum albumin, ingl.k., vasikaseerumi albumiin
DAG-1 - Dystrophin-associated glycoprotein 1, ingl.k., düstrofiiniga seostatavat
glükoproteiini 1 kodeeriv geen
DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole, ingl.k, 4',6-diamidino-2-fenüülindool
DIC - differential interference contrast microscopy, ingl.k., diferentsiaal-interferentskontrastmikroskoopia
DG – düstroglükaan
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, ingl.k., Dulbecco poolt muudetud
Eagle’i sööde
E – embryonic (day), ingl.k., embrüonaalne päev
EC – embryonic carcinoma cells, ingl.k., embrüonaalse kartsinoomi rakud
ECM – extracellular matrix, ingl.k., rakuväline maatriks
EGF – epidermal growth factor, ingl.k., epidermaalne kasvufaktor
ERK – extracellular signal-regulated kinase, ingl.k., rakuvälise signaali poolt
reguleeritud kinaas
ESC – embryonic stem cells, ingl.k., embrüonaalsed tüvirakud
FBS – fetal bovine serum, ingl.k., vasika loote seerum
bFGF ehk FGF2 – basic fibroblast growth factor, ingl.k., põhiline fibroblastide
kasvufaktor
Foxd3 - Forkhead box D3, ingl.k., kahvlipea-perekonda kuuluv transkriptsioonifaktor
GABA – γ-aminobutüürhape
GAG – glükoosaminoglükaan
GCTM2 – germ cell tumor monoclonal antibody, ingl.k, idurakkude kasvajale
seonduv monoklonaalne antikeha
hEC – human embryonic carcinoma, ingl.k., inimese embrüonaalne kartsinoom
hESC – human embryonic stem cells, ingl.k., inimese embrüonaalsed tüvirakud
HIF-1α – hypoxia inducible factor α-subunit, ingl.k., hüpoksiat indutseeriva faktori
α-subühik
ICM – inner cell mass, ingl.k., seesmine rakumass (varases embrüos)
IMDM – Iscove’ Modified Dulbecco’s Medium, ingl.k., Iscove’i poolt modifitseeritud
4

Dulbecco’ sööde
IgG – immunoglobulin G, ingl.k., immunoglobuliin G
KO – knock-out, ingl.k., välja löödud
LAMA – laminiini alfa-subühikut kodeeriv geen
LAMB – laminiini beeta-subühikut kodeeriv geen
LAMC – laminiini gamma-subühikut kodeeriv geen
Lm – laminiin
Lu/B-CAM – Lutheran protein/Basal cell adhesion molecule, ingl.k, Luteri veregrupi
glükoproteiin
MAP-ERK pathway – mitogen-activated protein – extracellular signal-regulated
kinase, ingl.k, mitogeen-aktiveeritud valgu – rakuvälise signaali poolt reguleeritud
kinaasi signaalirada
MAPK – mitogen-activated protein kinase, ingl.k, mitogeen-aktiveeritud
proteiinkinaas
mESC – mouse embryonic stem cells, ingl.k., hiire embrüonaalsed tüvirakud
MEF – mouse embryonic fibroblasts, ingl.k., hiire embrüonaalsed fibroblastid
Neu5Gc – N-glükolüülneuramiinhape
Oct3/4 – oktameer 3/4 (varane transkriptioonifaktor)
OD – optical density, ingl.k., optiline tihedus
PBS - phosphate buffered saline, ingl.k., fosfaat-puhverdatud füsioloogiline lahus
PKA – phosphokinase A, ingl.k., fosfokinaas A
PKC – phosphokinase C, ingl.k., fosfokinaas C
Rex1 – (embrüonaalsetele) tüvirakkudele omane transkriptsioonifaktor
SSEA – stage-specific antigen, ingl.k., etapi-spetsiifiline antigeen
TERT – telomerase reverse transcriptase, ingl.k., telomeraasi pöördtranskriptaas
TGFβ – transforming growth factor β, ingl.k., transformeeriv kasvufaktor β
5

Sissejuhatus
Embrüonaalsed tüvirakud (ESC, embryonic stem cells, ingl.k.) on pluripotentsed rakud
ehk rakud, mis võivad diferentseeruda kõigi kolme lootelehe rakkudeks. Teaduslikke
uuringuid teostatakse eelkõige inimese ja hiire embrüonaalsete tüvirakkudega. Inimese
embrüonaalsed tüvirakud (hESC, human embryonic stem cells, ingl.k) ekspresseerivad
varasele arengujärgule omaseid transkriptsioonifaktoreid nagu Oct3/4 ja Nanog,
pinnamarkereid SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 ja Tra-1-81, neil on ainuomane DNA
metülatsioonimuster, nad moodustavad immuunpuudulikes hiirtes kõigi kolme lootelehe
rakke sisaldavaid kasvajaid ning on võimelised moodustama embrüoidkehasid in vitro. hESCde
kasvatamine koekultuuris nõuab erilist hoolt, sest nad lähevad kergesti diferentseeruma.
hESC-de kasvatamisprotokolle ei ole veel standardiseeritud, sest sobivaid kasvatustingimusi
veel otsitakse. Algselt kasvatati hESC-sid mitoosis inaktiveeritud hiire embrüonaalsetel
fibroblastidel ehk MEF-del. Terapeutilistel eesmärkidel ei saa inimese embrüonaalseid
tüvirakke MEF-del kasvatada, sest on oht, et hESC-d seovad kasvukeskkonnast
inimorganismi jaoks ksenogeenseid molekule. Ka inimese fibroblastid ei ole terapeutilistel
ega teaduslikel eesmärkidel sobivaim süsteem, sest neil kasvanud hESC-de siirdamine võib
patsiendis esile kutsuda immuunreaktsiooni ja samuti võivad fiiderrakud ise põhjustada
varieeruvust korduskatsete vahel. Seepärast on võetud suund fiiderrakkudest loobumisele
ning otsitakse molekule ja molekulide kombinatsioone, mis kasutamisel maatriksina või
lisatuna söötmesse tagaksid hESC-de pluripotentsuse säilimise ja prolifereerumise in vitro.
Sellisteks rakuvälise maatriksi komponentideks võiksid olla varases embrüogeneesis
ekspresseeritavad rakuvälise maatriksi komponendid.
Käesoleva uurimistöö eesmärgiks oli kirjandusele toetudes uurida, millistest
molekulidest koosneb varases embrüos ekspresseritav rakuväline maatriks ja millised
molekulid nende seast võiksid olla olulised rakkude pluripotentsuse ja prolifereerumise
säilitamise seisukohalt. Eksperimentaalseks katsetamiseks valiti välja glükoproteiin laminiin
511. Seepärast on ka kirjanduse ülevaates pööratud enim tähelepanu just laminiinidele ja
nende retseptoritele.
6

I Kirjanduse ülevaade.
1. Rakuväline maatriks. Selle ehitus ja komponendid
1.1. Rakuväline maatriks ja basaalmembraan. Üldine ehitus
Rakuväline maatriks (ECM – extracellular matrix, ingl.k) on olemas kõigis
hulkraksetes loomades. ECM on vajalik rakkude kinnitumiseks ning ta vahendab ka
naaberrakkude vahelist suhtlust, osaledes rakkude prolifereerumises, spetsialiseerumises,
migreerumises ja apoptoosis. Rakuvälise maatriksi valgud võib jagada nelja kategooriasse:
kollageenid, struktuursed glükoproteiinid (laminiinid), proteoglükaanid ja elastiinid.
Erisugused ECM komponendid on rakuvälises maatriksis omavahel seotud, moodustades
ühtse võrgustiku. ECM komponendid seonduvad rakkudele retseptorite vahendusel, millest
olulisemad on düstroglükaanid ja integriinid. Retseptorite struktuuri muutused juhivad raku ja
ECM vahelisi signaaliülekandeid. Neid muutusi võivad esile kutsuda kasvufaktorid, nagu
bFGF, EGF ja TGFβ, aga samuti maatriksi elastsuse muutumine. Sõltuvalt maatriksi
elastsusest, diferentseeruvad inimese mesenhümaalsed tüvirakud kas närvi-, lihas-, või
luurakkudeks (Engler jt. 2006).
Basaalmembraan on rakuvälise maatriksi erivorm, mis paikneb õhukese kihina
epiteeli- ja endoteelirakkude all ja ümbritseb lihaseid, rasvkudet ning perifeerseid närve.
Basaalmembraani koostis varieerub sõltuvalt koest ja organismi aregustaadiumist, aga
põhikomponentideks on alati kollageen IV, laminiinid, nidogeen ehk entaktiin ja
proteoglükaanid (Ferletta 2002). Sarnaselt kollageeni molekulidega moodustavad ka laminiini
molekulid omavahel võrgustiku (Schittny ja Yurchenco 1990, Timpl ja Brown 1996).
Piltlikult öeldes, annab laminiinivõrgustik basaalmembraanile painduvuse ja
kollageenivõrgustik mehhaanilise vastupidavuse. Arvatakse, et need kaks võrgustikku on
omavahel ühendatud nidogeeni abil (Aumailley ja Smyth 1998). Proteoglükaanid seovad
tugevalt vett ja nende ülesandeks basaalmembraanis arvataksegi olevat basaalmembraani
paksuse ja jäikuse reguleerimine selle vee sisalduse kaudu (Balasubramani jt. 2010). Rakkude
kinnitumine basaalmembraanile toimub retseptorite vahendusel. Kui rakud on koes
maatriksile kinnitunud, siis lisab see koele stabiilsust. Rakkude kinnitumiskohtadest lähtuvad
paljud signaalirajad, mille kaudu juhitakse rakkude diferentseerumist, migreerumist,
jagunemist, apoptoosi või tagatakse väliskeskkonna tugi raku normaalse morfoloogia ja
talitluse säilimiseks. Basaalmembraan moodustub juba varase embrüogeneesi käigus. Näiteks
hiire embrüotes eristub basaalmembraan 3.-4. arengupäeval (Li ja Edgar 2003).
7

1.2. Rakuvälise maatriksi komponendid, mis ei kuulu basaalmembraani koosseisu
1.2.1. Fibronektiin
Fibronektiin kuulub nii rakuvälise maatriksi kui ka vereplasma koosseisu. Fibronektiin
koosneb kahest identsest peptiidiahelast, mille kummagi molekulkaal on ca 250 kDa ja mis on
omavahel ühendatud kahe karboksüterminaalses otsas paikneva disulfiidsillaga. Fibronektiini
molekul on 4-9% ulatuses glükosüleeritud (Pankov ja Yamada 2002). Fibronektiin seondub
rakkudele järgnevate integriinide vahendusel: α2β1, α3β1, α4β1, α4β7, α5β1, α8β1, αVβ1,
αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, αIIbβ3 (Plow jt. 2000, Barzyk jt. 2009). Neist kaheteistkümnest
retseptorist on olulisim α5β1 integriin. Lisaks seondub fibronektiin fibriinile, hepariinile (ka
heparaansulfaatsetele proteoglükaanidele), kondroitiinsulfaadile ning kollageenile (seejuures
eelistatult denatureerunud kollageenile ehk želatiinile) (Mostafavi-Pour jt. 2001). Inimesel on
kirjeldatud 20 erinevat fibronektiini, mis kõik on ühe ja sama geeni produktid, kuid läbinud
erineva altenatiivse splaissimise. Vereplasmas ringlevat fibronektiini sünteesivad
hepatotsüüdid ja selle molekul on väiksem kui tsellullaarne fibronektiin. Plasma fibronektiin
osaleb vere hüübimisel. Rakkudest eralduv fibronektiin on rakuvälise maatriksi komponent
(Pankov ja Yamada 2002).
1.2.2. Vitronektiin
Vitronektiini molekulkaal on 75 kDa, millest 30% moodustavad suhkrujäägid.
Sarnaselt fibronektiiniga kuulub ka vitronektiin nii rakuvälise maatriksi kui vereplasma
koosseisu. Kuna tõsise maksakahjustusega inimestel on vitronektiini tase plasmas langenud,
arvatakse, et plasma vitronektiini sünteesitakse maksas nagu plasma fibronektiinigi (Schvartz
jt. 1998). Erinevalt vereplasmas ringlevast vitronektiinist on maatriksi vitronektiin lahti
pakitud ning rakud kinnituvad sellele integriinide αVβ3, αVβ5, αVβ1, αIIbβ3, αVβ6 ja αVβ8
abil (Barzyk jt. 2009). Vitronektiin on seotud rakuvälise maatriksi degradatsiooniga ning vere
hüübimisega (Gechtman jt. 1997). Vitronektiin sisaldab ka kollageeni ja hepariini
seondumiskohti (Kost jt. 1992). Arvatakse, et vitronektiini ja kasvufaktorite signaalirajad on
omavahel seotud. Näiteks pärast vitronektiinile külvamist suurenes insuliiniga töödeldud
rakkude jagunemine 2,5 korda, kui rakud ekspresseerisid integiini αVβ3 (Vuori ja Ruoslahti,
1994). Vitronektiinil ei ole embrüogeneesiprotsessis olulist rolli. Vitronektiini -/- hiired
arenevad normaalselt ja on viljakad (Zheng jt. 1995).
8

Rakkude adhesioon,
migratsioon ja kuju muutused
(integriinid , uPAR)
Rakuväline ankurdamine
(GAG, kollageen)
Rakkude jagunemine
(integriinid,
kasvufaktorid)
Vitronektiin
Hemostaas
(trombiin,
faktor Xa)
Fibrinolüüs
(uPAR, PAI-1)
Immuunreaktsioon
Joonis 1. Vitronektiini bioloogilised funtksioonid.
uPAR – urokinaasi retseptor; PAI-1 – plasminogeeni aktivatsiooni inhibiitor 1, GAG - glükoosaminoglükaanid.
(Schvartz jt. 1998)
1.3. Basaalmembraani olulisemad komponendid ja nende retseptorid
1.3.1. Laminiinid
1.3.1.1. Laminiinide struktuur
Laminiinid on basaalmembraani koostisse kuuluvad heterotrimeersed glükoproteiinid.
Laminiinide subühikuid tähistatakse α, β ja γ (varem A, B1 ja B2) ja neid kodeerivaid geene
LAMA#, LAMB# ja LAMC#, kus # on subühikule vastav naturaalarv. α-subühikuid on leitud
5, β-subühikuid 3 ja γ-subühikuid samuti 3 ning nad moodustavad omavahel 18 erinevat
laminiini (Durbeej 2010). Laminiinid saavad omale nime vastavalt sellele, millistest
subühikutest nad koosnevad. Näiteks laminiin 511 koosneb α5-, β1- ja γ1-subühikutest.
Subühikute karboksüterminaalsed otsad on omavahel helikaalselt keerdunud, moodustades nn
pika õla (long arm, ingl.k). Vabade aminoterminaalsete otste kaudu, mida nimetatakse ka
„lühikestest õlgadeks” (short arms, ingl.k) toimub laminiini molekulide seondumine
rakuvälises keskkonnas. Osadel laminiinidel „lühikesed õlad” puuduvad ja nende puhul ei
toimu autopolümerisatsiooni ega kopolümerisatsiooni teiste laminiinidega (Cheng jt. 1997).
Laminiini subühikute sünteesi reguleerivad erinevad geenid. On leitud, et α3-ahel läbib
splaissimise (vt. joonis 2). Laminiini monomeerid liidetakse heterotrimeerideks raku
tsütoplasmas. Esmalt seonduvad omavahel β- ja γ-ahelad ning alles siis ühineb tekkinud
dimeeriga α-ahel (Yurchenco jt. 1997, Cheng jt. 1997). Laminiinide modifitseerimine võib
toimuda ka rakuväliselt. Sellisel ümberkujundamisel on oluline mõju laminiinide
bioloogilisele aktiivsusele. Näiteks laminiini 511 puhul on täheldatud, et kui α-subühikut
lõigatakse maatriksi metalloproteinaasi poolt, siis väheneb eesnäärmevähi rakkude
9

kinnitumine laminiinile, mis omakorda soodustab vähirakkude transmigratsiooni (Bair jt.
2005). Laminiini 332 rakuvälise töötluse tulemusel vabaneb EGF-sarnast domääni sisaldav
ahelaosa, mis seondub EGF-retseptorile ning kannab MAPK raja kaudu signaali edasi
(Schenk jt. 2003). EGF-sarnane domään on vähemalt kolme disulfiidsilda sisaldav 30-40
aminohappejäägist koosnev järjestus, mis on iseloomulik rakuvälises ruumis toimetavatele
valkudele nagu laminiinid, integriinid, fibronektiin ja TGF. Kõigi kolme laminiini subühiku
“lühikesed õlad” sisaldavad 3-8 EGF-sarnast domääni ja neid tähistatakse lühendiga LE (Tzu
ja Marinkovich 2008).
Joonis 2. Teadaolevad laminiinid (Durbeej 2010). Erinevad subühikud on märgitud erineva värviga.
Glükosüleeritusel on oluline mõju laminiinide bioloogilisele aktiivsusele:
glükosüleerimata laminiinid võivad kaotada oma bioloogilise aktiivsuse (Chandrasekaran jt.
1991). Kas põhjus on valgu konformatsiooni muutumises või osalevad suhkrujäägid otseselt
signaaliülekandes, vajab veel täiendavat uurimist.
1.3.3.2. Laminiinide ekspressioon kudedes
Organismi erinevatel arengujärkudel on laminiinide ekspressioon kudedes väga erinev.
Laminiinide funktsioon muutub organismi arengu käigus dünaamiliselt. Kuna käesolevas töös
vaadeldakse põhjalikumalt laminiinide osa embrüonaalsete tüvirakkude arengu ja
funktsioneerimise seisukohast, siis on seda põhjalikumalt käsitletud punktis 2. Ülevaate
laminiinide ekspressioonist imetaja kudedes annab Tabel 1.
10

Tabel 1. Laminiinide isovormid, ekspressioon ja retseptorid. (Durbeej 2010).
Laminiini isovormid, nende ekspressioon ja retseptorid.
Isovorm Põhiline ekspressioonikoht Retseptorid
111 Embrüonaalne epiteel, osad täiskasvanu epiteelid
(neer, maks, munandid, munasarjad), aju veresooned
Integriinid α1β1, α2β1, α6β1,
α7β1, α9β1, α-DG, sündekaanid
121 Platsenta
211 Lihased, süda, perifeersed närvid, munandid Integriinid α1β1, α2β1, α6β1,
α7β1, α-DG, sündekaanid
221 Lihased, süda, perifeersed närvid, munandid,
neuromuskulaarne sõlm
213 Platsenta, munandid
212/222 Perifeersed närvid
3A11 Epiderm, amnion Integriinid α3β1, α6β1, α6β5,
sündekaanid
3A21 Epiderm, amnion
3A32 Epiderm, platsenta, piimanäärmed
3A33 Munandid
3B32 Nahk, emakas, kopsud Integriinid α3β1, α6β1, α6β4
411 Endoteel, silelihased, rasvkude, perifeersed närvid α6β1, α7β1, sündekaanid
421 Endoteel, silelihased, neuromuskulaarne sõllm, β2-ahel seondub pingest sõltuvale
kaltsiumikanalile
423 Silma võrkkest, tsentraalne närvisüsteem
511 Loote ja täiskasvanu epiteel, täiskasvanu endoteel,
silelihased
521 Täiskasvanud epiteel ja endoteel, silelihased,
neuromuskulaarne sõlm, BM veresoonte
päsmakestes neerudes
522 Luuüdi
523 Silma võrkkest, tsentraalne närvisüsteem
Integriinid α2β1, α3β1, α6β1,
α6β4, α7β1, αvβ3, α-DG,
sündekaanid, Lu/B-CAM
1.3.3.3. Laminiinidele seonduvad molekulid
Rakkudele seondumisel on olulisimad laminiinide α-ahela viis homoloogset
karboksüterminaalset globulaarset domääni, mida tähistatakse lühendiga LG. Integriinid
seonduvad peamiselt domäänidele LG1-3, mõned integriinid seonduvad lisaks ka ahelate β1,
β2, γ1 ja γ2 karboksüterminaalsele osale (Taniguchi jt. 2009, Ido jt. 2008). Mitte-integriinsed
retseptorid ning ligandid nagu α-düstroglükaan, hepariin, sulfatiidid, perlekaan, sündekaanid
ja fibuliinid domäänidele LG4-5 (vt. joonis 3) (Durbeej 2010). Nidogeen, mis arvatakse
ühendavat kollageeni- ja laminiinivõrgustikku, seondub ahelate γ1-, γ2- ja γ3 „lühikesele
õlale” (Durbeej 2010). Laminiin 332 seondub kollageenile otse (Chen ja Marinkovich 1997).
Agriin seondub laminiini helikaalselt keerdunud ahelate keskossa (Durbeej 2010). Lisaks on
teada, et Lutheri veregrupi glükoproteiin seondub α5-ahelat sisaldavatele laminiinidele
(Kikkawa jt. 2002). Võimalikud on ka laminiinile kinnituvate molekulide omavahelised
kontaktid, mis takistavad teiste molekulide laminiinile seostumist. Näiteks seondub α-
düstroglükaan ka perlekaanile ja agriiniile ning hepariin inhibeerib α-düstroglükaani
11

seostumise (Pall jt. 1996). Tabelis 1 on esitatud kõigile laminiini isovormidele vastavad
retseptorid.
Joonis 3. Laminiin 111 seondumine raku tsütoskeletiga (Edgar jt. 2003).
LN-aminoterminaalne osa, LG-G-domään, DG-düstroglükaan, α1β1, α2β1, α6β1 – integriinid, ILK – integriinseotud
kinaas, Nd – nidogeen, Nck – türosiinkinaasi adaptorvalgu mittekatalüütiline piirkond, Vn-vinkuliin,
FAK-fokusseeriv adhesioonikinaas, RTK-retseptortürosiinkinaas, HBSA-hepariini siduva saidi ankur, actin
cytoskeleton – aktiini tsütoskelett
1.3.2. Kollageen (Ricard-Blum ja Ruggiero 2005)
Kollageenid on enim levinud loomsed valgud, mis on sidekoe oluliseks
komponendiks. Oma struktuurilt on kollageenid homo- või heteromeersed trihelikaalsed
valgud ja neid tähistatakse rooma numbritega (vt. joonis 4). Imetajatel on praeguseks teada
40 kollageeni α-ahela geeni, mis kodeerivad 28 erineva kollageeni sünteesi (Gelse jt. 2003).
Kollageenidele iseloomulikuks jooneks on α-ahelates sisalduv korduv järjestus Gly-X-Y, kus
X ja Y tähistavad aminohapet. Glütsiinist järgmine aminohape (X) on sageli proliin ja
ülejärgmine (Y) hüdroksüproliin. Kollageenide triheeliksid moodustavad supramolekulaarseid
struktuure, mis jaotatakse omakorda alamperekondadesse (Brinkmann jt. 2005):
Suprastruktuur
Kollageeni tüüp
1) Fibrillid I, II, III, V, XI, XXIV, XXVII
2) Fibrill-assotseeritud kollageenid IX, XII, XIV, XVI, XIX, XXI, XXII
3) Võrgustikud IV, VI, VIII, X
4) Ankruna toimivad fibrillid VII
5) Transmembraansed kollageenid XIII, XVII, XXIII, XXV
6) Multipleksiinid XV, XVIII
12

Kuna multipleksiinid sisaldavad glükoosaminoglükaani (GAG) ahelat, siis paigutatakse neid
ka proteoglükaanide alla. Multipleksiinid kuuluvad basaalmembraani koosseisu.
Joonis 4. Kollageeni triheeliks. ( http://en.wikipedia.org/wiki/File:Collagentriplehelix.png)
Kollageenide retseptoriteks on põhiliselt integriinid α1β1, α2β1, α10β1 ja α11β1 (Barzyk jt.
2009). Transmembraansed kollageenid XVII ja XXIII seonduvad integriinidele
aminohappelise järjestuse RGD või KGD abil (Nykvist jt. 2001, Banyard jt. 2003).
Kollageenid võivad seonduda ka fibronektiinile, perlekaanile, nidogeen-2-le ja hepariinile (Tu
jt. 2002, Ackley jt. 2003, Aumailley jt. 1989).
Kollageenid on oma suure tõmbe- ja survetaluvuse tõttu liigeste ja kõõluste oluliseks
komponendiks. Kollageenid kuuluvad ka basaalmembraani koosseisu ning osalevad
retseptorite vahendusel signaaliülekanderadades. Imetajates on kollageeni põhilisteks
sünteesijateks fibroblastid. Fibroblastide kasutamine inimese embrüonaalsete tüvirakkude
toitekihina on laialt levinud praktika.
1.3.3. Nidogeen
Nidogeenid ehk entaktiinid on valgud, mis kuuluvad basaalmembraani koosseisu ja
arvatakse ühendavat kollageeni- ja laminiinivõrgustikku. Nidogeeni lagundamist peetakse
oluliseks etapiks basaalmembraani ümberkorraldamise ja lagundamise protsessis (Alexander
jt. 1996). Nidogeeni sünteesivad eelkõige mesenhüümirakud ja vähesel määral ka
endoteelirakud (Ho jt. 2008). Praegu tuntakse kaht erinevate geenide poolt kodeeritud
nidogeeni. Nidogeen-1 seondub laminiini γ1-, γ2- ja γ3-subühikutele (Durbeej 2010), mitmele
kollageenile (I, IV, XV, XVIII), perlekaanile ja fibuliinile (Tu jt. 2002, Ackley jt. 2003,
Aumailley jt. 1989, Ries jt. 2001). Nidogeen-2 seondub kollageenidele I ja IV, perlekaanile
ning samuti laminiini γ1-ahelale. Laminiini γ1-ahelale seondub nidogeen-2 nõrgemalt kui
nidogeen-1 (Kohfeldt jt. 1998).
1.3.4. Proteoglükaanid ja glükoosaminoglükaanid
Proteoglükaanid on lineaarse struktuuriga valgud, millele on kovalentselt seotud üks
või mitu glükoosaminoglükaani (GAG) ahelat. Füsioloogilistes tingimustes kannavad
proteoglükaanid laengut, sest GAG-ahelad (v.a hüaluroonhape) sisaldavad uroonhapet ja
13

sulfaatrühmi. GAG-ahelaid on nelja tüüpi: heparaansulfaadid, keratiinsulfaadid,
dermataansulfaadid ja kondroitiinsulfaadid. Proteoglükaane liigitatakse nendega seotud GAGahelate
järgi, kuigi on leitud, et üks ja seesama proteoglükaan võib olla seotud mitme erineva
glükaani ahelaga. Näiteks sündekaanid liigitatakse küll heparaansulfaatsete proteoglükaanide
hulka, ent nad võivad olla seotud ka teiste GAG-ahelatega (Deepa jt. 2004). Proteoglükaanide
hulka arvatakse ka multipleksiinid (Ricard-Blum ja Ruggiero 2005). hEC-de ja hESC-de
marker Tra-1-60 on keratiinsulfaatne proteoglükaan (Badcock jt. 1999). Heparaansulfaat
seondub ka laminiinide α-ahelate LG4 domäänile (vt. joonis 3). Hepariini siduv piirkond on
olemas ka fibronektiini struktuuris (Mostafavi-Pour jt. 2001). Heparaansulfaatsed
proteoglükaanid reguleerivad fibroblasti kasvufaktorite (FGF, fibroblast grothw factor,
ingl.k.) aktiivsust (Dvorak jt. 1998). bFGF ehk FGF2 on üks hESC-de söötme olulisi
komponente.
1.3.5. Integriinid
Integriinid on kõige enam uuritud laminiinile seonduvad molekulid.. Integriinid on
heterodimeersed transmembraansed valgud, mis ühendavad omavahel raku välis- ja
sisekeskkonna. Integriinid koosnevad kahest subühikust - α ja β. Praegu tuntakse 18 α- ja 8 β-
subühikut, mis moodustavad omavahel 24 erinevat paari. Lisaks on teada, et mõned
subühikuid on läbinud alternatiivse splaissimise ning see mõjutab neid subühikuid sisaldavate
integriinide bioloogilisi funktsioone (Thorsteinsdóttir jt. 1995).
Lisaks laminiinidele seonduvad integriinid ka teistele ekstratsellulaarse maatriksi
komponentidele nagu vitronektiin, fibronektiin ja kollageen. Kaheksa integriini tunnevad ära
RGD-järjestust, mis paikneb sellistes ECM komponentides nagu fibronektiin, vitronektiin,
osad kollageenid ning mõned laminiini vormid (Barzyk jt. 2009, Dickinson jt. 1994, Nykvist
jt. 2001, Banyard jt. 2003, Schvartz jt. 1998, Sasaki ja Timpl 2001). On leitud et hiire
perlekaan on võimeline seonduma integriinidele, aga inimese perlekaan RGD-järjestuse
puudumise tõttu mitte (Iozzo 1998). Tabelist 1 on näha, et üks ja seesama integriin võib
seonduda mitmele erinevale laminiinile.
Rakuvälises maatriksis paiknevad ligandid seonduvad integriinide α- ja β- subühiku
ühinemiskohta, kuid ainult α-subühik on see, mis määrab ära spetsiifilisuse ligandi suhtes.
Signaalid võivad liikuda väliskeskkonnast raku sisemusse ja vastupidi. Signaali ülekanne, mis
seisneb integriini konformatsiooni ja aktiivsuse muutuses, võib toimuda nii mehhaniliselt kui
ka biokeemiliste reaktsioonide kaskaadi kaudu.
14

Joonis_5. Integriinid ja nende ligandid. (Barzyk jt. 2009)
RGD ja GFOGER on aminohappelised järjestused, mis sisalduvad ligandis. G – Glütsiin, F – fenüülalaniin, E –
glutamaat, R – Arginiin, D – aspartaat, O – hüdroksü-proliin. RGD-järjestus esineb fibronektiinis, vitronektiinis
ja fibrinogeenis. GFOGER-järjestus kollageenides. Parempoolses kollases sektoris on kujutatud leukotsüütide
retseptorid.
1.3.6. Düstroglükaan
Düstroglükaan on glükoproteiin. Praegu tuntakse kaht düstroglükaani – α- ja β-
düstroglükaan. Need sünteesitakse ühelt transkriptilt ja tekkinud propeptiid lõigatakse
posttranslatsiooniliselt kaheks. Rakuvälise α-düstroglükaani molekulkaal on 156 kDa ja
transmembraansel β-düstroglükaanil 43 kDa. α-düstroglükaan on β-düstroglükaani kaudu
rakkudega siiski ühendatud. α-düstroglükaan seob lihaskoes omavahel ECM-i ja sarkolemmi.
On leitud, et seda molekuli on lihaskoes vähem, kui haigel esineb Duchenne’i lihasdüstroofia
(Ibraghimov-Beskrovnaya jt. 1992). Düstroglükaani võib leida ka mitmetest teistest kudedest,
kusjuures suurel hulgal on düstroglükaani epiteelirakkude basaalsel poolel (Durbeej jt. 1998).
Düstroglükaan seondub erinevatele laminiinidele, seal hulgas laminiinidele 111, 311 ja 511,
fibronektiinile perlekaanile ja agriinile (Ervasti ja Campbell 1993, Apel jt. 1995, Jones jt.
2005, Yu ja Talts 2003, Talts jt. 1999).
15

2. Embrüonaalseid tüvirakke ümbritsev rakuväline maatriks
2.1. Basaalmembraanid varajases embrüos ja embrüoidkehades
Inimese embrüonaalsed tüvirakud saadakse blastotsüsti staadiumis olevate embrüote
sisemisest rakumassist. Siiski, eetilistel põhjustel ei ole inimembrüod tavapäraselt teaduslikes
uuringutes kasutusel. Embrüogeneesi uurimiseks on parimateks kasutatavateks mudeliteks
hiirte embrüod ning samuti hESC-d, mis teatud tingimustes kasvatatuna moodustavad
embrüoidkehasid. Nimelt imiteerib embrüoidkehade areng embrüogeneesi.
Hiire embrüotes on rakuväline maatriks tuvastatav juba kaherakulises staadiumis
(Dziadek ja Timpl 1985). Basaalmembraan moodustub alles blastotsüsti staadiumis ega ole
vajalik moorula moodustumisele eelneval perioodil. Preimplantatsioonilise blastotsüsti
staadiumis eristub basaalmembraan esmalt trofektodermi piirkonnas (ekstraembrüonaalne
basaalmembraan) ja laieneb peri-implantatsiooniliselt (E4-4,5 arengujärk) sisemise rakumassi
(inner cell mass, ICM ingl.k.) lateraalsetesse osadesse, moodustades embrüonaalse
basaalmembraani, mis eraldab üksteisest hüpoblasti ehk primitiivse endodermi ja ülejäänud
ICM-i (Salamat jt. 1995). Hüpoblast jaguneb implantatsioonijärgselt vistseraalseks ja
parietaalseks endodermiks. Parietaalse endodermi rakud liiguvad trofektodermi pinnal ümber
embrüo ja sünteesivad Reicherti membraani. Reicherti membraan on basaalmembraani
erivorm, mis on tavapärasest basaalmembraanist paksem (Pöschl jt. 2004). Reicherti
membraani moodustumise häired on embrüo jaoks letaalsed (Miner jt. 2004, Pöschl jt. 2004).
Embrüonaalsele basaalmembraanile kinnitunud ICM rakkudest areneb pluripotentne epiblast,
mis viitab võimalusele, et basaalmembraan indutseerib neis rakkudes transkriptsioonifaktori
Nanog ekspressiooni (Mitsui jt. 2003). Hiire embrüoidkehadega läbiviidud katse näitas, et
embrüonaalne basaalmembraan osaleb ühes vistseraalse endodermi (VE) rakkudega ka
proamniootilise õõne moodustumisel (E5,5-6.0 arengujärk) (Murray ja Edgar 2000). Esialgu
arvati, et VE rakud põhjustavad osade epiblasti rakkude apoptoosi, samas kui embrüonaalne
basaalmembraan tagab õõnt ääristavate rakkude ellujäämise (Coucouvanis ja Martin 1995),
kuid hilisem uuring näitas, et basaalmembraan osaleb ka rakkude apoptoosi esilekutsumises
(Murray ja Edgar 2000). Proamniootilise õõne tekkega kaasneb epiblasti muutumine
epiteliaalseks (vt. joonis 6) ning ekstraembrüonaalse ektodermi eristumine epiblastist (Downs
ja Davies 1993). L. Armstrong Newcastle’i ülikoolist väitis, et hESC-dele võivad arenguliselt
vastata epiblasti staadiumis hiire pluripotentsed rakud (Madissoon 2008). Seega võiks
epiblasti pluripotentsuse säilitamise ja kaotamise mehhanismide uurimine aidata leida in vivo
ja in vitro mooduseid, kuidas hESC-sid koekultuuris paremini kasvatada.
16

Joonis_6. Proamniootilise õõne
moodustumine hiire embrüos.
Kollane – trofektoderm
Sinine – parietaalne endoderm
Pruun – vistseraalne endoderm
Helelilla – embrüonaalne
ektoderm/epiblast
Lilla – basaalmembraan
Pseudostratified columnar epithelium –
pseudokihistunud
silinderepiteel
Proamniotic cavity – proamniootiline
õõs
Blastocyst – blastotsüst
Egg cylinder – Munasilinderjas
embrüo
Ülemises reas on toodud sagitaalvaade ja alumises reas transversaalsed lõiked. Punktiirjoon viitab kohale, kust
transversaalne lõige on tehtud. (Coucouvanis ja Martin 1995)
2.2. Rakuvälise maatriksi valgud ning neile vastavad retseptorid hiire embrüos,
embrüoidkehades ja hESC-des
2.2.1. Laminiinide ekspressioon hiire embrüos, embrüoidkehades ja hESC-des
2.2.1.1. Laminiinide ekspressioon hiire embrüos
Kõige varasem rakuvälise maatriksi valk, mis ekspresseerub embrüo koes on Lm111.
Cooper ja MacQueen (1983) näitasid, et laminiini β1- ja γ1-ahelaid sünteesitakse esmalt 4-
või 8-rakulises staadiumis, samas kui α1-ahel on tuvastatav alles 16-raku staadiumis. Hiljem
on näidatud, et laminiin on hiire embrüo rakkude pinnal tuvastatav juba kaherakulises
staadiumis (Dziadek ja Timpl 1985). Hiire embrüo arengujärkudes E5,5-E7,5 sünteesitakse
laminiinidest vaid Lm111 ja Lm511, kusjuures Lm111 on peamiselt lokaliseerunud Reicherti
membraani ja Lm511 embrüonaalsesse membraani (Miner jt. 2004). Laminiini β1 või γ1
ahelat mitte sünteesivatel hiirtel basaalmembraane ei moodustu ja nad surevad enne E5,5
arengujärku (Smyth jt. 1999, Miner jt. 2004). Laminiini α1-ahela LG-4-5 domäänide
puudumine ei takista basaalmembraani moodustumist ega primitiivse endodermi teket, kuid
hiired surevad siiski enne E7 arengujärku, sest ei moodustu Reicherti membraani (Miner jt.
2004, Schéele jt. 2005). Neis kahes töös on siiski vastuolu. Schéele jt. näitasid oma töös, et
domääni LG4-5 mitte sünteesivate hiirte embrüotes proamniootilist õõnt ei moodustu, ent
Miner jt. näitasid oma töös, et LAMA1-/- hiirtes siiski toimub proamniootilise õõne
moodustumine, kuigi õõs ja embrüo ise on metsiktüüpi hiirtes palju suuremad.
LAMA1-/- hiirtes on laminiini sekrektsioon ja trimeeri moodustumine võimalik
seetõttu, et Lm511 asendab basaalmembraanis Lm111 (Schéele jt. 2005). Reicherti
membraanis ei ole Lm511 võimeline asendama Lm111 isegi mitte sel juhul kui
17

geenitehnoloogiliselt suurendada α5-ahela ekspressiooni (Miner jt. 2004). LAMA5-/- hiired
surevad E14-E17 arengujärgus, mis näitab, et embrüonaalses basaalmembraanis suudab α1-
ahel α5-ahelat asendada. α1- ja α5-ahel on mõlemad olemas ka amnionis, rebukotis ja
platsentas (Miner jt. 1998). LAMA5-/- hiirte surma põhjuseks arvatakse olevat trofoblasti
ebapiisav seostumine loote endoteelirakkude pinnal olevale basaalmembraanile, mille
tulemusel on veresoontevõrgustiku väljakujunemine häiritud (sama töö).
2.2.1.2. Laminiinide ekspressioon hiire embrüoidkehades
Laminiin on vajalik basaalmembraani moodustumiseks ka embrüoidkehades
(Aumailley jt. 2000, Smyth jt. 1999, Murray ja Edgar 2000). LAMC-/- embrüoidkehad ei
sekreteeri laminiini, kuigi polüklonaalsed antikehad näitavad Lm111 olemasolu ICM-s
(Smyth jt. 1999). LAMC1-/- embrüoidkehades ei toimu proamniootilise õõne ega ka epiblasti
epiteeli ehk embrüonaalse epiblasti teket, kuid embrüonaalsed ektodermaalsed rakud ja
lootevälised endodermaalsed rakud siiski diferentseeruvad (Murray et Edgar 2000, Smyth jt.
1999). See näitab, et kuigi laminiini γ1-ahel ja basaalmembraan on epiblasti polarisatsiooniks
vajalikud, ei mõjuta nende puudumine epiblasti diferentseerumist vähemalt mõnes suunas.
Kui Lm111 lisada embrüoidkehade kasvukeskkonda, siis basaalmembraanid taastuvad,
kusjuures positiivse efekti annab ka α2-ahelat sisaldava laminiini lisamine (Li jt. 2002). α5-
ahelat sisaldavaid laminiine selles töös ei kasutatud, kuid varasemast on teada, et varases
emrbüogeneesis asendab α5-ahel α1-ahela (Schéele jt. 2005). Nii Lm111, Lm211 kui ka
Lm511 seonduvad düstroglükaanile (vt tabel 1). Düstroglükaani olulisusele varases
embrüogeneesis viitab asjaolu, et kui lisati muteerunud LG4 domääniga Lm111 või lisati seda
koos hepariiniga (hepariin seondub nagu α-düstroglükaangi LG4-le), ei toimunud LAMC1-/-
embrüoidkehades basaalmembraanide teket (vt. ka punkt 2.2.2.).
2.2.1.3. Laminiinide ekspressioon hESC-des
Hiire embrüonaalsetel fibroblastidel kasvavad hESC-d sünteesivad eelkõige Lm511 ja
Lm521 mRNA-d, vähem Lm111 mRNAd ning väga väikestes kogustes mõningate teiste
laminiinide mRNA-d (Miyazaki jt. 2008). Matrigel-maatriksil, millele on lisatud MEF-de
konditsioneeritud söödet, kasvavad hESC-d sünteesivad Lm511 ja Lm111 heterotrimeere
(Vuoristo jt. 2008). Braam jt. (2008) näitasid, et Lm111 paikneb toiterakkudest sõltuvas
hESC-de kultuuris peamiselt toiterakkude ümber.
18

2.2.2. Düstroglükaani ekspressioon hiire embrüos ja embrüoidkehades
DAG-1-/- (dystrophin-associated glycoprotein 1, ingl.k) hiired surevad enne E6,5
arengupäeva, kuna on häiritud Reicherti membraani moodustumine (Williamson jt. 1997).
Embrüoidkehi kasutades on näidatud, et düstroglükaan ekspresseerub valgu tasemel juba
ICM-s ning basaalmembraani tekkimisel paikneb see basaalsesse tsooni (Li jt. 2002). DAG-1-
/- embrüoidkehades toimub normaalne basaalmembraanide teke ja proamniootilise õõne
moodustumine, mis autorite arvates viitab sellele, et basaalmembraanide kujunemiseks vajalik
side Lm111 LG4-domääniga tekib heparaansulfaatsete proteoglükaanide ja mitte
düstroglükaani kaudu. Li jt. (2002) näitasid ka, et integriin β1-ahela -/- embrüoidkehades on
düstroglükaani tase tavapärasest kõrgem. Huvitav on see, et integriini β1-ahela -/-
embrüoidkehades säilib Lm111 lisamisel tavapäraselt kõrgem düstroglükaani tase, ent LAMC-
/- embrüoidkehades kutsub Lm111 lisamine esile düstroglükaani taseme languse. Samas töös
leiti seos β-düstroglükaani ekspressioonitaseme ja LG1-3-ga, mis on integriinide
seondumiskohaks.
2.2.3. Integriinide ekspressioon hiire embrüos, embrüoidkehades ja hESC-des
2.2.3.1. Integriinide ekspressioon hiire embrüos ja embrüoidkehades
Integriini subühiku β1-/- embrüoidkehades basaalmembraani ega proamniootilist õõnt
ei moodustu (Li jt. 2002, Aumailley jt. 2000). Arvatakse, et põhjuseks on Lm111 puudumine
rakuvälises ruumis. Analoogselt ei toimu integriin β1-/- hiirtes epiblasti eristumist ega
proamniootilise õõne teket ja embrüod surevad vahetult pärast implantatsiooni (Fässler jt.
1995, Stephens jt. 1995). Kimäärsed hiired arenevad normaalselt, kui integriini β1-/- rakkude
arv jääb alla 25%. Integriin β1-/- rakke võib leida mitmetes kudedes, mis viitab sellele, et
rakud saavad adhesiooniks ja migreerumiseks kasutada alternatiivseid ECM-le seonduvaid
retseptoreid (Fässler jt. 1995). Integriinide α-ahelate puhul on näidatud kompensatsiooni
mehhanismi olemasolu. Nimelt integriinide subühikute α3-/- ja α6-/- hiired surevad alles
pärast sündi, kuid integriinide subühikute α3-/-;α6-/- hiired juba E16,5 arengujärgus (De
Arcangelis jt. 1999, Georges-Labousse jt. 1996, DiPersio jt. 1997). Integriinide α-ahelatest on
embrüonaalses eas olulisemad veel α4 ja α5, mis kuuluvad fibronektiini retseporite
integriinide α4β1, α4β7, α5β1 koosseisu (Yang jt. 1993 ja 1995, Barzyk jt. 2009). Fakt, et
integriinide subühikute α5-/- ja α4-/- hiired surevad hiljem kui fibronektiin-/- hiired, viitab
võimalusele, et neid ahelaid sisaldavad retseptorid saavad üksteist kompenseerida.
19

2.2.3.2. Integriinide ekspressioon hESC-des
Koekultuuris ekspresseeruvad hESC-del kõige enam integriinid α6β1, α3β1, α5β1 ja
αVβ5, mis on vastavalt laminiinide, fibronektiini ja vitronektiini retseptorid (Miyazaki jt.,
2008, Vuoristo jt. 2008, Braam jt. 2008, Barzyk jt. 2009). hESC-de puhul on integriinide
süntees maatriksist sõltuv. Matrigelil kasvatatud hESC-de korral inhibeerib integriini β1-ahela
blokeerimine adhesiooni ja prolifereerumise. Kui aga kasutada Matrigeli ja vitronektiini segu,
siis integriini β1-ahela blokeerimine ei anna samasugust efekti: rakud kinnituvad maatriksile
ja jagunevad (Braam jt. 2008). Evseenko jt. (2009) tõestasid, et hESC-d kasutavad integriin
α6β1, et kinnituda Lm511-le. Matrigelil kasvavad hESC-d tõeonäoliselt kasutavad integriin
α6β1 Lm111-le seostumiseks (Xu jt. 2001).
2.2.4. Nidogeeni ekspressioon hiire embrüos ja embrüoidkehades
Dziadek ja Timpl (1985) näitasid, et juba 16-rakulistes hiire embrüotes sünteesitakse
nidogeeni ning see esineb koos Lm111-ga nii blastotsüstistaadiumis kui ka
postimplantatsiooniliselt. LAMC-/- embrüoidkehades ei jää nidogeen rakkude vahelisse ruumi
püsima, vaid eritub kasvukeskkonda (Smyth jt. 1999). Juba varem on näidatud, et nidogeen ja
Lm111 moodustavad parietaalse endodermi rakkudes rakusisese kompleksi (Chung jt. 1993),
kusjuures nende seondumine toimub γ1-ahela kaudu (Mayer jt. 1993). Nidogeen-1 ja Lm511
kompleksi lisamine hESC-de suspensiooni, kus rakud paiknevad üksikult, võimaldab
kasvatada embrüoidkehasid üksikutest rakkudest (Evseenko jt. 2009). Nidogeen-2 seondub
laminiinile nõrgemalt kui nidogeen-1 (Kohfeldt jt. 1998), kuid on suuteline knock-out hiirtes
nidogeen-1 asendama (Murshed jt. 2000).
2.3.5. Kollageeni ekspressioon hiire embrüos, embrüoidkehades ja hESC-des
Kollageeni IV ekspressioon hiire embrüos langeb kokku hüpoblasti eristumisega
(Leivo jt. 1980). Kollageen IV puudumine embrüo varasel arenguperioodil tingib
basaalmembraanide ebakorrapärase struktuuri ja basaalmembraani paksuse vähenemise, kuid
see ei takista varaste embrüonaalsete basaalmembraanide moodustumist ega põhjusta muid
häireid embrüo varases arengus (Pöschl jt. 2004). Kollageen IV osutub hädavajalikuks
Reicherti membraani moodustumisel ning selle puudumine põhjustab hiire embrüote surma
E10,5-E11,5 arengujärgus (Pöschl jt. 2004). Kollageen I ja III on rakkude vahel nähtavad 8.
embrüo arengupäeval, kusjuures nad paiknevad mesodermaalsetes struktuurides ja nende
20

läheduses (Leivo jt. 1980). Kollageen IV sünteesitakse ka hiire embrüoidkehades, kuid
laminiini γ1-ahela puudumise korral võib seda leida trofektodermi all vaid vähesel hulgal ja
see paikneb seal stuktuuritult (Smyth jt. 1999). Kollageen I ja kollageen IV on leitud ka
toiterakkudel kasvavate hESC-de, kasvukeskkonnast, mis viitab sellele, et neid sünteesivad
toiterakud ise, mitte hESC-d (Braam jt. 2008).
2.3.6. Fibronektiini ekspressioon hiire embrüos ja hESC-des
Fibronektiin -/- hiire looted implanteeruvad ja alustavad gastrulatsiooni. Arenguhäired
ilmnevad 8. päeval: struktuurid, mis metsiktüüpi hiirtes on fibronektiini poolest rikkad
(notokord ja somiidid), jäävad moodustumata (George jt. 1993). Fibronektiin -/- hiirte areng
katkeb 11. arengupäeva paiku. Toiterakkudel kasvavad hESC-d sünteesivad fibronektiini,
kuid immunofluorestsentsanalüüs näitab, et fibronektiini leidub eelkõige toiterakkude vahel
ning hESC-de kolooniate äärtel ja nende keskel ehk piirkondades, kus kõige tõenäosemalt
toimub rakkude diferentseerumine (Braam jt. 2008).
21

3. hESC-de koekultuuris kasvatamine
3.1. hESC-de toiterakkudel kasvatamine
3.1.1 hESC-de hiire embrüonaalsetel fibroblastidel kasvatamine
1998. aastal loodi esimesed inimese embrüonaalsete tüvirakkude liinid: Thomson jt.
õnnestus 14-st blastotsüsti staadiumis oleva embrüo sisemisest rakumassist kasvatada MEFdel*,
mille rakutsükkel oli mitoosis peatatud, viis tüvirakuliini (H1, H7, H9, H13, H14). Nad
kasutasid söötmena DMEM-i (ilma bFGF-ta), millele oli lisatud 20% veise loote seerumit
(foetal bovine serum, ingl. k., FBS). Nendes rakkudes ekspresseerusid pluripotentsusmarkerid
SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 ja Tra-1-81 ning neil oli kõrge fosfataasi ja telomeraasi aktiivsus
ning stabiilne karüotüüp. 4-5 kuu pärast olid need rakud suutelised moodustama kõigi kolme
lootelehe rakke ja tootma koorioni gonadotropiini. Reubinoff jt. kordasid seda katset 2000.
aastal ning said samasugusel toitekihil ja söötmes embrüo sisemise rakumassi rakkudest kaks
hESC rakuliini: HES1 ja HES2. Mõlemad töörühmad täheldasid, et hESC-d vajavad
pluripotentsuse säilitamiseks MEF-de maatriksit ning hESC-d erinevalt mESC-dest ei
ekspresseeri pinnamarkerit SSEA-1. Park jt. (2003) näitasid. et inimese embrüonaalseid
tüvirakke saab lisaks hiire primaarsetele fibroblastidele, mida kasutasid Thomson ja
Reubinoff, kasvatada ka STO-rakuliinil. STO-rakuliin on saadud SIM hiireliini (Sandos
Inbred Mice, ingl. k., SIM) embrüonaalsetest fibroblastidest. PMEF-de (Primary Mouse
Embryonic Fibroblasts, primaarsed hiire embrüonaalsed fibroblastid, ingl.k) kasutamine
kätkeb endas ohtu kanda hESC-dele edasi viirusi, mükoplasmasid ja seeni. Erinevalt STOrakkudest
on PMEF-de jagunemine piiratud, mistõttu neid tuleb korduvalt hiire embrüotest
eraldada, ja passeerimiste arvu suurenedes väheneb nende võime toetada hESC-de
pluripotentsust. 2009. aastal said Camarasa jt. veel kolm hiire embrüonaalsete fibroblastide
liini, millest tehtud toitekihil säilus kuue hESC liini pluripotentsus.
*Nii MEF-de, PMEF-de kui ka kõigi teiste rakkude, mida toitekihina kasutatakse, rakujagunemine tuleb peatada mitoosis
enne kui neil kasvatada embrüonaalseid tüvirakke. Selleks kasutatakse γ-kiirgust või töötlust mitomütsiin C-ga. Kiiritamine
tekitab DNA-ahelatesse katked, samas kui mitomütsiin tekitab CpG-järjestusspetsiifilisi sildu.
3.1.2. hESC-de inimese rakkudel kasvatamine
3.1.2.1. hESC-de inimese fibroblastidel kasvatamine
Richards jt. (2002) olid esimesed, kes kasvatasid hESC-sid inimesest pärit
toiterakkudel. Seejuures katsetasid nad toitekihina fibroblaste, mis pärinesid kas
embrüonaalsest lihaskoest, embrüonaalsest nahast või täiskasvanud inimese munajuha
epiteelkoest. Fibroblaste kasvatati tingimustes, kus puudusid ksenogeensed molekulid.
22

Inimesest pärit fibroblastidel kasvanud hESC-id kandsid pinnamarkereid SSEA-3, SSEA-4 ja
Tra-1-60. Neist rakkudest leiti transkriptioonifaktor Oct-3/4 mRNA-d, neis oli aktiivne
aluseline fosfataas ning nad põhjustasid immuunpuudulikes hiirtes kõigi kolme lootelehe
rakke sisaldavaid kasvajaid. Inimese fibroblastidel kasvatatud hESC-de kolooniates oli vähem
diferentseerunud rakke kui MEF-del kasvatatud hESC-des ja neid tuli passeerida harvemini
kui MEF-del kasvavaid rakke. See-eest olid hESC-de kolooniad suuremad ja hõredamad ning
neid oli raskem passeerida kui MEF-del kasvanud kolooniaid. Samas töös näidati, et uusi
hESC-liine on võimalik luua kasvatades rakke inimese vere seerumit sisaldavas DMEMsöötmes
inimese embrüonaalsest lihaskoest pärinevatel fibroblastidel. Samad autorid näitasid
oma hilisemas töös (2003), et täiskasvanud inimese nahast saadud fibroblastid sobivad samuti
hESC-de toitekihiks. Kuna nahabiopsia teostamine on kerge ja läbiviidav kõigil inimestel, siis
on nahast pärit fibroblastide toitekihina kasutamisel suur terapeutiline potentsiaal.
Amit jt. (2003) tõestasid, et hESC-de liine I-6, I-3 ja H9 saab pikka aega (70
passeerimist) kasvatada inimese eesnahast pärit fibroblastidel, kusjuures toiterakke tuli
vahetada alles pärast 42. passeerimist. hESC-del ekspresseerusid pinnamarkereid SSEA-4,
Tra-1-60, Tra-1-81, nõrgalt ka SSEA-3, kuid diferentseerumisele viitavat pinnamarkerit
SSEA-1 ei tuvastatud. Kõigi kolme hESC-de liini rakud andsid immuunpuudulikes hiirtes
kolme erineva lootelehe rakke sisaldavaid kasvajaid. I-3 ja I-6 rakud moodustasid
suspensioonis kasvatatuna embrüoidkehasid. hESC-de kolooniate kuju ei olnud tavapäraselt
ümar, vaid piklik (vt. joonis 7), kuid rakud säilitasid oma ümara kuju, väikese tsütoplasmatuuma
suhte ja neis võis näha tuumakest. Ellerström jt. (2006) näitasid, et inimese eesnaha
fibroblaste (human foreskin fibroblasts, ingl.k., HFF) võib edukalt kasutada hESC-de liinide
loomiseks.
Joonis 7. hESC-d moodustavad erinevatel maatriksitel erineva morfoloogiaga kolooniaid. A - hESC-de
koloonia, mis kasvab hFF-del (Amit jt. 2003). B - tavapärane ümar tüvirakukoloonia MEF toitekihil. (Thomson
jt. 1998). Mõõtjoonele vastab 100µm.
HFF-de eluea pikendamiseks on neid ka geenitehnoloogiliste võtetega surematuks
muudetud. Cai jt. (2007) näitasid, et HFF-d, millesse viidi Wnt3a geeni sisaldav vektor
tagasid hESC-de kolooniate parema kasvu ja pluripotentsuse säilimise kui vektorita HFF-d.
23

Unger jt. (2009), kasutasid vektoreid, mis sisaldasid valku bFGF ja onkovalke TERT ning
Bmi kodeerivaid geene ja täheldasid, et kõiki kolme vektorit sisaldavad HFF-d ei ilmutanud
ka pärast 49. passeerimist apoptoosile ega vananemisele viitavaid märke.
3.1.2.2. hESC-de autogeensetel fibroblastid kasvatamine
2005. aastal õnnestus Stojkovic jt. töörühmal kasvatada hESC-sid autogeensetel
fibroblastidel. Kasutati seerumi asendajaga DMEM söödet, millele lisati 4 ng/ml bFGF-i.
hESC-del ekspresseerusid pinnamarkerid SSEA-4 ja Tra-1-60 ning neis leiti Tert, Oct3/4,
Nanog, Rex-1 ja Foxd3 mRNA-d ning neil säilus võime diferentseeruda kõigi kolme
lootelehe rakkudeks. Chen jt. (2009) kasvatasid hESC-sid autogeensetel fibroblastidel
(hESCdF), kusjuures see toimus ksenogeenidest vabas keskkonnas. Fu jt. (2009) katsetasid
toitekihina nii hESC-dest diferentseerunud fibroblaste kui ka hESC-dest moodustunud
embrüoidkehadest eraldatud fibroblaste ja leidsid, et viimased olid sobivamad, sest
sekreteerisid keskkonda rohkem bFGF-i ning rakud kasvasid ja säilitasid pluripotentsuse
paremini just embrüoidkehadest eraldatud fibroblastidel.
3.1.2.3. hESC-de inimese rakkudel (v.a. fibroblastid) kasvatamine
Cortes jt. (2009) näitasid, et kui tahetakse saada hESC-de liine „halva kvaliteediga”
külmutatud embrüotest, siis ei ole võimalik eesnahast pärinevaid fibroblaste kasutada.
Seevastu inimese mesenhümaalsetel tüvirakkudel kasvatatud rakuliinid säilitasid
pluripotentsuse: rakud ekspresseerisid pinnamarkereid SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 ja Tra-1-
81 ning transkriptsioonifaktorite Oct3/4, Nanog, Rex-1 ja Sox-2 mRNA-d ning olid
võimelised in vitro moodustama embrüoidkehasid.
hESC-sid on kasvatatud ka inimese platsentast pärinevatel toiterakkudel (Park jt.
2010), kusjuures nad ei vajanud eksogeenset bFGF-i. Neis rakkudes ekspresseerusid ALP,
SSEA-4, Tra-1-60, Oct-4, Nanog ja Rex-1 ning nad olid suutelised moodustama
embrüoidkehasid. Huvitav on seejuures märkida, et endomeetriumist eraldatud rakud ei toeta
hESC-de pluripotentsuse säilimist ega kasvu (Richard jt. 2003).
Cheng jt. (2003) kasvatasid hESC-sid inimese luuüdist pärinevatel rakkudel. Neil
hESC-del olid tuvastatavad pinnamarkerid SSEA-4 ja tanskriptsioonifaktor Oct3/4 mRNA-d
ja nad olid suutelised suspensioonis kasvatatuna moodustama kõigi kolme lootelehe rakke.
Toitekihi võime toetada hESC-de jagunemist ja pluripotentsuse säilimist vähenes oluliselt
pärast kuuendat passeerimist, viidates vajadusele kasutada geenitehnoloogilisi võtteid, et need
24

akud muuta surematuks. Luuüdirakkude eelisteks on läbiuuritus ja nende kasutamine
kliinilises praktikas.
Ji jt. (2009) näitasid, et inimese embrüonaalse maksa sidekoest eraldatud rakud, mis
sisaldasid HIF-1α-t (hypoxia inducible factor, ingl.k) kodeerivat geeni, on edukalt kasutatavad
hESC-de toitekihina, tõstes transkriptioonifaktorite Nanog ja Oct3/4 mRNA taset ja
soodustades embrüoidkehade moodustamist. Samad toiterakud, mis ei olnud transfekteeritud
HIF-1α-t kodeeriva geeniga, suunasid hESC-d juba 5.-6. päeval pärast passeerimist
diferentseeruma. Ji jt. toetusid oma töös Ezashi jt. (2005) tõestatud väitele, et hESC-d
säilitavad pluripotenstuse paremini hapnikuvaeses keskkonnas (1-5% hapnikku
gaasikeskkonnas) ehk keskkonnas, mis sarnaneb enim preimplantatsioonilise embrüo
loomulikule keskkonnale, kus hapnik kandub vedelikkeskkonnas embrüoni difusiooni teel.
Kuna luuüdi tüvirakud kasvavad samuti hüpoksilistes tingimustes, siis on lootust, et HIF-1α
üleekspressiooni esile kutsumine säilitab nende normaalse fenotüübi pika aja vältel ning
parandab nende kui toitekihi võimet säilitada hESC-de pluripotentsus.
3.2. hESC-de ilma toiterakkudeta kasvatamine
3.2.1. hESC-de rakuvälise maatriksi komponentidel kasvatamine
3.2.1.1. hESC-de Matrigelil kasvatamine
Matrigel on rakuvälise maatriksi valkude segu, mida toodavad hiire Engelbreth-Holm-
Swarm (EHS) sarkoomi rakud. Matrigeli koostisse kuuluvad peamiselt laminiin (eelkõige
laminiin 111 (vt. punkt. 5.3.2)), kollageen IV, nidogeen ehk entaktiin, heparaasulfaat ja
kasvufaktorid ning ta sarnaneb oma koostiselt Reicherti membraanile (Ilic 2006, Zhang jt.
2005). Kahjuks sisaldab Matrigel inimorganismile võõraid molekule, näiteks Neu5Gc (Martin
jt. 2005) ning selle koostis võib varieeruda, kuid võrreldes toiterakkudega on Matrigeli
lihtsam kasutada.
Matrigelil kasvatati hESC-sid edukalt juba 2001. aastal (Xu jt. 2001). Tol korral
kasutati toitelahusena MEF-de konditsioneeritud söödet, millele lisati bFGF-i Selline sööde
on defineerimata ja varieeruva koostisega ja sisaldab hESC-de suhtes ksenogeenseid keemilisi
ühendeid. Hiljem on püütud välja töötada defineeritud koostisega söödet, mis sisaldaks
võimalikult väheses koguses ksenogeensid ühendeid. Sama töögrupp näitas, et hESC-sid on
võimalik Matrigelil kasvatada, kasutades selleks hTERT-i ekspresseeriva retroviirusega
nakatatud autogeensete fibroblastide konditsioneeritud söödet (Xu jt. 2004). Wang jt. (2005)
kasvatasid rakke Matrigelil KO-DMEM söötmes (vähendatud osmolaarsusega DMEMsööde),
mis sisaldas 20% seerumiasendajat ja 36 ng/ml bFGF-i. hESC-del ekspresseerusid
25

mitmed pluripotentsusmarkerid ja nad olid suutelised moodustama kõigi kolme lootelehe
rakke nii in vitro kui in vivo. Xu jt. (2001) ja Hakala jt. (2009) püüdsid kasvatada hESC-sid
samas söötmes, ent väiksema bFGF kontsentratsiooni juures (vastavalt 4ng/ml ja 8ng/ml),
kuid mõlemal juhul diferentseerusid rakud juba pärast teist passeerimist.
Li jt. (2005) kasvatasid hESC-sid X-VIVO-10 söötmes. Nad näitasid, et
pluripotentseid kolooniaid on seda rohkem, mida suurem on lisatava bFGF hulk. Parima
tulemuse saavutasid nad bFGF-i kontsentratsioonil 80 ng/ml. Rajala jt. (2007) kasvatasid
hESC-sid samas söötmes, kuid kümme korda väiksema bFGF hulga juures ja täheldasid, et
selline sööde ei toeta pluripotentsuse säilimist, rakkude kinnitumist ega jagunemist. Nii X-
VIVO-10 kui KO-DMEM söötmete katsetamisest ilmneb bFGF olulisus hESC-de
pluripotentsuse säilitamisel.
Nüüdseks on välja töötatud defineeritud koostisega sööde mTeSR1 (Ludwig jt.
2006b), mis põhineb TeSR1 söötmel ja sisaldab LiCl, bFGF (100ng/ml), GABA,
pipekoolhapet ja TGFβ ning sobib kasutamiseks ka koos Matrigeliga. Kahjuks sisaldab
mTeSR1 mõningaid loomseid valke nagu BSA ja zbFGF (zebrafish bFGF). mTeSR2 on sama
koostisega, mis mTeSR1, aga ei sisalda ühtegi inimorganismile võõrast valku. Mõlema
söötme miinuseks on kõrge hind.
Kui MEF-del kasvanud hESC-d passeerida mTeSR1 söötmes Matrigelile, väheneb
esialgu pluripotentsete kolooniate arv, kuid see suureneb uuesti järgnevate passeerimiste
käigus (Rajala ja Hakala, 2007; meie tähelepanekud). Rakkude valik toimub ka siis, kui
kasvatada hESC-sid rakkudel ja passeerida neid seerumivabadest tingimustest inimese
seerumiga söötmele (Chen jt. 2009). Seega pole MEF-delt Matrigelile passeerimisel toimuv
valik mitte Matrigeli kui toitekihi (või mTeSR1) sobimatusele viitav ilming, vaid hESC-de
kolooniate heterogeensusest ja heast adaptatsioonivõimest tulenev omadus.
3.2.1.2. hESC-de inimese rakuvälise maatriksi valkude kombinatsioonil kasvatamine
TeSR1 sööde töötati välja hESC kasvatamiseks ksenogeenidest vabas keskkonnas, kus
rakkude kasvupinnasena kasutati segu rakuvälise maatriksi valkudest: kollageen IV
(10µg/cm 2 ), vitronektiin (0.2µg/cm 2 ), fibronektiin (5µg/cm 2 ) ja laminiin (5µg/cm 2 ). Sellistes
tingimustes õnnestus saada hESC-sid ning neid ka edasi kasvatada. Rajala jt. (2007) üritasid
tulemust korrata samal maatriksil ja kommertsiaalses modifitseeritud TeSR1 söötmes
(mTeSR1), kuid nende kasutatud hESC rakuliin kaotas pluripotentsuse juba pärast teist
passeerimist. Toetudes Wondimu jt. (2006) tööle, kus kontrolliti erinevate kommertsiaalsete
rakuvälise maatriksi valkude, seal hulgas ka ülalmainitud katsetes kasutatud firma Sigma
26

toodetud laminiini (peamiselt Lm511) kvaliteeti, võib arvata, et tulemuste erinevus tulenes
laminiini erinevate partiide kasutamisest. Erinevus võis tuleneda ka söötmetest.
3.2.1.3. hESC-de inimese rakuvälise maatriksi valkudel kasvatamine
3.2.1.3.1. hESC-de fibronektiinil kasvatamine
hESC-sid on kasvatatud MEF-de konditsioneeritud söötmes kasutades maatriksina
rakuvälise maatriksi üksikuid valke (Xu jt. 2001). Amit jt. (2006) kasvatasid hESC-sid
fibronektiinil, söötmes, mis sisaldas lisandina bFGF ja TGFβ1. Hakala jt. (2009) püüdsid seda
korrata, kuid rakud diferentseerusid juba pärast teist passeerimist. Braam jt. (2008) leidsid, et
hESC-d kasvavad fibronektiinil MEF-konditsioneeritud söötmes, kuid rakujagunemise kiirus
väheneb oluliselt mTeSR1 söötmes.
3.2.1.3.2. hESC-de laminiinil kasvatamine
Miyazaki jt. (2008) katsetasid hESC-de kasvupinnasena erinevaid laminiine (1µ/cm 2 )
ning leidsid, hoolimata väikesest erinevusest rakuliinide vahel, et MEF-konditsioneeritud
söötmes toetab pluripotentsuse säilimist ja rakkude prolifereerumist kõige paremini Lm332.
Vähemal määral sobisid toitekihiks ka Lm511 ja Lm111, sobimatuks osutusid Lm211 ja
Lm411. Katse hiire embrüonaalsete tüvirakkudega, näitas, et neljast laminiinist (Lm511,
Lm332, Lm111, Lm411) tagas vaid üks – Lm511 – rakkude pluripotentsuse säilimise ja
jagunemise. Oluline on siinkohal märkida, et mESC-sid kasvatati LIF-ta, mis tuleb tavaliselt
mESC-de söötmesse lisada, et rakud säilitaks pluripotentsuse. Vuoristo jt. (2009) tõestasid
Lm511 sobivust hESC-de kasvupinnasena MEF-konditsioneeritud söötmes ja leidsid samas,
et hESC-de kasvu ei toeta Matrigeli peamine komponent Lm111. See laminiin, mis on
esimene hiire embrüos sünteesitav rakuvälise maatriksi valk, võis kaotada oma
funktsionaalsuse puhastamisel. Li jt. (2005) kasvatasid hESC-sid laminiinil (Sigma, 2
µm/cm 2 ) kasvufaktoritega rikastatud seerumivabas X-VIVO 10 söötmes. Kasvufaktoritest
andis märgatava efekti bFGF, mille kontsentratsioon 80 ng/ml tagas rakkude pluripotentsuse
ja jagunemise. Siiski, kolooniad olid ümbritsetud diferentseerunud epiteelirakkude-laadsete
rakkudega ja võrreldes Matrigelil kasvavate kolooniatega olid laminiinil kasvavad kolooniad
palju suuremad.
27

3.2.1.3.3. hESC-de vitronektiinil kasvatamine
Vuoristo jt. (2009) leidsid, et hESC-de kasvatamiseks MEF-konditsioneeritud söötmes
sobis vitronektiini hepariini siduv vorm. Braam jt. (2009) katsetasid hESC-de kasvupinnasena
nii plasma kui membraanset vitronektiini koos mTeSR1 söötmega ja leidsid, et rakud
ekspresseerivad mitmeid pluripotentsuse markereid (GCTM2, Oct3/4a, Sox2, SSEA-3,
SSEA-4) ning olid võimelised moodustama kõigi kolme lootelehe rakke.
3.2.1.3.4. hESC-de kollageenil kasvatamine
hESC-de kasvupinnasena on katsetatud ka kollageeni, aga enamasti edutult (Vuoristo
jt. 2008, Braam jt. 2008), välja arvatud siis, kui söötmesse lisati hepariini (Furue jt. 2008).
Sellises söötmes säilitasid hESC-d pluripotentsuse ka ilma bFGF-ta, kuigi bFGF (10 ng/ml)
lisamine tagas kiirema jagunemise. bFGF suuremad kontsentratsioonid ei omanud enam
efekti. Hepariini sobivaimad kontsentratsioonid jäid vahemikku 100-200 ng/ml, kusjuures
kontsentratsioonil 1000 ng/ml kadus selle hESC-de kasvu toetav efekt. Söötme valgulisteks
komponentideks lisaks bFGF-le olid transferriin, insuliin ja albumiin.
3.2.2. hESC-de toiterakkudeta ja valgulise maatriksita kasvatamine
Bigdeli jt. (2008) kasvatasid hESC-sid plastikul „Primaria“, mis oma molekulaarselt
koostiselt on modifitseeritud pinnaga polüstüreen. hESC-del ekspresseerusid mitmed
pluripotentsusmarkerid, nad põhjustasid immuundefitsiitsetes hiirtes kasvajaid ja olid
võimelised in vitro moodustama kõigi kolme lootelehe rakke. Need autorid kasutasid
söötmena inimese embrüonaalse kopsu fibroblastide konditsioneeritud seerumiasendajaga
KO-DMEM söödet, millele vahetult enne kasutamist lisati bFGF (4ng/ml).
Li jt. (2010) kasvatasid hESC-sid edukalt polüsahhariidses kitosaanist ja alginaadist
koosnevas poorses maatriksis, kasutades söötmena ES-DMEM-i (embryonic stem cell’s
DMEM), millele lisati bFGF-i (10ng/ml), 5% seerumiasendajat ja 15% FBS-i. Rakud
ekspresseerisid pluripotentsusmarkerite mRNA-d ja moodustasid in vivo kolme lootelehe
rakke, aga mitte in vitro. Kitosaani maatriksi lähtepulbrit valmistatakse kitiinist
deatsetüleerimise teel ja alginaadi lähtepulbrit saadakse vetikatest. Kitosaanile baseeruva geeli
pooridesse saab siduda kasvufaktoreid nagu bFGF ja EGF ning samuti väiksemaid peptiide,
mis lahuses ei ole püsivad või mille poolestusaeg elusorganismis on üldiselt lühike, kuid
maatriksile seotult piisavalt pikk, et näiteks vähkkasvaja kasvu pärssida (Kim jt. 2008, Guan
28

jt. 2007). Tulevikus võib kitosaanil põhinev biodegradeeruv ja kasvufaktoreid sisaldav
maatriks olla sobivaks maatriksiks, mille abil tüvirakke siirdada. Kitosaanil ja alginaadil
põhinevate maatriksite eelisteks on veel odavus, valmistamise lihtsus ja piisav usaldusväärsus,
et neid saaks kasutada hESC-de kasvatamiseks bioreaktorites. Edasised katsed peaksid olema
suunatud seerumi- ja ksenogeenivaba söötme leidmisele.
hESC-sid on edukalt kasvatatud ka suspensioonis, lisades kasvukeskkonda bFGF,
laminiini, fibronektiini ja želatiini (Steiner jt. 2010). Uuringus kasutatud laminiin on Sigma
toode, mida puhastatakse platsentast ja mis Wondimu jt. (2006) järgi sisaldab peamise
komponendina puhastamise käigus lühenenud aminoterminaalsete otstega Lm511. Need
andmed kinnitavad kaudselt hiire embrüos ja embüoidkehadel läbiviidud uuringute tulemusi,
mis näitavad, et embrüonaalsete rakkude jaoks on olulised laminiini LG-domäänid.
29

II Eksperimentaalne osa
4. Materjal ja metoodika
4.1. Laminiin 511 puhastamine rakuliini A549 sekreedist
4.1.1. Rakuliini A549 kasvukeskkonna töötlemine enne laminiini väljapuhastamist
Kopsukasvaja rakuliini A549 kasvatati IMDM söötmes, millele oli lisatud 10% FBS-i.
Rakke passeeriti 5-7 päeva järel. Rakud eraldati plastikult PBS-lahusega, milles oli 10mM
EDTA. Rakkudelt kogutud söödet tsentrifuugiti 10 min kiirusega 1912g (tsentrifuug 4K15C,
Sigma), lisati asiidi (NaN 3 ) lõppkontsentratsiooniga 0,04% ning säilitati 4°C juures. Lõplik
kogutud söötme hulk oli kolm liitrit. Sööde filtreeriti läbi filtri (poori suurus 0,2 µm) ja
seejärel puhastati sellest afiinsuskromatograafia abil Lm511.
4.1.2. Afiinsuskromatograafia kolonni valmistamine
Afiinsuskromatograafia kolonn valmistamiseks võeti 9 ml geeli (Toyopearl HW-75,
Jaapan). Enne antikeha peale kandmist tuli geel pesta ja aktiveerida. Geeli pesemine tähendab
siinkohal selle fuugimist pesulahusega 4°C juures kiirusega 1912g ja kestusega 15 min. Kahe
esimese pesulahusena kasutati destilleeritud vett ja 0,5 M Na 2 CO 3 lahust (pH=11,5). Pärast
teise pesulahuse eemaldamist lisati geelile 100 µl divinüülsulfooni (DVS) ja geeliga samas
mahus 0,5 M Na 2 CO 3 lahust (pH=11,5). Saadud segu loksutati ülepeakaela-loksutil 4°C
juures 2h. Seejärel pesti geeli 5 korda 0,5 M Na 2 CO 3 lahusega (pH=10,5). Aktiveeritud
geelile lisati 27 ml antikeha DG10 lahust (1mg/ml) 0,5 M karbonaatpuhvris (pH=10,5). DG10
on hiire antikeha, mis tunneb ära inimese laminiini β1 subühikut. Puhvri ja geeli segu
loksutati ülepeakaela-loksutil toatemperatuuril 10 min. Seejärel lisati PEG6000 (PEG -
polüetüleenglükool) lõppkontsentratsiooniga 6%. Segu loksutati ülepeakaela-loksutil üleöö.
Järgmisel päeval eemaldati PEG6000 ja pesti geeli 3 korda 0,1 M Tris-etanoolamiin puhvriga
(pH=8). Antikeha kolonnile kinnitumise kontrollimiseks mõõdeti supernatandi valgusisaldust,
kasutades NanoDrop programmi „Protein A280”, mis arvutab valgu kontsentratsiooni
lainepikkuse 280 nm juures. OD-lt kontsentratsioonile üleminekuks kasutati IgG-le vastavat
keskmist koefitsenti. Pärast pesulahuse eemaldamist lisati taaskord 0,1 M Trisetanoolamiinpuhvrit
(pH=8), et viia geeli ruumala 20ml-ni. Säilitamise otstarbel lisati geelile
asiidi lõppkontsentratsiooniga 0,04%. Erkki Juronen teostas Lm511 väljapuhastamise
söötmest afiinsuskromatograafia kolonnil. Seejuures kasutati lahuseid:
1) 20 mM Tris-HCl (pH=7,2) + 0,5 % TritonX-100 (kolonni tasakaalustamiseks)
2) 20 mM Tris-HCl (pH=7,2) + 0,2 % TritonX-100
30

3) 50 mM Tris-HCl (pH=7,2) + 0,1 % TritonX-100
4) 20 mM Tris-HCl (pH=7,2) + 0,1 % TritonX-100 + 0,5% Na-deoksükolaat + 0,5 M
NaCl + 5 mM EDTA
5) 50 mM Tris-HCl (pH=8,2)
6) 50 mM trietüülamiin (pH=12) + 150 mM NaCl (Lm511 vabastamiseks antikeha
küljest)
7) 0,2 M glütsiinilahus (pH=2,5) (pH normaliseerimiseks)
Saadud Lm511 fraktsioonid kontsentreeriti PEG-l ja dialüüsiti 150 mM NaCl lahuses
4°C juures. Lm511 puhtust kontrolliti hõbetamisega ja Western Blotil. Need tööd viis läbi
Sulev Ingerpuu ja seepärast pole siinkohal vastavaid protokolle ära toodud.
4.2. Laminiini 511 kontsentratsiooni määramine
Lm511 kontsentratsiooni määramiseks kasutati esialgu Bradfordi meetodit, kuid kuna
see andis madalamad laminiini kontsentratsioonid kui teised meetodid, siis kasutati edasises
töös Pierce ® BCA Protein Assay komplekti. Meetod põhineb biureedireaktsioonil
moodustunud Cu + katioonide tuvastamiel BCA-ga. Neist aineosakestest moodustunud
kompleks absorbeerib valgust tugevalt 562 nm lainepikkuse juures, kuid proovide
mõõtmiseks sobivad ka lainepikkused vahemikus 540-590 nm. Meie kasutasime 540 nm filtrit
(Thermo Scientific kolorimeeter). Standardkõver koostati BSA teadaoleva
kontsentratsiooniga lahuste mõõtmistulemuste alusel. Vahel määrati valgu kontsentratsioon
paralleelselt ka NanoDrop meetodil (programm Protein A280).
4.3. hESC-de Matrigelil ja Lm511-l kasvatamine
Rakuliini H9 kasvatati eksperimendi eel MEF-del KO-DMEM söötmes (20% KO-SR,
1 mM L-Gln, 1x AH segu, 0,1 mM 2-merkaptoetanool, 4 ng/ml bFGF) ja Matrigelil mTeSR1
söötmes 6-augulistel plastikust kasvuplaatidel. Passeerimine viidi läbi mehhaaniliselt.
Immunofluorestsentsi läbiviimiseks külvati rakud eelnevalt Matrigeli või Lm511-ga kaetud
klaasidele pindalaga 1,39 cm 2 . Klaasid olid paigutatud 24-auguliste kasvuplaatide kaevude
põhja. Klaaside katmiseks Lm511-ga valmistati Lm511 lahus PBS-s. Lahuse
steriliseerimiseks filtreeriti see läbi 200 nm läbimõõduga pooridega filtri. Seejärel kanti igale
kaevule 250 ml lahust. Juhindudes Domogatskaya jt. (2008) tööst, hoiti lahust klaasidel 4°C
juures üleöö. Esimestes katsetes tehti kindlaks rakkudele sobivaim Lm511 kontsentratsioon,
milleks osutus 4-5 µg/cm 2 . Hilisemad katsed viidi läbi selle Lm511 kontsentratsiooni juures.
31

Rakke pildistati kasvatamise käigus faaskontrastmikroskoobiga Nikon Diaphot ja Olympus
DP/70 kaameraga.
4.4. Immunofluorestsents (IF)
Inimese embrüonaalsete tüvirakkude liini H9 rakud fikseeriti 4% PFA-ga (15 min) ja
permeabiliseeriti PBS-s, milles oli 0,2% Triton X100 (10 min). Blokeerimiseks kasutati PBSi,
mis sisaldas 1% BSA-d, 0,05% Tween20-t ja 0,1% saponiini. Blokeerimine kestis sõltuvalt
katsest 0,5-1 tundi. Primaarse ja sekundaarse antikehaga ning DAPI-ga inkubeerimised viidi
läbi parafilmil 35 µl-tes tilkades suletud kambris. Antikeha lahjendused tehti
blokeerimislahuseses ja DAPI lahjendati suhtega 1:1000 PBS-s. Rakke inkubeeriti antikeha
lahustes 0,5-1h ja DAPI-ga (Sigma) 15 min. Rakupreparaadid sulustati sulustussegusse
(Dako, Taani). Kõik etapid viidi läbi toatemperatuuril ja kõigi etappide vahel pesti rakke kolm
korda PBS-ga. Preparaate analüüsiti konfokaalmikroskoobiga (Olympus IX81, programm
FV10-ASW 1.6., Jaapan).
Kasutatud antikehad: nimi, (firma), kasutatud lahjendus/konts
1) Primaarsed
a. Oct3/4 hiire monoklonaalne IgG2b (Santa Cruz) 1:50
b. Nanog küüliku polüklonaalne IgG (Santa Cruz) 1:50
c. Küüliku polüklonaalne IgG (Abcam) 1:50
d. Hiire IgG2b (Santa Cruz) 4:50
e. Hiire IgG (Santa Cruz) 1:100
f. Lm111 vastane seerum (Abcam) 1:1000
g. 3H2 – laminiini α4 subühiku vastane hiire IgG 8 µg/ml
h. 4B12 – laminiini α5 subühiku vastane hiire IgG 6 µg/ml
2) Sekundaarsed
a. Alexa Fluor 488 kana küülikuvastane IgG (Invitrogen) 1:200
b. Alexa Fluor 647 kitse hiirevastane IgG F(ab`)2 fragment (Invitrogen) 1:200
c. Alexa Fluor 647 kana hiirevastane IgG2b (Invitrogen) 1:200
32

5. Tulemused
5.1. Puhastatud Lm511 kontsentratsiooni määramine
Esimeses katses kasutati varasemal aastal puhastatud Lm511 lahust, milles olid kokku
segatud kolme erineva puhastamise saagised. Kaks preparaati olid puhastatud DG10-kolonni
ja üks 4B12-kolonni abil. Preparaatide segust määrati Lm511 kontsentratsioon Bradfordi
meetodil. Hilisemad laminiini kontsentratsiooni mõõtmised näitasid suhteliselt head
kokkulangevust BCA meetodi ja NanoDropi programmi Protein A280 vahel, samas kui
Bradfordiga määratud kontsentratsioonid ja nende aritmeetiline keskmine olid ligikaudu 3,3x
väiksemad kui BCA meetodil määratud kontsentratsioonide keskmine. Varem on näidatud, et
kõrvalekalle tuleneb kahest asjaolust (Walker 2002):
1) BSA tavapärasest suuremast tundlikkusest Coomassie Brilliant Blue suhtes võrreldes
teiste valkudega
2) Bradfordi meetodi süsteemsest veast, mis ei ole glükosüleeritud valkude suhtes
piisavalt tundlik.
2010. aasta märtsis puhastatud Lm511 kontsentratsioon määrati BCA meetodil (vt. Tabel
2). Varasemal aastal puhastatud Lm511 kontsentratsioonid arvutati ümber. Käesolevas töös
on edaspidi kasutatud ainult parandatud kontsentratsioone.
Tabel 2. Lm511 kontsentratsiooni määramine erinevate meetodite abil.
Lm511 kontsentratsiooni määramine erinevatel meetoditel. (mg/ml)
Bradfordi BCA NanoDrop
meetod meetod (OD280)
BCA/NanoDrop suhe
0,19 0,62 0,70 0,9
0,47 0,58 0,8
0,77 0,98 0,8
2010. aasta märtsis puhastati Lm511 kahe korral. Esimesel korral saadi ühest
liitrist söötmest ligikaudu 1,2 mg valku. Teisel korral saadi ühe liitri söötme kahekordsel
puhastamisel kokku ligikaudu 2 mg valku.
5.2. Lm511 klaasile kinnitumise kontrollimine
Lm511 klaasile kinnitumist hinnati BCA meetodi abil. Selleks mõõdeti valgu
kontsentratsioon enne klaasile kandmist ja pärast seda, kui valgulahust oli hoitud 4°C juures
üleöö. Kuna laminiin on väga adhesiivne valk, siis hinnati ka seda, kui suur on laminiini kadu
selle filtreerimisel läbi 0,2 µm pooridega filtri.
33

Tabelist 3 on näha, et osa laminiinist ilmselt kleepub filtreerimisel filtri külge.
Kleepumise tõttu kaduma mineva laminiini osakaal on teoreetiliselt seda väiksem, mida
suurem kogus laminiini sisaldavat lahust filtrist läbi lastakse. Tabelist nähtub, et Lm511
tõepoolest kinnitub klaasile, kuid seda vähesel määral. Lm511 kontsentratsioon plaadil,
millele siin töös edaspidi on viidatud, on analüütiline ja lähtub eeldusest, et kõik plaadile
kantud Lm511-l sellele ka kinnitub.
Tabel 3. Lm511 kontsentratsiooni võrdlus enne ja pärast filtreerimist ning klaasplaadil inkubeerimist.
Lm511 kontsentratsioon (µg/ml)
Filtreeritud
I
Plaadilt
I
Filtreerimata
II
Filtreeritud
II
Plaadilt
II
14 8 27 22 17
5.3. hESC-de Lm511-l ja Matrigelil kasvatamine
5.3.1. Kolooniate üldine morfoloogia ja pluripotentsusmarkerite ekspressioon
Rakke kasvatati Matrigelil ja Lm511-l (8, 12, 16, 20 ja 24 µg/cm 2 ), kusjuures eraldi
vaadeldi rakke, mis olid passeeritud MEF-delt ja Matrigelilt. Me eeldasime, et Matrigelilt
passeeritud rakud kinnituvad Lm511-le paremini, sest nad kasutavad Matrigeli
põhikomponendile Lm111-le kinnitumiseks integriini α6β1, mis on ühtlasi ka Lm511
retseptoriks. Meie oletust kinnitab see, et Matrigelilt passeeritud rakud moodustasid palju
väikseid kolooniaid, samas kui MEF-delt passeeritud rakud moodustasid vaid mõned üksikud
kolooniad. Kohe esimesel päeval pärast passeerimist võis mikroskoobis näha kolooniate
morfoloogia erinevusi (vt. joonis 8).
Joonisel 8A on näha, et Lm511-l kasvanud rakud moodustasid tihedaid ja kõrgeid
kolooniaid juba esimesel passeerimisejärgsel päeval. Joonisel 8B võib näha kolooniat, mille
äärtes on rakud ilmselt hakanud diferentseeruma. Joonisel 8C ja 8D olevad kolooniad
kasvavad mõlemad Matrigelil, kuid nad on passeeritud Matrigelilt või MEF-delt. On näha, et
MEF-delt passeeritud koloonias on rakkude vahel vähem rakuvälist maatriksit. Siiski, nii
MEF-delt kui Matrigelilt Lm511-le passeeritud rakud moodustasid tihedaid kolooniad ja ka
MEF-delt Matrigelile passeeritud rakkude kolooniad muutusid kasvatamise käigus
tihedamaks. Rakkudel lasti klaasidel kasvada kokku 7 päeva. Kõige ilusamaid kolooniaid
moodustasid ja kõige paremini kasvasid Matrigelilt Matrigelile passeeritud rakud. Siiski,
kõigil maatriksitel leidus ka koledaid ehk tihedaid ja ebakorrapärase kujuga kolooniaid ning
isegi augulisi kolooniaid. Viimaseid oli Lm511-l palju ja Matrigelil vaid mõni üksik. Lm511-
le külvatud rakud moodustasid omapäraseid kaarjaid paksude äärtega ja jätketega kolooniaid
(vt. joonis 9 ja joonis 10).
34

Joonis 8. hESC-d moodustavad juba esimesel päeval pärast passeerimist erineva morfoloogiaga kolooniaid. A –
Matrigelilt Lm511-le (20 µg/cm 2 ); B – Matrigelilt Lm511-le (8 µg/cm 2 ); C – Matrigelilt Matrigelile: D – MEFdelt
Matrigelile
Joonis 9. hESC-d moodustavad Lm511-l (12 µg/cm 2 ) kasvades kaarjaid (A) ja jätkelisi kolooniaid (B).
Suurendus 100x.
Joonis 10. hESC-d moodustavad Lm511-l (4 µg/cm 2 ) kasvades augulisi (A) ja kaarjaid (B) kolooniad.
35

Seitsmendal päeval pärast passeerimist rakud fikseeriti ja teostati
immuunofluorestsentsanalüüs, et uurida pluripotentsuse markerite ekspressiooni. Nii Oct3/4
kui Nanogi suhtes tugeva positiivse reaktsiooni andsid ainult need rakud, mis olid passeeritud
Matrigelilt Matrigelile ja Matrigelilt Lm511-le (8 µg/cm 2 ) (vt. joonis 12), kuigi nende
kolooniate seas oli ka korrapärase morfoloogiaga ehk õhukesi ümmarguste rakkudega
kolooniaid. Leidus ka selliseid kolooniaid, mis olid Oct3/4 suhtes negatiivsed, aga Nanog’i
suhtes positiivsed.
Esialgsed katse tulemused näitasid, et edaspidi tuleb rakke passeerida hõredamalt ja
neil ei tohi lasta kasvada maatriksil väga tihedaks. . Korduskatses, kus kasutati Lm511
kontsentratsioone 4, 8, 16 ja 24 µg/cm 2 , leiti taas, et sobivamad on madalad
kontsentratsioonid (4 ja 8 µg/cm 2 ) ning selgi puhul säilitavad pluripotentsuse vaid vähesed
kolooniad. Lm511-l kasvavate kolooniate seas oli taaskord palju augulisi ja kaarjaid
kolooniaid (vt. joonis 10). Samuti võis jällegi leida Nanogi suhtes positiivseid, aga Oct3/4
suhtes negatiivseid rakke.
Joonis 12. Matrigelilt passeeritud hESC-d, mis on seitse päeva kasvanud Lm511-l (8 µg/cm 2 ). Sinine – DAPI;
Roheline – Nanog; Valge – Oct3/4; Värvitu – DIC kujutis. Suurendus 600x.
36

5.3.2. Laminiini subühikute süntees
Selleks, et uurida, kas laminiini subühikute süntees sõltub pinnast millel tüvirakud
kasvavad, külvati rakud Matrigelile ja Lm511-le (4 µg/cm 2 ) ning analüüsiti laminiini
subühikute α1, α4 ja α5 ekspressiooni immuunofluorestsesntsmeetodil. Me eeldasime, et
Lm511-l kasvades on rakkude enda Lm511 ekspressioon vähenenud, sest sama valk on juba
kasvukeskkonnas olemas. Me püüdsime selgitada, kas Lm511 on suuteline tõstma Lm111
ekspressiooni. Mitmed embrüogeneesi uuringud on näidanud, et see nii ei ole. Meie
tulemused näitasid samuti, et Lm511-l kasvavad hESC-d ei ekspresseeri Lm111. Seda, et
Lm111 on keskkonnas olemas tõestab Matrigelis Lm111 vastase antikeha seostumine
maatriksile (vt. joonis 13). Lm511 on olemas nii Matrigeli pinnal kui ka Lm511-l arenevate
Nanog-positiivsete kolooniates rakkude vahel (vt. joonis 14 ja joonis 15). Matrigelil
kasvavates rakkudes oli Lm511 äratundvate antikehade reaktsioon sagedasem ja kohati
tugevam kui Lm511-l kasvavates rakkudes. Lõplike järelduste tegemiseks on siiski vaja teha
korduskatseid ning kasutada paralleelselt ka mõnd teist, täpsemat meetodit, nagu Lm511
mRNA või valgu hulga määramist rakulüsaadist. Immunofluorestsentsanalüüs ei tuvastanud
laminiini α4 subühiku olemasolu ei rakkude vahel ega rakkude sees. Väga nõrk positiivne
reaktsioon saadi üksikutes Matrigelil kasvavates rakkudes (vt. joonis 16). Western blot
analüüs näitas, et laminiini α4-subühiku hulk rakulüsaadis on väga madal.
Joonis 13. hESC-d ei ekspresseeri Lm111, kuid Lm111 on olemas Matrigelis. (Matrigelilt Matrigelile
passeeritud rakud, mis on kolm päeva kasvanud) Sinine – DAPI; Roheline – Lm111; Valge – Oct3/4 Suurendus
600x
37

Joonis 14. hESC-d ekspresseerivad Lm511 rakkude vahele. (Matrigelilt Matrigelile passeeritud rakud, mis on
kolm päeva kasvanud.) Sinine – DAPI; Roheline – Nanog; Valge – Lm α5. Suurendus 600x.
Joonis 15. Matrigelilt Lm511-le passeeritud rakud, mis on kolm päeva kasvanud. Sinine – DAPI; Roheline –
Nanog; Valge – Lm α5. Suurendus 600x.
Joonis 16. Matrigelilt Matrigelile passeeritud rakud, mis on kolm päeva kasvanud. Sinine – DAPI; Roheline –
Nanog; Valge – Lm α4. Suurendus 600x.
38

6. Arutelu
hESC-de jaoks on laminiin 511 oluline valk, mida nad sekreteerivad kasvukeskkonda
rakkude vahele ja mis tõenäoliselt hoiab kogu kolooniat terviklikuna. Lm511-l kasvavad
tüvirakud on võimelised jagunema ja säilitavad pluripotentsuse, kuid seda mitte nii hästi nagu
Matrigelil. Tulevikus oleks huvitav katsetada kasvupinnasena Lm511 ja Matrigeli segu, mis
peaks hästi jäljendama embrüonaalset basaalmembraani. Terapeutilisest seisukohast on
oluline, et rakud paljuneksid kiiresti, säilitades seejuures pluripotentsuse ja normaalse
karüotüübi. Selleks on Lm511-st palju lootustandvamaid maatrikseid, nagu näiteks alginaadil
ja kitosaanil põhinevad ja kasvufaktoreid sisaldavad maatriksid.
Jääb selgusetuks, kas pluripotentsuse säilitamiseks on tingimata vajalik Lm511
ekspressioon hESC-de rakkude vahel või on see asendatav mõne teise molekuliga.
Kirjanduses on esitatud rohkesti materjali erinevatest maatriksitest, mis kõik säilitavad hESCde
pluripotentsuse, kuid suhteliselt vähe on teada, milliseid maatriksi valke toiterakud ja
hESC-d ise sünteesivad. Käesolevas töös vaadeldi laminiinide α1-, α4-, ja α5-subühikute
sünteesi Matrigelil ja Lm511-l kasvavates tüviraku kolooniates. Meie tulemused näitavad, et
hESC-d sünteesivad ise sõltumata maatriksist põhiliselt laminiini α5-subühikut sisaldavat
laminiini. Matrigelil kasvavad rakud sünteesivad vähesel määral α4-subühikut. Erinevalt
Vuoristo jt. (2008) tulemustest, aga sarnaselt Braam jt. (2008) tööga, näitavad meie
tulemused, et hESC-d ei sünteesi ise Lm111. Edaspidi võiks uurida laminiini α1- ja α5-
subühikute sünteesi ka toiterakkudel kasvavates erinevate tüvirakuliinide kolooniates.
Ideaaalne mudel oleks LAMA5-/- tüvirakkude liin.
Edaspidi oleks vaja uurida, miks Lm511-l kasvavad tüviraku kolooniad muutuvad
kaarjaks ja miks vahel tekib nende keskele auk. Oleks vaja uurida ka, millisel määral hESC-d
sünteesivad laminiini α4-subühikut sisaldavaid laminiine. Miyazaki jt. (2008) ning Vuoristo
jt. (2008) on näidanud siiski, et α4 subühikut kodeeriva mRNA tase hESC-des on väga madal.
Samas on Miyazaki ja Vuoristo töödes ka lahknevusi, mis võivad tuleneda erisugustest hESCde
liinidest, mida neis töödes kasutati. Erinevalt Miyazaki jt. ei leidnud Vuoristo jt. hESC-de
kasvukeskkonnas laminiini β2-subühikut. On võimalik, et hESC-d hakkavad α4-subühikut
tootma ja sekreteerima siis, kui nad alustavad diferentseerumist. Seda mõtet toetab asjaolu, et
epiteliaalse-mesenhümaalse ülemineku (EMT, epithelial-mesenhymal transition, ingl. k.,)
korral toimub laminiini α5-subühiku ekspressiooni langus ja α4-subühiku sünteesi tõus
(Takkunen jt. 2008). EMT läbivad ka need rakud, mis migreeruvad läbi Henseni sõlme, et
panna alus mesodermile. Seega võiks uurida kuivõrd laminiini α4-subühik kolokaliseerub
varaste mesodermaalsete markeritega nagu aktiviin ja Brachyury.
39

Tulevikus tuleks uurida, kuidas toimub signaalide ülekanne hESC-de pinnal
paiknevatelt Lm511-le seostuvatelt retseptoritelt nagu α3β1 ja α6β1 integriinid tüvirakkude
tsütoplasmasse ning kuidas selle kaudu mõjutatakse tüvirakkude pluripotentsust, jagunemist
ja diferentseerumist.
40

Kokkuvõte
Inimese embrüonaalsed tüvirakud jagunevad ja säilitavad pluripotentsuse, kui neid
kasvatada erisugustel maatriksitel ning erineva koostisega söötmetes. Käesoleval hetkel
peetakse hESC-de kõige paremaks kasvupinnaks Matrigeli ja kasvukeskkonnaks mTeSR1/2
söödet. Selline maatriksi ja söötme kombinatsioon tagab hESC-de kasvatamisel suurima
rakkude saagise ja väga hea pluripotentsuse säilumise. Paljulubavateks maatriksiteks võivad
kujuneda alginaadil ja kitosaanil põhinevad maatrikssüsteemid, mida saab kasutada nii
teaduslikes uuringutes kui terapeutilistel eesmärkidel. Selliste maatriksite jaoks puudub seni
veel sobiv sööde.
Inimese embrüonaalseid tüvirakke on kasvatatud ka suspensioonis. Sellisel juhul tuleb
söötmesse lisada eksogeenset platsentast puhastatud laminiini, mis sisaldab põhiliselt
laminiini 511. Samas näitavad erisugustel tahketel maatriksitel läbiviidud uuringud, et hESCd
ei vaja tingimata kasvupinnasena Lm511, kuid vajavad ilmselt signaali, et seda ise rakkude
vahele sünteesida. Ilmselt, kui Lm511 paikneb maatriksis, siis edastatakse rakkudele
teistsugune siganaal võrreldes sellega kui laminiin paikneb vabalt kasvukeskkonnas ning see
mõjutab vastavalt ka embrüonaalsete tüvirakkude jagunemist ja pluripotentsust. hESC-de
suspensioonis kasvatamine on väga lähedane natiivsete tingimustega ning seega on sellises
süsteemis läbi viidud uuringute tulemused võrreldes maatriksil kasvatamisega sarnasemad
protsessidele, mis toimuvad in vivo.
Meie kasvatasime hESC-de rakuliini H9 inimese kopsukasvaja A549
kasvukeskkonnast väljapuhastatud Lm511-l. Juba esimesel päeval pärast passeerimist
omandavad mTeSR1 söötmes ja Lm511-l kasvavad kolooniad teistsuguse morfoloogia kui
Matrigelil kasvavad rakud ning samas väheneb ka kolooniate üldhulk ja pluripotentsete
rakkude osakaal. Sarnaselt Vuoristo jt. tulemustega, näitavad ka meie tulemused, et hESC-d
sünteesivad ise Lm511. Erinevalt Vuoristo jt. (2008) tulemustest, aga sarnaselt Braam jt.
(2008) tööga, näitavad meie tulemused, et hESC-d ei sünteesi ise Lm111. Meie tulemused
kinnitavad ka, et Matrigel sisaldab Lm111.
Eksperimentaalsed tulemused näitavad samuti, et lisaks laminiinilt lähtuvatele
signaalidele, on kindlasti olulised ka kasvufaktoritelt, eelkõige bFGF-lt tulevad signaalid. See,
milline on Lm511 roll - kas Lm511-le kinnitumine on vajalik eelkõige proliferatsiooniks või
pluripotentsuse säilitamiseks -, vajab veel täiendavat uurimist.
41

The Cultivation of Human Embryonic Stem Cells on Various Matrixes and the
Cultivation of the Cell Culture Line H9 on Laminin 511
Summary
Human embryonic stem cells (hESC-s) proliferate and maintain pluripotency on
various matrixes and in various media. The best system for growing hESC-s for scientific
research is growing hESC-s on Matrigel and in mTeSR1/2 medium. Compared to other
systems, this system provides the highest growth rate as well as the highest percentage of
pluripotent hESC-s. In scientific research as well as for therapeutic applications, matrixes
based on alginate and chitosan, are very promising. However, defined medium, that could be
used with these matrixes, has not yet been found.
Human embryonic stem cells have also been grown in suspension. This systems
requires the addition of exogenous laminin 511 to the cell cultrure medium. However, it is
evident from scientific research, that hESC-s do not need laminin 511 as a matrix but seem to
need a signal to make them produce it themselves. This states the difference of biological
activity between the laminin, that is freely in the medium, and the laminin that is adhered on
glass or plastic. The cultivation of hESC-s in suspension resembles very well the natural
development of an embryo in the fallopian tube and in the uterus.
In this research we cultivated hESC-s on Lm511 that was adhered on glass. Colonies
of hESC-s asquire bizarre morphology already on the first day after the passage and compared
to the colonies on Matrigel the overall number of colonies as well as the percentage of
pluripotent cells declines. Our results are in agreement with Vuoristo et al (2008) and show
that hESC-s produce Lm511. However, differently from Vuoristo et al (2008) but in
agreement with Braam et al (2008) our results show, that hESC-s do not produce Lm111.
Our results also prove the presence of Lm111 in Matrigel.
The scientific research also show that in addition to signals regulated by laminin,
hESC-s need signals from growth factors, out of which most important are signals induced by
bFGF. It is yet to be determined whether the signal from laminin 511 is required for the
proliferation or for the maintenance of pluripotency.
42

Tänusõnad
Ma soovin tänada oma juhendajat Sulev Ingerpuud aja ja energia eest, mis ta mulle ja
minu uurimisteema arendamisele pühendas. Samuti tahan tänada Erkki Juroneni, kes oma
muude tööde kõrvalt leidis aega laminiini puhastamiseks. Ma tänan Martti Maimetsa ja Külli
Zimmermanni, kelle hooleks on olnud minugi uurimistöös kasutatud tüvirakkude
passeerimine. Ma tänan südamest Martin Pooki minuga kaasa mõtlemise ja minu
juhendamise eest ning Elo Madissooni asjalike kommentaaride eest, mis aitasid kaasa töö
valmimisele. Tänan ka Maili Zimmermanni, kes mind vajadusel alati lahkelt abistas. Minu
tänu kuulub ka Tarmo Tiidole, kes usaldas mulle oma BCA-kiti, mille abil saadud tulemused
aitasid mind paljuski edasi.
43

Kasutatud kirjandus
Ackley B.D., Kang S.H., Crew J.R., Suh C., Jin Y., Kramer JM. (2003) The basement membrane components nidogen and
type XVIII collagen regulate organization of neuromuscular junctions in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 23(9), 3577-87.
Alexander C.M., Howard E.W., Bissell M.J., Werb Z. (1996) Rescue of mammary epithelial cell apoptosis and entactin
degradation by a tissue inhibitor of metalloproteinases-1 transgene. J Cell Biol. 1996 135(6 Pt 1), 1669-77.
Amit M., Margulets V., Segev H., Shariki K., Laevsky I., Coleman R., Itskovitz-Eldor J. (2003) Human feeder layers for
human embryonic stem cells. Biol Reprod. 68(6), 2150-6
Apel E.D., Roberds S.L., Campbell K.P., Merlie J.P. (1995) Rapsyn may function as a link between the acetylcholine
receptor and the agrin-binding dystrophin-associated glycoprotein complex. Neuron. 15(1), 115-26.
Aumailley M. Bruckner-Tuderman L., Carter W.G., Deutzmann R., Edgar D., Ekblom P., Engel J., Engvall E,. Hohenester E.
Jones J.C., Kleinman H.K., Marinkovich M.P., Martin G.R., Mayer U., Meneguzzi G., Miner J.H., Miyazaki K., Patarroyo
M., Paulsson M., Quaranta V., Sanes J.R., Sasaki T., Sekiguchi K., Sorokin L.M., Talts J.F. Tryggvason K., Uitto J., Virtanen
I., von der Mark K. Wewer U.M., Yamada Y., Yurchenco P.D. (2005) A simplified laminin nomenclature. Matrix Biol.
24(5), 326-32
Aumailley M., Pesch M., Tunggal L., Gaill F., Fässler R. (2000) Altered synthesis of laminin 1 and absence of basement
membrane component deposition in (beta)1 integrin-deficient embryoid bodies. J Cell Sci. 113 (Pt 2), 259-68.
Aumailley M, Smyth N. (1998) The role of laminins in basement membrane function. J Anat. 193 (Pt1), 1-21.
Aumailley M, Wiedemann H, Mann K, Timpl R. (1989) Binding of nidogen and the laminin-nidogen complex to basement
membrane collagen type IV. Eur J Biochem. 184(1), 241-8
Badcock G., Pigott C., Goepel J., Andrews P.W. (1999) The human embryonal carcinoma marker antigen TRA-1-60 is a
sialylated keratan sulfate proteoglycan. Cancer Res. 59(18), 4715-9.
Bair EL, Chen ML, McDaniel K, Sekiguchi K, Cress AE, Nagle RB, Bowden GT.(2005) Membrane type 1 matrix
metalloprotease cleaves laminin-10 and promotes prostate cancer cell migration. Neoplasia. 7(4), 380-9
Balasubramani M., Schreiber E.M., Candiello J., Balasubramani G.K., Kurtz J., Halfter W. (2010) Molecular interactions in
the retinal basement membrane system: A proteomic approach. Matrix Biol. Apr 18
Banyard J., Bao L., Zetter B.R. (2003) Type XXII collagen, a new transmembrane collagen identified in metastatic tumor
cells. J. Biol. Chem. 278(23), 20989-94
Barzyk M., Carracedo S., Gullberg D. (2009) Integrins. Cell. Tissue. Res. 339(1), 269-80.
Bigdeli N., Andersson M., Strehl R., Emanuelsson K., Kilmare E., Hyllner J., Lindahl A. (2008) Adaptation of human
embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J. Biotechnol. 133(1), 146-
53
Birk D.E., Bruckner P. (2005) Collagen: primer in structure, processing, and assembly, In: Collagen ( Brinckmann J.,
Notbohm H., Müller P.K. ), pp. 185-207.Springer
Braam S.R., Zeinstra L., Litjens S., Ward-van Oostwaard D., van den Brink S., van Laake L., Lebrin F., Kats P.,
Hochstenbach R., Passier R., Sonnenberg A., Mummery C.L. (2008) Recombinant vitronectin is a functionally defined
substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26(9), 2257-65
Cai L., Ye Z., Zhou B.Y., Mali P., Zhou C., Cheng L. (2007) Promoting human embryonic stem cell renewal or
differentiation by modulating Wnt signal and culture conditions. Cell Res. 17(1), 62-72
Camarasa M., Brison D., Kimber S.J., Handyside A.H. (2009) Naturally immortalised mouse embryonic fibroblast lines
support human embryonic stem cell growth. Cloning Stem Cells. 11(3), 453-62.
Chandrasekaran S., Dean J.W. 3rd, Giniger M.S., Tanzer M.L. (1991) Laminin carbohydrates are implicated in cell signaling.
J Cell Biochem. 46(2), 115-24.
Chen H.F., Chuang C.Y., Shieh Y.K., Chang H.W., Ho H.N., Kuo H.C. (2009) Novel autogenic feeders derived from human
embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions. Hum Reprod.
24(5), 1114-25
44

Chen M., Marinkovich M.P., Veis A., Cai X., Rao C.N., O'Toole E.A., Woodley D.T. (1997) Interactions of the aminoterminal
noncollagenous (NC1) domain of type VII collagen with extracellular matrix components. A potential role in
epidermal-dermal adherence in human skin. J Biol Chem. 272(23), 14516-22.
Cheng Y.S., Champliaud M.F., Burgeson R.E., Marinkovich M.P., Yurchenco P.D. (1997) Self-assembly of laminin
isoforms. J Biol Chem. 272(50), 31525-32.
Cheng L., Hammond H., Ye Z., Zhan X., Dravid G. (2003) Human adult marrow cells support prolonged expansion of
human embryonic stem cells in culture. Stem Cells. 21(2), 131-42.
Cooper AR, MacQueen HA. (1983) Subunits of laminin are differentially synthesized in mouse eggs and early embryos. Dev
Biol. 96(2), 467-71.
Cortes J.L., Sanchez L., Ligero G., Gutierrez-Aranda I., Catalina P., Elosua C., Leone P.E., Montes R., Bueno C., Ramos-
Mejía V., Maleno I., García-Pérez J.L., Menendez P. (2009) Mesenchymal stem cells facilitate the derivation of human
embryonic stem cells from cryopreserved poor-quality embryos. Hum. Reprod. 24(8), 677-89
Coucouvanis E., Martin G.R. (1995) Signals for death and survival: a two-step mechanism for cavitation in the vertebrate
embryo. Cell. 83(2), 279-87.
De Arcangelis A., Mark M., Kreidberg J., Sorokin L., Georges-Labouesse E. (1999) Synergistic activities of a3 and a6
integrins are required during apicalectodermal ridge formation and organogenesis in the mouse. Development 126, 3957-3968
Deepa S.S., Yamada S., Zako M., Goldberger O., Sugahara K. (2004) Chondroitin sulfate chains on syndecan-1 and
syndecan-4 from normal murine mammary gland epithelial cells are structurally and functionally distinct and cooperate with
heparan sulfate chains to bind growth factors. A novel function to control binding of midkine, pleiotrophin, and basic
fibroblast growth factor. J Biol Chem. 279(36), 37368-76
Dickinson C.D., Veerapandian B., Dai X.P., Hamlin R.C., Xuong N.H., Ruoslahti E., Ely K.R. (1994) Crystal structure of the
tenth type III cell adhesion module of human fibronectin. J Mol Biol. 236(4), 1079-92.
Domogatskaya A, Rodin S, Boutaud A, Tryggvason K. (2008) Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse
embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26(11), 2800-9
Downs K.M., Davies T. (1993) Staging of gastrulating mouse embryos by morphological landmarks in the dissecting
microscope. Development. 18(4), 1255-66.
Durbeej M, Henry MD, Ferletta M, Campbell KP, Ekblom P.(1998) Distribution of dystroglycan in normal adult mouse
tissues. J Histochem Cytochem. 46(4), 449-57.
Durbeej M. (2010) Cell Tissue Res 339. 259–268
Dvorák P., Hampl A., Jirmanová L., Pacholíková J., Kusakabe M. (1998) Embryoglycan ectodomains regulate biological
activity of FGF-2 to embryonic stem cells. J Cell Sci. 111 ( Pt 19), 2945-52
Dziadek M, Timpl R. (1985) Expression of nidogen and laminin in basement membranes during mouse embryogenesis and in
teratocarcinoma cells. Dev Biol. 111(2), 372-82.
Ellerström C., Strehl R., Moya K., Andersson K., Bergh C., Lundin K., Hyllner J., Semb H. (2006) Derivation of a xeno-free
human embryonic stem cell line. Stem Cells. 24(10), 2170-6
Engler A. J., Sen S., Lee Sweeney H., Discher D.E. (2006) Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126,
677-689
Ervasti J.M., Campbell K.P. (1993) A role for the dystrophin-glycoprotein complex as a transmembrane linker between
laminin and actin. J Cell Biol. 122(4), 809-23.
Evseenko D., Schenke-Layland K., Dravid G., Zhu Y., Hao Q.L., Scholes J., Wang X.C., Maclellan W.R., Crooks G.M.
(2009) Identification of the critical extracellular matrix proteins that promote human embryonic stem cell assembly. Stem
Cells Dev. 18(6), 919-28.
Ezashi T., Das P., Roberts R.M. (2005) Low O 2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc. Natl. Acad.
Sci. 102(13), 4783-8
Ferletta M. The Laminins and Their Receptors (2002) Universitatis Upsaliensis
Fu X., Toh W.S., Liu H., Lu K., Li M., Hande M..P, Cao T. (2009) Autologous Feeder Cells from Embryoid Body
Outgrowth Support the Long-Term Growth of Human Embryonic Stem Cells More Effectively than Those from Direct
Differentiation. Tissue Eng Part C Methods. Nov 13
45

Furue M.K., Na J., Jackson J.P., Okamoto T., Jones M., Baker D., Hata R., Moore H.D., Sato J.D., Andrews P.W. (2008)
Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A.
105(36), 13409-14
Fässler R, Meyer M. (1995) Consequences of lack of beta 1 integrin gene expression in mice. Genes Dev. 9(15),1896-908
Gechtman Z, Belleli A, Lechpammer S, Shaltiel S. (1997) The cluster of basic amino acids in vitronectin contributes to its
binding of plasminogen activator inhibitor-1: evidence from thrombin-, elastase- and plasmin-cleaved vitronectins and antipeptide
antibodies. Biochem J. 325 ( Pt 2), 339-49
Gelse K., Pöschl E., Aigner T. (2003) Collagens – structure, function, and biosynthesis. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55(12),
1531-46
George E.L., George-Labousse E.N., Patel-King R.S., Rayburn H., Hynes R.O. (1993) Defects in mesoderm, neural tube and
vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development 119, 1079-1091
Gersdorff N, Kohfeldt E, Sasaki T, Timpl R, Miosge N. Laminin gamma3 chain binds to nidogen and is located in murine
basement membranes. (2005) J. Biol. Chem. 280(23), 22146-53
Guan J., Stankus J.J., Wagner W.R. (2007) Biodegradable elastomeric scaffolds with basic fibroblast growth factor release. J
Control Release. 120(1-2), 70-8
Hakala H. Rajala K., Ojala M., Panula S., Areva S., Kellomäki M., Suuronen R., Skottman H. (2009) Comparison of
biomaterials and extracellular matrices as a culture platform for multiple, independently derived human embryonic stem cell
lines. Tissue Eng Part A. 15(7), 1775-85.
Ho M.S., Böse K., Mokkapati S., Nischt R., Smyth N. (2008) Nidogens – extracellular matrix linker molecules. Microc. Res.
Tech. 71(5), 387-95
Hoei-Hansen C.E. Almstrup K., Nielsen J.E., Brask Sonne S., Graem N., Skakkebaek N.E., Leffers H., Rajpert-De Meyts E.
(2005) Stem cell pluripotency factor NANOG is expressed in human fetal gonocytes, testicular carcinoma in situ and germ
cell tumours. Histopathology. 47(1), 48-56
Ibraghimov-Beskrovnaya O, Ervasti JM, Leveille CJ, Slaughter CA, Sernett SW, Campbell KP. (1992) Primary structure of
dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix. Nature. 355(6362), 696-702.
Ido H., Ito .S, Taniguchi Y., Hayashi M., Sato-Nishiuchi R., Sanzen N., Hayashi Y., Futaki S., Sekiguchi K. (2008) Laminin
isoforms containing the gamma3 chain are unable to bind to integrins due to the absence of the glutamic acid residue
conserved in the C-terminal regions of the gamma1 and gamma2 chains. J Biol Chem. 283(42), 28149-57
Ilic D. (2006) Culture of human embryonic stem cells and the extracellular matrix environemnt. Regenerative Med. 1(1), 95-
101
Iozzo RV. (1998) Matrix proteoglycans: from molecular design to cellular function. Annu Rev Biochem. 67, 609-52.
Ji L, Liu YX, Yang C, Yue W, Shi SS, Bai CX, Xi JF, Nan X, Pei XT. (2009) Self-renewal and pluripotency is maintained in
human embryonic stem cells by co-culture with human fetal liver stromal cells expressing hypoxia inducible factor 1alpha. J.
Cell. Physiol. 221(1), 54-66.
Jones J.C., Lane K., Hopkinson S.B., Lecuona E., Geiger R.C., Dean D.A., Correa-Meyer E., Gonzales M., Campbell K.,
Sznajder J.I., Budinger S. (2005) Laminin-6 assembles into multimolecular fibrillar complexes with perlecan and participates
in mechanical-signal transduction via a dystroglycan-dependent, integrin-independent mechanism. J Cell Sci. 118(Pt 12),
2557-66
Kikkawa Y., Moulson C.L., Virtanen I., Miner J.H. (2002) Identification of the binding site for the Lutheran blood group
glycoprotein on laminin alpha 5 through expression of chimeric laminin chains in vivo. J Biol Chem. 277(47):44864-9
Kim J.H., Kim Y.S., Park K., Kang E., Lee S., Nam H.Y., Kim K., Park J.H., Chi D.Y., Park R.W., Kim I.S., Choi K., Chan
Kwon I. (2008) Self-assembled glycol chitosan nanoparticles for the sustained and prolonged delivery of antiangiogenic
small peptide drugs in cancer therapy. Biomaterials. 29(12), 1920-30.
Kohfeldt E., Sasaki T., Göhring W., Timpl R. (1998) Nidogen-2: a new basement membrane protein with diverse binding
properties. J Mol Biol. 282(1), 99-109.
Kost C., Stüber W., Ehrlich H.J., Pannekoek H., Preissner K.T. (1992) Mapping of binding sites for heparin, plasminogen
activator inhibitor-1, and plasminogen to vitronectin's heparin-binding region reveals a novel vitronectin-dependent feedback
mechanism for the control of plasmin formation. J Biol Chem.267(17), 12098-105
46

Leivo I., Vaheri A., Timpl R., Wartiovaara J. (1980) Appearance and distribution of collagens and laminin in the early
mouse embryo. Dev Biol. 76(1), 100-14.
Li D., Clark C.C., Myers J.C. (2000) Basement membrane zone type XV collagen is a disulfide-bonded chondroitin sulfate
proteoglycan in human tissues and cultured cells. J Biol Chem. 275(29), 22339-47.
Li S., Edgar D., Fässler R., Wadsworth W., Yurchenco P.D. (2003) The role of laminin in embryonic cell polarization and
tissue organization. Dev Cell. 4(5), 613-24
Li S, Harrison D, Carbonetto S, Fassler R, Smyth N, Edgar D, Yurchenco PD. (2002) Matrix assembly, regulation, and
survival functions of laminin and its receptors in embryonic stem cell differentiation. J. Cell. Biol. 157(7), 1279-90
Li Z., Leung M., Hopper R., Ellenbogen R., Zhang M. (2010) Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D
porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31(3), 404-12
Li Y., Powell S., Brunette E., Lebkowski J., Mandalam R. (2005) Expansion of human embryonic stem cells in defined
serum-free medium devoid of animal-derived products. Biotechnol Bioeng. 91(6), 688-98
Ludwig T.E., Levenstein M.E., Jones J.M., Berggren W.T., Mitchen E.R., Frane J.L., Crandall L.J., Daigh C.A., Conard
K.R., Piekarczyk M.S., Llanas R.A., Thomson J.A. (2006a) Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.
Nat Biotechnol. 24(2), 185-7
Ludwig T.E., Bergendahl V., Levenstein M.E., Yu J., Probasco M.D., Thomson J.A. (2006b) Feeder-independent culture of
human embryonic stem cells. Nat. Methods.3(8), 637-46.
Madissoon E. (2008) Embrüonaalsete tüvirakkude pluripotentsuse säilitamise mehhanismid. (Bakalaureusetöö). Universitas
Tartuensis
Martin M.J., Muotri A., Gage F., Varki A. (2005) Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic
acid. Nat Med. 11(2), 228-32
Mayer U., Mann K., Timpl R., Murphy G.(1993) Sites of nidogen cleavage by proteases involved in tissue homeostasis and
remodelling. Eur J Biochem. 217(3), 877-84.
Miner J.H., Cunningham J., Sanes J.R. (1998) Roles for laminin in embryogenesis: exencephaly, syndactyly, and
placentopathy in mice lacking the laminin alpha5 chain. J Cell Biol. 143(6), 1713-23
Miner J.H., Li C., Mudd J.L., Go G., Sutherland A.E. (2004) Compositional and structural requirements for laminin and
basement membranes during mouse embryo implantation and gastrulation. Development. 131(10), 2247-56
Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. (2003)
The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113(5), 631-42.
Miyazaki T., Futaki S., Hasegawa K., Kawasaki M., Sanzen N., Hayashi M., Kawase E., Sekiguchi K., Nakatsuji N., Suemori
H. (2008) Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells.
Biochem Biophys Res Commun. 375(1), 27-32
Mostafavi-Pour Z., Askari J.A., Whittard J.D., Humphries M.J. (2001) Identification of a novel heparin-binding site in the
alternatively spliced IIICS region of fibronectin: roles of integrins and proteoglycans in cell adhesion to fibronectin splice
variants. Matrix Biol. 20(1), 63-73.
Murray P., Edgar D. (2000) Regulation of programmed cell death by basement membranes in embryonic development. J.
Cell. Biol. 150(5), 1215-21
Murshed M., Smyth N., Miosge N., Karolat J., Krieg T., Paulsson M., Nischt R. (2000) The absence of nidogen 1 does not
affect murine basement membrane formation. Mol. Cell. Biol. 20, 7007-7012
Nykvist P., Tasanen K., Viitasalo T., Kapyla J., Jokinen J., Bruckner-Tuderman L., Heino J. (2001) The cell adhesion domain
of type XVII collagen promotes integrin-mediated cell spreading by a novel mechanism. J Biol Chem 276(42), 38673-9
Pall E.A., Bolton K.M., Ervasti J.M.. (1996) Differential heparin inhibition of skeletal muscle alpha-dystroglycan binding to
laminins. J Biol Chem. 271(7), 3817-21
Pankov R., Yamada K.M. (2002) Fibronectin at a glance. J. Cell. Sci. 115 (Pt 20), 3861-3
Park J.H., Kim S.J., Oh E.J., Moon S.Y., Roh S.I., Kim C.G., Yoon H.S. (2003) Establishment and maintenance of human
embryonic stem cells on STO, a permanently growing cell line. Biol Reprod. 69(6), 2007-14
47

Park Y., Choi I.Y., Lee S.J., Lee S.R., Sung H.J., Kim J.H., Yoo Y.D., Geum D.H., Kim S.H., Kim B.S. (2010)
Undifferentiated Propagation of the Human Embryonic Stem Cell Lines, H1 and HSF6 on Human Placenta-Derived Feeder
Cells without Basic Fibroblast Growth Factor Supplementation. Stem Cells Dev. Mar 4
Plow E.F., Haas T.A., Zhang L., Loftus J., Smith J.W. (2000) Ligand binding to integrins. J Biol Chem. 275(29), 21785-8.
Pöschl E, Schlötzer-Schrehardt U, Brachvogel B, Saito K, Ninomiya Y, Mayer U. (2004) Collagen IV is essential for
basement membrane stability but dispensable for initiation of its assembly during early development. Development. 131(7),
1619-28
Rajala K., Hakala H., Panula S., Aivio S., Pihlajamäki H., Suuronen R., Hovatta O., Skottman H. (2007) Testing of nine
different xeno-free culture media for human embryonic stem cell cultures. Hum Reprod.22(5), 1231-8
Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.Y., Trounson A., Bongso A. (2000) Embryonic stem cell lines from human blastocysts:
somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18(4), 399-404.
Ricard-Blum S., Ruggiero F. (2005), The collagen superfamily: from the extracellular matrix to the cell membrane. Pathol.
Biol. (Paris) 53(7), 430-42
Richards M., Fong C.Y., Chan W.K., Wong P.C., Bongso A. (2002) Human feeders support prolonged undifferentiated
growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 20(9), 933-6
Richards M., Tan S., Fong C.Y., Biswas A., Chan W.K., Bongso A. (2003) Comparative evaluation of various human feeders
for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21(5),546-56.
Ries A., Göhring W., Fox J.W., Timpl R., Sasaki T. (2001) Recombinant domains of mouse nidogen-1 and their binding to
basement membrane proteins and monoclonal antibodies. Eur J Biochem. 268(19), 5119-28.
Salamat M., Miosge N., Herken R. (1995) Development of Reichert's membrane in the early mouse embryo. Anat Embryol
(Berl). 192(3), 275-81.
Sasaki T., Timpl R. (2001) Domain IVa of laminin alpha5 chain is cell-adhesive and binds beta1 and alphaVbeta3 integrins
through Arg-Gly-Asp. FEBS Lett. 2001 509(2), 181-5.
Schéele S., Falk M., Franzén A., Ellin F., Ferletta M. Lonai P., Andersson B., Timpl R., Forsberg E., Ekblom P. (2005)
Laminin alpha1 globular domains 4-5 induce fetal development but are not vital for embryonic basement membrane
assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 102(5), 1502-6
Schenk S., Hintermann E., Bilban M., Koshikawa N., Hojilla C., Khokha R., Quaranta V. (2003) Binding to EGF receptor of
a laminin-5 EGF-like fragment liberated during MMP-dependent
mammary gland involution. J Cell Biol.161(1), 197-209.
Schittny J..C, Yurchenco P.D. (1990) Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its selfassembly.
J Cell Biol. 110(3), 825-32.
Schvartz I., Seger D., Shaltiel S. (1998) Vitronectin. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31(5), 539-44
Smyth N., Vatansever H.S., Murray P., Meyer M., Frie C., Paulsson M., Edgar D. (1999) Absence of basement membranes
after targeting the LAMC1 gene results in embryonic lethality due to failure of endoderm differentiation. J. Cel.l Biol.
144(1), 151-60
Steiner D, Khaner H, Cohen M, Even-Ram S, Gil Y, Itsykson P, Turetsky T, Idelson M, Aizenman E, Ram R, Berman-Zaken
Y, Reubinoff B. (2010) Derivation, propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension.
Nat Biotechnol. 28(4), 361-4
Stephens L., Sutherland A.E., Klimanskaya I.V., Andrieux A., Meneses J., Pedersen R.A., Damsky C. (1995) Deletion of B1
integrins in mice resultsin inner cell mass failure and peri-implantation lethality. Genes & Dev. 9, 1883-1895
Stojkovic P, Lako M, Stewart R, Przyborski S, Armstrong L, Evans J, Murdoch A, Strachan T, Stojkovic M. (2005) An
autogeneic feeder cell system that efficiently supports growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem Cells.
23(3), 306-14
Zhang Y., Lukacova V., Reindl K., Balaz S. (2005) Quantitative characterization of binding of small molecules to
extracellular matrix. J. Biochem. Biophys. Methods. 67, 107-122
Zheng X., Saunders T.L., Camper S.A., Samuelson L.C., Ginsburg D. (1995) Vitronectin is not essential for normal
mammalian development and fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 12426-12430
48

Takkunen M., Ainola M., Vainionpää N., Grenman R., Patarroyo M., García de Herreros A., Konttinen Y.T., Virtanen I.
(2008) Epithelial-mesenchymal transition downregulates laminin alpha5 chain and upregulates laminin alpha4 chain in oral
squamous carcinoma cells. Histochem Cell Biol.130(3), 509-25
Talts J.F, Andac Z., Göhring W., Brancaccio A., Timpl R. (1999) Binding of the G domains of laminin alpha1 and alpha2
chains and perlecan to heparin, sulfatides, alpha-dystroglycan and several extracellular matrix proteins. EMBO J. 18(4), 863-
70
Taniguchi Y., Ido H., Sanzen N., Hayashi M., Sato-Nishiuchi R., Futaki S., Sekiguchi K. (2009) The C-terminal region of
laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284(12), 7820-31
Taniguchi Y., Ido H., Sanzen N., Hayashi M., Sato-Nishiuchi R., Futaki S., Sekiguchi K. (2009) The C-terminal region of
laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284(12), 7820-31
Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. (1998) Embryonic
stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282(5391), 1145-7.
Thorsteinsdóttir S., Roelen B.A., Freund E., Gaspar A.C., Sonnenberg A., Mummery C.L. (1995) Expression patterns of
laminin receptor splice variants alpha 6A beta 1 and alpha 6B beta 1 suggest different roles in mouse development. Dev Dyn.
204(3), 240-58.
Timpl R., Brown J.C. (1996) Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18(2), 123-32
Tsang K.Y., Cheung M.C.H., Chan D., Cheah S.E. (2010) The developmental roles of the extracellular matrix:beyond
structure to regulation. Cell. Tissue. Res. 339, 93-101
Tzu J., Marinkovich M.P. (2008) Bridging structure with function: structural, regulatory, and developmental role of laminins.
Int J Biochem Cell Biol. 40(2), 199-214
Tu H., Sasaki T., Snellman A., Göhring W., Pirilä P., Timpl R., Pihlajaniemi T. (2002) The type XIII collagen ectodomain is
a 150-nm rod and capable of binding to fibronectin, nidogen-2, perlecan, and heparin. J Biol Chem. 277(25), 23092-9
Vuori K, Ruoslahti E. (1994) Association of insulin receptor substrate-1 with integrins. Science. 266(5190), 1576-8.
Unger C., Gao S., Cohen M., Jaconi M., Bergstrom R., Holm F., Galan A., Sanchez E., Irion O., Dubuisson J.B., Giry-
Laterriere M., Salmon P., Simon C., Hovatta O., Feki A. (2009) Immortalized human skin fibroblast feeder cells support
growth and maintenance of both human embryonic and induced pluripotent stem cells. Hum Reprod. 24(10), 2567-81
Vuoristo S, Virtanen I, Takkunen M, Palgi J, Kikkawa Y, Rousselle P, Sekiguchi K, Tuuri T, Otonkoski T. (2009) Laminin
isoforms in human embryonic stem cells: synthesis, receptor usage and growth support. J Cell Mol Med. 13(8B), 2622-33
Walker J.M. (2002) The Protein Protocols. Handbook.Humana Press, New Yersey pp 3-23
Wang L., Li L., Menendez P., Cerdan C., Bhatia M. (2005) Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse
embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood 105 (12), 4598-4603
Williamson R.A., Henry M.D., Daniels K.J., Hrstka R..F, Lee J.C., Sunada Y., Ibraghimov-Beskrovnaya O., Campbell K.P.
(1997) Dystroglycan is essential for early embryonic development: disruption of Reichert's membrane in Dag1-null mice.
Hum Mol Genet. 6(6), 831-41.
Wondimu Z., Gorfu G., Kawataki T., Smirnov S., Yurchenco P., Tryggvason K., Patarroyo M. (2006) Characterization of
commercial laminin preparations from human placenta in comparison to recombinant laminins 2 (alpha2beta1gamma1), 8
(alpha4beta1gamma1), 10 (alpha5beta1gamma1). Matrix Biol. 25(2), 89-93
Xu C., Inokuma M.S., Denham J., Golds K., Kundu P., Gold J.D., Carpenter M.K. (2001) Feeder-free growth of
undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19(10), 971-4.
Xu C., Jiang .J, Sottile V., McWhir J., Lebkowski J., Carpenter M.K. (2004) Immortalized fibroblast-like cells derived from
human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22(6), 972-80.
Yang JT, Rayburn H, Hynes RO. (1993) Embryonic mesodermal defects in alpha 5 integrin-deficient mice. Development.
119(4),1093-105.
Yu H, Talts JF. (2003) Beta1 integrin and alpha-dystroglycan binding sites are localized to different laminin-G-domain-like
(LG) modules within the laminin alpha5 chain G domain. Biochem J. 371(Pt 2), 289-99.
Yurchenco PD, Quan Y, Colognato H, Mathus T, Harrison D, Yamada Y, O'Rear JJ. (1997) The alpha chain of laminin-1 is
independently secreted and drives secretion of its beta- and gamma-chain partners. Proc Natl Acad Sci U S A. 94(19), 10189-
94
49

Kasutatud veebiaadressid
Kollageeni triheeliks, http://en.wikipedia.org/wiki/File:Collagentriplehelix.png, viimati alla laetud 30.04.2010
50