GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüs ...

TARTU ÜLIKOOLLOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKONDMOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUTBIOTEHNOLOOGIA ÕPPETOOLLiina PappaGDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüskaasasündinud neeruanomaaliaga indiviididelBakalaureusetööJuhendajad Lili Milani, PhDProf. Andres Metspalu, MD, PhDTartu 2012

SisukordSisukord ...................................................................................................................................... 2Kasutatud lühendid ..................................................................................................................... 3Sissejuhatus ................................................................................................................................ 41. Kirjanduse ülevaade .......................................................................................................... 51.1 Neerude ja kuseteede areng .......................................................................................... 51.2 Kaasasündinud neeru ja kuseteede anomaaliad ............................................................ 71.3 GDNF geen ja valk ....................................................................................................... 81.3.1 GDNF/RET signaalrada ...................................................................................... 91.4 DNA varieeruvus ........................................................................................................ 101.4.1 Kodeeriva ala mutatsioonid .............................................................................. 101.4.2 Regulatoorse ala mutatsioonid .......................................................................... 111.4.3 Mutatsioonide mõju fenotüübile ....................................................................... 111.5 DNA sekveneerimine ................................................................................................. 121.5.1 Sangeri meetod .................................................................................................. 121.5.2 Teise põlvkonna sekveneerimine ...................................................................... 131.5.2.1 Illumina/Solexa ........................................................................................ 141.5.2.2 454 pürosekveneerimine .......................................................................... 151.5.2.3 ABi SOLiD .............................................................................................. 151.5.2.4 Teise generatsiooni sekveneerimistehnoloogiate eelised ........................ 161.6 SNP-de genotüpiseerimine ......................................................................................... 171.6.1 Taqmani meetod SNP-de genotüpiseerimiseks ................................................. 171.6.2 PCR-i ja geelipõhised meetodid ........................................................................ 181.6.2.1 Alleelspetsiifiline PCR ............................................................................ 181.6.2.2 PCR-RFLP ............................................................................................... 191.6.3 PCR-i vabad genotüpiseerimismeetodid ........................................................... 201.6.4 SNP-de analüüs Illumina Infinium® tehnoloogiaga ......................................... 201.7 Genotüüp-fenotüüp seos põhjuslike mutatsioonidega ................................................ 202 Eksperimentaalosa........................................................................................................... 222.1 Töö eesmärgid ............................................................................................................ 222.2 Materjal ja metoodika ................................................................................................. 222.2.1 Valim ................................................................................................................. 222.2.2 GDNF-i sekveneerimine Sangeri meetodil ....................................................... 222.2.3 Andmete analüüs ............................................................................................... 242.2.4 GDNF-i sekveneerimine teise põlvkonna sekvenaatoriga ................................ 252.3 Tulemused ja arutelu .................................................................................................. 262.3.1 Tulemused ......................................................................................................... 262.3.2 Arutelu .............................................................................................................. 28Kokkuvõte ................................................................................................................................ 31Sequencing and analysis of mutations in the GDNF gene in individuals with congenitalkidney anomalies ...................................................................................................................... 32Summary ................................................................................................................................... 32Tänusõnad ................................................................................................................................. 33Kasutatud kirjandus .................................................................................................................. 34Kasutatud veebiaadressid ......................................................................................................... 38Lisad ......................................................................................................................................... 392

Kasutatud lühendidATPbpCAKUTGDNFGDNFOShGDNFmRNANGSPCRPCR-RFLPRT-PCRSNPTGF-βUUTRVURadenosiintrifosfaat (adenosine triphosphate)aluspaar (base pair)kaasasündinud neeru ja kuseteede anomaaliad (congenital anomalies of thekidney and urinary tract)gliiapärane neurotroofiline faktor (glial cell-line derived neurotrophicfactor)gliiapärase neurotroofilise faktori vastasahel (glial cell line-derivedneurotrophic factor opposite strand)inimese GDNF (human GDNF)informatsiooni-RNA (messenger RNA)järgmise põlvkonna sekveneerimine (next-generation sequencing)polümeraasahelreaktsioon (polymerase chain reaction)PCR-restriktsiooni fragmendi pikkuse polümorfism (PCR-restrictionfragment length polymorphism)reaalaja PCR (real time-PCR)ühenukleotiidne polümorfism (single nucleotide polymorphism)transformeeriv kasvufaktor β (Transforming Growth Factor-Beta)ühik (unit)mittetransleeriv ala (untranslated region)refluksefropaatia (vesicoureteric reflux)3

SissejuhatusKaasasündinud neeru ja kuseteede anomaaliad ehk CAKUT on kõige sagedasemakskrooniliste neeruhaiguste ja surma põhjuseks laste ja noorukite seas (Song ja Yosypiv, 2010).CAKUT hõlmab neerude tasemel esinevate laia struktuursete ja funktsionaalsete väärarengutevahemikku (Song ja Yosypiv, 2010). Viimaste aastate jooksul läbi viidud uuringud ontõestanud, et vastsündinutel mitmel anatoomilisel kujul esinev CAKUT on polügeennehaigus, mida põhjustavad mitme geeni muutused korraga (Hildebrandt, 2010).GDNF geen on üheks nefrogeneesi põhielemendiks, mis tagab neerude ja kuseteede korrektsearengu. Mutatsioonid selles geenis või geeni üldine puudumine võivad viia erinevate neeru jakuseteede anomaaliate tekkeni. Kuna GDNF geeni ekspressioon ja neerude ning kuseteedeareng on otseselt seotud (Michos jt., 2010), võib oletada, et ka CAKUT võib olla põhjustatudseni veel leidmata mutatsioonist antud geenis. Kuigi CAKUT-i tekkepõhjuste kohta on tehtuderinevaid uuringuid, pole seni selle otsest seost GDNF geenis olevate mutatsioonidega veelleitud (Jeanpierre jt., 2011).Käesoleva töö eesmärgiks oli leida mutatsioonid GDNF geenis, mis võiksid potentsiaalseltpõhjustada CAKUT-i teket. Selle jaoks uuriti Eesti geenivaramuga liitunud erinevate neeru jakuseteede anomaaliatega inimeste DNA proove, sekveneerides Sangeri meetodiga GDNFgeeni kodeerivat ja 3’ mittekodeerivat ala. Eksperimendi lõpus analüüsiti DNA proovereferents-GDNF geeni vastu.4

1. Kirjanduse ülevaade1.1 Neerude ja kuseteede arengInimese neeru areng algab neerujuha moodustumisega keskmisest mesodermist 22.embrüonaalsel päeval (joonis 1). Neerujuha pikeneb kaudaalselt (sabapoolselt) ja indutseeribkülgneva mesodermi moodustumist kaheks ajutiseks staadiumiks: pro- ja mesonefroseks(Airaksinen ja Saarma, 2002). Pronefros sisaldab ühte kolmest filtreerivast üksusest, misfiltreerivad vedelikku keha kindlasse piirkonda. Mesonefros on teine ajutine neerustruktuur,millel on võrreldes metanefrosega vähem nefroneid, puudub Henle ling ja tihetähn (maculadensa), kuid mis on filtreeriv neer, tootes lahjendatud uriini.Joonis 1 Neeru kogumissüsteemi areng. Joonisel on näidatud ka metanefrilise mesenhüümi (MM),kusejuha punga (UB) ja kusejuha (ND) paiknemine (Costantini, 2010)Lõplike neerude normaalne areng saab toimuda ainult siis, kui arengule eelnevad eespoolmainitud ajutised staadiumid. Kõige otsustavam sündmus neerude arengus on esimenesignaaliprotsess, mis indutseerib kusejuha väljakasvu mesonefrose juhast. Vastavaindutsiooniprotsessi keskseks sündmuseks on gliiapärase neurotroofilise faktori (GDNF)signaalmolekuli ekspressioon ja mesenhüümist vabastamine. GDNF seondub mesonefrosejuhas türosiinkinaasi retseptori RET ja GDNF-perekonna retseptori α1-ga (GFRα1).GDNF-Ret/GFRα1 signaalraja keskset rolli toetab ka fakt, et enamik geene, mis on vajalikudkusejuha pungumisele, on GDNF või RET ekspressiooni regulaatoriteks. Pärast retseptoritegaseondumist käivitab GDNF signaaliraja, mis viib lõpuks epiteelrakkude kiire leviku ja epiteelihargnemiseni (joonis 2). Metanefrose ehk püsiva neeru areng saab inimesel alguse 30.raseduse päeval, kui metanefriline mesenhüüm hakkab indutseerima kusejuha punga5

(UB, ingl.k ureteric bud) väljakasvu Wolffi juhast. Kusejuha pung tungib metanefrilissemesenhüümi, mis muutub seejärel metanefroseks (Hahn, 2010). Mesenhüümi metanefrose jakusejuha punga vahel esinevad vastastikused interaktsioonid, millega metanefros indutseeribkusejuha punga kasvu ja kaheks hargnemist. Hargnemise tulemusel tekivad „kusejuha puud“,mis moodustavad kogumissüsteemi (joonis 1). Kusejuha kasv ja edasine areng on reguleeritudmesenhüümi koe interaktsioonide ja teiste kudede poolt sekreteeritud kasvufaktorite poolt(Saxen ja Sariola, 1986). Kusejuha pung paneb aluse kogumissüsteemi, vaagna ja kusejuhaepiteelile. Ebaõnnestumine kusejuha punga valmimisel viib eranditult neerude ageneesini(Constatini, 2010).Joonis 2 Skeem neeru arengul osalevatest faktoritest (Costantini, 2010)Paljud signaalid mesenhüümi metanefrosest kontrollivad kusejuha väljakasvu ja hargnemist.GDNF on ilmselt kõige olulisem kusejuha indutseerija, kuna selle faktori puudumisel ei toimukusejuha moodustumist (Costantini, 2010). GDNF-RET signaalrada on ülioluline kusejuhahargnemisel, kuna mutatsioonid, mis mõjutavad nende transkriptsiooniregulaatoriteekspressiooni, põhjustavad ka vähendatud hargnemist kusejuhas. On leitud ka, etheterosügootsed mutatsioonid PAX2 geenis, mis aktiveerib nii GDNF kui ka RETekspressiooni, põhjustavad neeru-koloboomi sündroomi, mille tulemuseks on väikesedhüpoplastilised neerud (Song ja Yosypiv, 2010). GDNF ekspresseeritakse Wolffi juha lähedalasuvas kondenseeruvas mesenhüümis (Sainio jt., 1997). Nii Wolffi juha kui ka kusejuha pungekspresseerivad GDNF retseptorit, türosiinkinaasset cRet retseptorit. GDNF/cRet ja BMP46

vastastikune signaliseerimine võimaldab kusejuha punga ilmumist Wolffi juhast. Kusejuhahargnemisel piirab cRet punga tippe ja GDNF tippe piiravat mesenhüümi. Antud protsesskindlustab jätkuva induktsiooni ja hargnemise vaid kusejuha pungade tippudes (Hahn, 2010).GDNF ja Ret on mõlemad olulised faktorid neeruepiteeli arengus. Katsed on näidanud, etGDNF-i seondumine kusejuha pungade tippudele on vajalik edasiseks initsiatsiooniks,suurendades rakkude vohamise asemel nende adhesiooni (Saxen ja Sariola, 1986).1.2 Kaasasündinud neeru ja kuseteede anomaaliadKaasasündinud neeru ja kuseteede anomaaliad ehk CAKUT (ingl.k congenital anomalies ofthe kidney and urinary tract) on kliiniline kirjeldus keerulistest arengulistest neeru ja kusejuhahälvetest (Moritz jt., 2008). CAKUT on peamiseks ja kõige sagedasemaks kroonilisteneeruhaiguste põhjuseks laste seas (Hildebrandt, 2010). Kaasasündinud neeru ja kuseteedeanomaaliad ilmnevad ühel sünnil 500-st ning moodustavad lõppkokkuvõttes umbes 20-30%sünnieelsetest anomaaliatest, olles samal ajal ka peamiseks neerupuudulikkuse ja surmapõhjuseks väikelaste ja laste seas (Saisawat jt., 2011). CAKUT selgitab enamikkukroonilistest pöördumatutest neeruhaigustest ja põhjustab samaaegselt hüpertooniat ningsüdame- ja veresoonkonna haigusi elu jooksul (Song ja Yosypiv, 2010).CAKUT hõlmab laia spektriga neeruteede väärarenguid, mis ilmnevad neerude [nt rohkemkui kahearvuline neer, hüpoplaasia (alaareng), düsplaasia (ebanormaalne areng), neerudeagenees, multitsüstiline ja aplastiline düsplaasia)], kogumissüsteemide (nt kusejuhalaienemine, hüdronefroos), põie [näiteks refluks-nefropaatia ehk uriini tagasivool kusepõiestkusejuhasse (VUR, ingl.k vesicoureteric reflux)] või kuseteede tasemel (Song ja Yosypiv,2010). Kõigil nendel väärarengutel on sarnane tekkemuster, mis on seotud ebatäieliku javarieeruva geeni alleeli ekspressiooniga, viies erinevate anatoomiliste tulemusteni. Seepärastarvatakse nendel erinevatel struktuursetel anomaaliatel olevat ühine patogeneetilinemehhanism ja geneetiline taust (Song ja Yosypiv, 2010).Neerude funktsionaalsed kahjustused võivad areneda sünnijärgselt bakteriaalsestneerupõletikust ja/või püsivast kusevoolu halvenemisest, põhjustades neerude kärbumist jasidekoe vohamist. Sellegipoolest on põhiliseks CAKUT-i tekkepõhjuseks häired normaalsesneerude arengus, mille tulemusena tekivad erinevad neerude väärarengud. Paljud geenid, misvastutavad nefrogeneesi eest, kodeerivad transkriptsioonifaktoreid, mis seletaks nendegeenide muutlikku avaldumist ja seega mutatsioonide puhul tõsise haiguse põhjustamist(Hildebrandt, 2010). Viimase paari aasta jooksul on kirjeldatud ka hilisemas eas tekkivateneeru arenguanomaaliate seost defektidega kindlas organi arengustaadiumis (Hahn, 2010).7

CAKUT-i lai fenotüübiline varieeruvus genotüüp-fenotüüp korrelatsioonis vihjab sellekeerulisele tekkemehhanismile, mis sõltub mitme faktori koostoimest (Song ja Yosypiv,2011). Kuigi paljud CAKUT-i vormid on põhjustatud üksikute geenidefektide poolt, polemitmeid haigust põhjustavaid mutatsioone tänaseni tuvastatud (Saisawat jt., 2012).1.3 GDNF geen ja valkGDNF geen asub inimesel 5. kromosoomi lühikeses õlas (5p12-p13.1) (Schindelhauer jt., 1995).GDNF on glükosüleeritud disulfiidsildadega seotud homodimeer, mis on kauges sugulusesTGF-β superperekonnaga (Lin jt., 1993). Varasemad uuringud on näidanud, et inimese GDNF(hGDNF) geen sisaldab kolme eksonit, mis kodeerivad ekson 2 splaissingu tulemusena kahtemRNA-d. Viimaste katsete põhjal on leitud GDNF geenis kuus eksonit ja vähemalt viisalternatiivselt splaissitud transkripti. Lisaks on kirjeldatud vastasahelalt transkribeeritavGDNFOS geen, millel on neli isovormideks splaissitud eksonit, kusjuures esimene ekson onmõlemal geenil ühine (joonis 3) (Airavaara jt., 2011).Joonis 3 A. Inimese GDNF/GDNFOS genoomne lookus, geeni struktuurid ja splaissingu mustrid.Kastid tähistavad eksoneid, lineaarsed jooned introneid ja kolmnurgad tähistavad splaissingu mustreid.B. GDNF ja GDNFOS transkriptide isovormid ja TaqMani indikaatori disain. Kastid märgivadsplaissitud eksoneid, TaqMani indikaatorid on ära märgitud eksonite liitekohtade vahel(Airavaara jt., 2011)GDNF geeni 3'UTR sisaldab polümorfset AGG kordust, mis võib olla üheks skisofreeniatekke põhjuseks. Katsed on näidanud, et 3'UTR piirkonnas olev AGG suurem korduste arv(n ≥15) kaitseb haiguse tekkimise eest (Michelato jt., 2004). Lisaks sellele on 3'UTRpiirkonnas ka polüA-d siduvate valkude ning mikroRNA-de seondumiskohad, misreguleerivad post-transkriptsiooniliselt kodeerivat mRNA-d ning 3'UTR piirkonna aktiivsust.Sellegipoolest pole kindlaks tehtud kõiki faktoreid, mis osalevad GDNF geeni ekspressiooni8

eguleerimisel üle 3'UTR piirkonna (Oh-hashi jt., 2012). Lühiajalised ekspressiooni katsed onnäidanud, et ekson 2 on vajalik õigeks rakutöötluseks, et toota eritatavat hGDNF vormi, samalajal kui ekson 3 ekspressioon on piisav, et kodeerida küpset hGDNF-i vormi, mida säilitadarakus. Katsetega on selgitatud, et hGDNF geeni transkriptsioon algab ekson 1-le eelnevaltTATA- sisaldavalt promooterilt. Sellest järgmine promooter asub ekson 2-e 5' alas (Grimm jt.,1998).Gliiapärane neurotroofiline faktor, GDNF, puhastati esimesena roti glioomist ehkajukasvajast, kus ta leiti olevat embrüonaalse keskaju dopamiini neuronite troofiliseksfaktoriks. Kuna GDNF kaitseb dopamiini eritavaid neuroneid Parkinsoni haigustegaloomamudelites ning motoorseid neuroneid in vivo, loodetakse antud geeni kasutadaterapeutilise tegurina ravimaks erinevaid närvide taandarenguga seotud haigusi. GDNF-l oneriline roll neuronite, nagu motoorsete neuronite ja dopamiini eritavate neuronite kaitsmisel.Lisaks on leitud GDNF-l olevat ka oluline roll väljaspool närvisüsteemi. GDNF käitubneerude arengus morfogeenina ja reguleerib spermatogoonide diferentseerumist (Airaksinenja Saarma, 2002). Katsed on näidanud, et GDNF geeni puudumine põhjustab vastsündinutelneerude ja kusejuha ageneesi. GDNF geeni mitteomavatest vastsündinud hiirtest on ~80%-ltäheldatud neeru ageneesi ja ~20%-l erinevaid neeru hüpodüsplaasiaid (Michos jt., 2010).GDNF on potentsiaalne TGF-β neurotrofiin, millel on põhiroll kusejuha hargnemiseinduktsioonis arenevas metanefroses (Vize jt., 2003).1.3.1 GDNF/RET signaalradaGDNF-i signaal on vahendatud türosiinkinaasse retseptori c-Ret interaktsioonide läbi(Vize jt., 2003). GDNF/RET signaalraja mehhanism, millega indutseeritakse epiteliaalsethargnemist, on väga põhjalikult selgitatud (joonis 2). GDNF signaalrada koosneb kahestmembraanseoselisest retseptorist. Üheks retseptoriks on glükosüülfosfatidüülinositooligaankurdatud ligandi seondaja, GDNF perekonna retseptor α1 (GFR-α1). Retseptori teisekspooleks on RET türosiinkinaas (Grimm jt., 1998). Koos moodustavad retseptorid GDNF/RETsignaalraja, mis vastutab GDNF seondamise eest. GFR-α1 ja RET valkude moodustumineindutseerib GDNF RET vahendatud türosiini fosforüleerimist sihtmärk rakkudes (Jing jt.,1996). Wolffi juhas edendab antud signaalrada esialgu rakkude liikumist, mis eelneb kusejuhatekkele, ning seejärel indutseerib UB väljakasvu Wolffi juhast. Kusejuha tippudes suurendabGDNF/RET rakkude vohamist, mis on hargnemise eeltingimuseks. Katsed on näidanud, ethiirtel, kellel puudub GDNF geen ja selle retseptorid RET ja GFR-α1, esineb neeru ageneesi(Airaksinen ja Saarma, 2002).9

1.4 DNA varieeruvusOrganismi areng ja funktsioonid on suures osas tagatud ja kontrollitud geenide poolt.Mutatsioonid võivad viia muutusteni kodeeritud valgu struktuuris või selle avaldumisetasemes. Muutused DNA primaarstruktuuris, mis ei ole geeni kodeerivas osas, mõjutavadgeenide ekspressiooni, epigeneetilist mustrit, kromatiini struktuuri jms ning omavad seegaolulist osa ka geenide ekspressioonis. Kuna muutused valke kodeerivas DNA järjestusesmõjutavad iga kodeeritud valgu koopiat, võivad need mutatsioonid kahjustada raku võikoguni terve organismi talitust. Inimese geneetilised variandid ulatuvad ühe nukleotiidimuutusest kuni terve kromosoomi duplikatsiooni või deletsioonini (Read ja Strachan, 2010).Mõningad DNA variandid tulenevad vigasest DNA replikatsioonist või rekombinatsioonist.Enamik mutatsioone tekib aga suutmatusest parandada vigast DNA-d. Enamus mutatsioonivariantidest on kahjutud ning ei oma mõju fenotüübile. Ka suurem osa nendest muutustest,mis mõjutavad mingil määral fenotüüpi, on üheks osaks normaalsest varieeruvusest, mis teebmeid kõiki individuaalseteks. Kõige uuritavamad on aga need mutatsioonid, mis põhjustavadhaigusi või muudavad organismi altimaks haigustele (Read ja Strachan, 2010). Peamiseltjagatakse ühenukleotiidsed variatsioonid esinemissageduse järgi kaheks: populatsioonis alla1% sagedusega esinevaid variatsioone nimetatakse mutatsioonideks ja üle 1%esinemissagedusega ühenukleotiidseteks polümorfismideks.Ühenukleotiidsed ja teised väiksemad mutatsioonid on sagedased patogeense muutuse tüübid.Patogeensed muutused on tihti põhjustatud väikese ulatusega järjestuste muutustest kaskodeerivas järjestuses või geeni regulatoorses alas (Read ja Strachan, 2010).1.4.1 Kodeeriva ala mutatsioonidÜhe nukleotiidi asendus geeni kodeerivas järjestuses võib ka mitte muuta kodeeritud valgujärjestust. Seda põhjusel, et 64 koodonit kodeerivad ainult 20 erinevat aminohapet. Koodonikolmas positsioon omab siin väiksemat tähtsust. Sellepärast ei muuda kõik muutusedkoodonites aminohapet – need on kas vaigistatud või sünonüümsed muutused. Kui tekibolukord, mil muutub ka kodeeritud aminohape, sõltub tulenev efekt osaliselt vana ja uueaminohappe keemilistest erinevustest. Ühe aminohappe muutmine samas klassis oleva teiseaminohappega omab nõrgemat mõju kui asendus erinevates klassides olevate aminohapetega(Read ja Strachan, 2010).64-st erinevast koodonist kolm kodeerivad stoppkoodoneid, mis tähendab, et nukleotiidivahetusega võib koodon muutuda aminohapet mittekodeerivaks stoppkoodoniks. Selle10

tulemusel ei sünteesita mRNA-lt enam valku edasi ja vastav polüpeptiid vabastatakseribosoomi küljest (Read ja Strachan, 2010).Translatsiooni lugemisraam pannakse paika esimese AUG koodoniga, millelt algabvalgusüntees. Igasugune kolmega mittejagunevate koodonite lisamine või eemaldaminepõhjustab lugemisraamis raaminihet ja seega võivad mõjutada ka geeniproduktide muutust,mis on samuti väga sage juhus (Read ja Strachan, 2010).1.4.2 Regulatoorse ala mutatsioonidLisaks geeni kodeerivale alale on ka olulised selle ümbruses olevad järjestused. GDNF geeniesimese eksoni ümbruses asuvad transkriptsiooni reguleerivate faktorite seondumiskohad jageeni 3’ otsas olevas mittetransleerivas alas (UTR) asuvad RNA tasemete regulaatorite,mikroRNA-de, seondumiskohad (Oh-hashi jt., 2012). Kuna transkriptsioonifaktorid ja teisedekspressiooni regulaatorid seonduvad järjestusespetsiifiliselt, võivad muutused nendespiirkondades mõjutada geeniekspressiooni taset (Read ja Strachan, 2010).1.4.3 Mutatsioonide mõju fenotüübileMutatsioonide mõju fenotüübile võib varieeruda väga väikestest muutustest, mida saab uuridavaid geneetiliste või biokeemiliste tehnoloogiatega, kuni suurte morfoloogilistemodifikatsioonideni ning surmani. Geene, mis mõjutavad fenotüüpi vähe või ei tee sedaüldse, nimetatakse isoalleelseteks. Teised mutatsioonid toodavad null-alleele, mille tagajärjelei toodeta geeniprodukti või sünteesitakse mittetöötav geeniprodukt. Kui viimasena mainitudtüüp mutatsioone esineb geenides, mis on organismi kasvuks vajalikud, siis indiviidid, kes onantud mutatsiooni suhtes homosügootsed, ei jää tavaliselt ellu. Mutatsioonid võivad olla kasretsessiivsed või dominantsed. Inimeses ja teistes diploidsetes organismides mõjutavadretsessiivsed mutatsioonid fenotüüpi vaid juhul kui tegu on homosügootse võiliitheterosügootse (ühes geenis olevad erinevad mutatsioonid) seisundiga. Seega enamusretsessiivseid mutatsioone ei ole väliselt märgatavad nende esinemise ajal, kuna nad onheterosügootses seisundis ja tavaliselt piisab ühelt geenilt sünteesitava produkti hulgastfunktsiooni tagamiseks (Snustad ja Simmons, 2008).Erinevad variatsioonid geenides, nagu nukleotiidi asendused, deletsioonid ja insertsioonid,võivad mõjutada geeniprodukti funktsiooni ja olles sageli ka kahjulikud, muutes fenotüüpi.Tuntud alleelsete variatsioonide sõelumine on oluline, et määrata haiguste ja geenideomavahelisi seoseid ja avastada varakult potentsiaalseid haigusi (Argüello jt., 1998).11

1.5 DNA sekveneerimine1.5.1 Sangeri meetodSekveneerimise tehnoloogia on muutnud kaasaegset bioloogiat, tagades bioloogilistesüsteemide kirjelduste jaoks täpsed tööriistad. See tegevusala on kiiresti liikunud võimenikombineerida fenotüübi andmeid DNA järjestusega ja seega liita üheselt väiksemadki DNAmuutused [nt ühenukleotiidi polümorfismid (SNP-d)] bioloogiliste fenotüüpidega. Seevõimaldab jälgida nukleiinhapete poolt juhitud protsessidega fundamentaalse elu kulgu ainsasrakus või koguni keerulistes eukarüootsetes organismides (Janitz, 2008).Klassikaline Sangeri sekveneerimismeetod sisaldab üheahelalise DNA sekveneerimistmärklaudspetsiifiliste praimerite, DNA polümeraasi (Sequenase),desoksüribonukleotiididtrifosfaatidega (dNTP) ja ahelat termineerivate märgistatuddidesoksüribonukleotiidtrifosfaatidega (ddNTP) (Sanger jt., 1977). Sõltuvaltsekveneerimismasinast võib Sangeri meetodi puhul varieeruda kasutatavatefluorestsentsvärvide ja elektroforeesi radade arv. Kui sekveneerimismasinal puudub spektrieristamisvõime, tuleb elektroforeesi puhul kasutada nelja erinevat rada iga DNA molekulijaoks (Ansorge jt., 1990). Kui aga kasutatakse nelja erinevat fluorestsentsvärvi, võib radadearvu kahandada üheni. Kuna ühe fluorestsentsvärvi kasutamise korral ei ole võimalikerinevaid nukleotiide värvi järgi eristada, tuleb elektroforeesil kasutada nelja erinevat rada,mille abil oleks võimalik määrata nukleotiidide järjestus. Siiski pole see meetodi vägamõistlik, kuna geeli kapillaarsus pole igas osas alati sama. Kõige sagedamini kasutatakseSangeri sekveneerimisel nelja erinevat fluorestsentsvärvi ning ühte elektroforeesi rada. Sellepeamiseks kasutamise põhjuseks on suur läbilaskevõime ja väga täpne nukleotiidide järjestusemääramine ka pikkade DNA proovide puhul. Sellegipoolest nõuab nelja erineva värvikasutamine ulatuslikke optilisi komponente, et sorteerida värve. Mõningatel juhtudel on tarviska mitmed ergastamisallikad, et efektiivselt ergastada fluorestsentsvärve (Li ja Yeung, 1995).12

Joonis 4 Sangeri meetod (Winnick, 2004)Nagu joonisel 4 selgub, on Sangeri klassikalises versioonis järjestuse reaktsioon läbi viidudneljas tuubis, millest kõik sisaldavad täit komplekti märgistatud desoksünukleotiidtrifosfaatidest(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), polümeraasist, praimeritest ja ühte tüüpi ahelaterminaatorit (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP). Lõpptulemusena sünteesitakse reaktsioonidekäigus originaalsele DNA-le komplementaarsed, erinevate pikkustega koopiad, misvarieeruvad mõnest nukleotiidist kuni mõnesaja nukleotiidini ja lõpevad ühe terminaatoriga.Iga reaktsiooni märgistatud tulemused eraldatakse geelil, mis lahutab produktid ühenukleotiidi täpsusega. Seejärel visualiseeritakse DNA vöödid, mille abil saab määratanukleotiidse järjestuse (Yegnasubramanian ja Isaacs, 2010).1.5.2 Teise põlvkonna sekveneerimineTermin teise põlvkonna sekveneerimine viitab tehnoloogiatele, mis võimaldavad massiivsetparalleelset DNA järjestuse analüüsi. Need tehnoloogiad on hõlbustatud ka paljude erinevatemolekulaarbioloogiaga seotud alade poolt. Praegused teise põlvkonnasekveneerimistehnoloogiad on võimelised sekveneerima kümneid tuhandeid kuni miljoneidDNA molekule samaaegselt ning genereerima rohkem kui 100 miljardit aluspaari järjestusiainsa päevaga. Teise põlvkonna tehnoloogiad on hakanud asendama keskmiseläbilaskevõimega Sanger sekveneerimist suuremõõduliste genoomsete projektide juures ja onsuureks innustuseks individuaalse meditsiini ajastul (Yegnasubrmanian ja Isaacs, 2010).Hiljutised uuendused DNA sekveneerimisel, mis aitavad DNA järjestust lugeda kiiremini, onmuutnud geneetilistele küsimustele vastamise väga kiireks. Need tehnoloogiad tagavad13

odavalt terve genoomi järjestuse määramise, mis omakorda võimaldab avastada mutatsiooneja ka genotüpiseerida polümorfisme. Lisaks on teise põlvkonna sekvenaatoritega võimalikideaalselt uurida geenide transkriptsiooni regulatsiooni, kas sekveneerides otse RNA-d (shväiksemat mittekodeerivat RNA-d) või kaardistada transkriptsioonifaktorite seondumistkromatiinide immunosadestamise abil (Mardis, 2008).Viimase kuue aasta jooksul on kättesaadavaks muutunud mitmed paralleelsed DNAsekveneerimismeetodid, mis on vähendanud DNA sekveneerimise hinda ja võimaldanudgenoomi mahuga proove sekveneerida ka üksikute laborite poolt. Need uued tehnoloogiadarenevad väga kiiresti, luues järjestuste raamatukogusid ning arendades andmeanalüüsi. Teisepõlvkonna DNA sekveneerimisel on potentsiaalne võime kiirendada uuringuid biolooga jabiomeditsiini aladel, võimaldades üldisel genoomide analüüsil, transkriptidel jainteraktoomidel muutuda odavamaks, rutiinseks ja laialt levinuks (Shendure ja Ji, 2008).Teise põlvkonna sekveneerimistehnoloogiate arenguga on intensiivistunud ka konkurentsvastavate tehnoloogiate arenguga tegelevate firmade vahel. 454 Life Technologies (Marguliesjt., 2005), hiljem omandatud Roche'i poolt, oli esimene firma, mis andis välja NGS platvormi.Solexa (Bennett, 2004), mis nüüd on Illumina üks osa, andis välja järgmise platvormi, misomandati Agencourtilt. Helicos oli esimene firma, mis väljastas üksiku molekulisekveneerimise (Braslavsky jt., 2002) NGS platvormi, mida nüüd mitmed firmad kasutavad,sealhulgas Complete Genomics, Pacific Biosciences ja Ion Torrents.Praeguseks on olemas ka kolmanda põlvkonna sekveneerimismeetod „Oxford Nanopore“, mispõhineb ühe molekuli sekveneerimisel (Schadt jt., 2010). DNA sekveneerimise alternatiivsedstrateegiad võib grupeerida erinevatesse kategooriatesse. Need kategooriad oleksid:mikroelektroforeesi meetodid, sekveneerimine hübridisatsiooniga, reaal-aja üksikutemolekulide jälgimine ja tsüklilise rea sekveneerimine (Shendure ja Ji, 2008).1.5.2.1 Illumina/SolexaIllumina/Solexa sekveneerimismeetodit (Bennett, 2004) kasutatakse hetkel kõige rohkem teisepõlvkonna meetoditest. Illumina raamatukogud ehitatakse mõnesaja aluspaari pikkusteadapterkülgnevate fragmentide segust, mis saadakse DNA juhusliku fragmenteerimise teel võiPCR-i reaktsioonil. Amplifitseerimine on läbi viidud kiibil nn PCR silla abil. Selliselähenemisega on nii forward kui ka reverse PCR-i praimerid kinnitatud paindliku adapterigatahkele kandjale nii, et kõik DNA koopiad (amplikonid) jääksid amplifikatsiooni käigusimmobiliseerituks kindlale asukohale. Amplifikatsiooni käigus painduvad üheahelalised DNAfragmendid, ühenduvad komplementaarsele adapterile ning moodustavad „silla“ (joonis 5).Lõpptulemusena saadakse mitu miljonit klastrit, millest igaüks sisaldab umbes tuhat kloonitud14

fragmenti. Seejärel blokeeritakse fragmendid 3'OH otsast ja hübridiseeritaksesekveneerimispraimer (Shendure ja Ji, 2008). Meetod võimaldab DNA fragmendisekveneerimist 50-150 bp ulatuses mõlemast otsast.1.5.2.2 454 pürosekveneerimine454 süsteem oli esimene kommertsiaalne teise põlvkonna sekveneerimismeetod (Marguliesjt., 2005). 454 pürosekveneerimistehnoloogia baseerub sünteesi käigus sekveneerimisel(Mitra jt., 2003) ja sisaldab tsüklilist nukleotiidide reagentide voolu PicoTiterPlate plaadil(Shendure ja Ji, 2008). See tehnoloogia põhineb pürosekveneerimise tehnoloogial, kus teiseahela sünteesiks lisatakse ükshaaval nukleotiide ning nukleotiididevahelise fosfotriestersideme moodustumisel eraldub pürofosfaat (Nyren jt., 1993). Pürofosfaadi eraldumist onvõimalik tänu mitme ensüümi koostööle võimalik valguskvandina detekteerida. Pärastvalguskvandi registreerimist algab tsükkel algusest peale (Ronaghi jt., 1996). Template-DNAsaadakse emulsiooni PCR-il. Emulsiooni PCR-i puhul ühendatakse DNA fragmendidadapteritega streptavidiinist kerakese külge ning viiakse erinevatesse emulsiooni tilkadesse.Tilgad käituvad kui individuaalsed amplifikatsioonireaktorid, tootes ~10 7 referents-DNAkloonikoopiat ühe kerakese kohta (Margulies jt., 2005). Sekveneerimise käigus voolutataksetsükliliselt A, T, G ja C nukleotiide. Kui voolutatud nukleotiid on komplementaarneemulsioonitilgas oleva DNA fragmendiga, lisatakse polümeraasiga täiendavad nukleotiidid(joonis 5) (Balzer jt., 2010).1.5.2.3 ABi SOLiDSelle tehnoloogiaga saadakse sekveneerimiseks vajalikud fragmendid samuti emulsioonPCR-i abil, kus DNA fragmendid on kinnitatud paramagneetilise kerakese külge (joonis 5).Pärast emulsiooni katkestamist immobiliseeritakse amplifikatsiooni produktidega kerakesedtahkele pinnale, et tekitada tihe korrapäratu rida. Sekveneerimine on DNA polümeraasiasemel juhitud DNA ligaasi abil, kus tahkele pinnale hübridiseeruvad pentameerid ligeeritakseomavahel perfektse hübridisatsiooni korral (Shendure jt., 2005). Adaptormolekulilekomplementaarne universaalne praimer hübridiseeritakse produkte kandvate kerakeste reale.Iga tsükkel sisaldab fluorestsentsiga märgistatud oktameere, mis aitavad hiljemidentifitseerida spetsiifilisi positsioone (Shendure ja Ji, 2008). Lisaks kasutab SOLiDtehnoloogia kahe aluse kodeerimisskeemi, kus iga saadud tulemus koosneb kahest lähestikkuasetsevast aluspaarist. Seetõttu sekveneeritakse SOLiD meetodi puhul ühte nukleotiidi kakskorda, mille abil on võimalik eristada sekveneerimisel tekkinud vigu tõelistestpolümorfismidest (Ondov jt., 2008).15

Joonis 5 (a) 454 ja SOLiD kasutavad emulsiooni PCR-i, mis sisaldab amplifitseerimisel pärlitekasutamist. Iga pärl kannab oma pinnal DNA fragmentide koopiaid. (b) Solexa tehnoloogia kasutabamplifitseerimisel „silla“ põhimõtet. Iga klaster sisaldab lõpptulemusena ligikaudu tuhat koopiat(Shendure ja Ji, 2008)1.5.2.4 Teise generatsiooni sekveneerimistehnoloogiate eelisedTavapärase sekveneerimise (nt Sanger) rakendus on muutunud väga mitmekesiseks. Väikeseskaalaga projektide jaoks, mille suurused varieeruvad kilo-aluspaaridest mega-aluspaarideni,jäävad tavapärased sekveneerimistehnoloogiad üheks valikuks ka tulevikus (Shendure ja Ji,2008). Paraku on praegusel hetkel teise põlvkonna tehnoloogiad hakanud asendama tuntudSanger meetodit just oma odavuse ja suure läbilaskevõime poolest (tabel 1) (Morozova jaMarra, 2008). Seepärast jäävadki ilmselt suuremahulised projektid tuginema enamjaolt uuteletehnoloogiatele. Seda on näidanud ka fakt, et Venteri genoomi sekveneerimiseks kasutatitraditsioonilist Sangeri meetodit, kuid Watsoni genoom sekveneeriti juba 454pürosekveneerimismeetodiga. Kuigi teise põlvkonna sekvenaatorid toodavad kokkuvõtteslühemaid järjestusi, on nende kasutamine suuremates projektides odavam ja kiirem kuiesimese põlvkonna tehnoloogiate kasutamine (Shendure ja Ji, 2008).Tabel 1: Erinevate teise põlvkonna sekveneerimismeetodite võrdlus. 123Tehnoloogia/MeetodLähenemisviisMaksimaalnelugemispikkusAluspaari katsekohtaAutomatiseeritudSangerSüntees märgistatudterminaatorite juuresolekul900 bp 96 kb454/Roche Pürosekveneerimine tahke toega 700 bp 700 MbIllumina/SolexaABI/SOLiDSekveneerimine sünteesiga koos„pööratavate“ terminaatoritegaMassiivne paralleelnesekveneerimine ligeerimisega150 bp 600 Gb75 bp 300 Gb1 http://www.illumina.com/systems/hiseq_systems.ilmn2 http://454.com/products/gs-flx-system/index.asp3 http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generationsequencing.html16

1.6 SNP-de genotüpiseerimineDNA sekveneerimise tulemusena on leitud hulgaliselt ühenukleotiidseid polümorfisme(SNP-d), mis on muutused ühes aluspaaris genoomi kindlas positsioonis. SNP-sid on leitudinimese genoomis umbes iga 100-300 aluspaari järel ning definitsiooni järgi on nendeesinemissagedus (alleelisagedus) populatsioonis >1%. SNP-d on genoomis kõigesagedasemalt leitud polümorfismid ning neid on kasutatud ka keeruliste geneetiliste tunnusteuurimiseks (Hsu jt., 2001). SNP-d on olnud abiks selgitamaks tavaliste, keeruliste haigustegeneetilist tausta. Koos analüüsi astmetega on oluline ka haiguste funktsionaalneennustamine, et prioriseerida mittesünonüümsed SNP-d edasiseks analüüsiks. (Liu jt., 2011).Vaatamata sekveneerimistehnoloogiate edenemisele ja terve genoomi või eksoomisekveneerimise hinna langusele, on need meetodid siiski väga kallid ja seega pole suure hulgaindiviidide genoomide sekveneerimine veel mõeldav paljudele laboritele. Selle pärast onmõistlik sekveneerida mõned väga hästi iseloomustatud patsiendid ja seejärel leitudmutatsioonide sageduse määramine mõne genotüpiseerimismeetodiga suuremas hulgaspatsientides ning tervetel indiviididel.Konkreetse genotüpiseerimisprojekti jaoks valitav meetod sõltub SNP-de arvust ja DNAproovide hulgast, mida genotüpiseeritakse. Terve genoomi või suuremõõdulise projekti jaoks,kus uuritakse ülegenoomselt leiduvaid SNP-sid, on ideaalsed Affymetrix SNP GeneChip jaIllumina Infinium BeadChips analüüsid. Väikese hulga SNP-de ja suure DNA proovidehulgaga kasutatakse tavaliselt TaqMan analüüsi, kuna see tehnoloogia on suureläbilaskevõimega, väga täpne, kiire ja odav (Shen jt., 2009).Enamus SNP-de genotüpiseerimismeetodeid on liiga aeglased ja kallid, et neid rutiinseltsuurtes, sadade SNP-de ja suure hulga DNA proovidega ühendatud uuringutes kasutada.Sellegipoolest on SNP-de genotüpiseerimistehnoloogiad väga kiiresti arenenud ning selletulemusena on täiustatud vanu meetodeid ning esile on kerkinud ka kiiremad ja odavamadmeetodid (Syvänen, 2005).1.6.1 Taqmani meetod SNP-de genotüpiseerimiseksTaqMan reaalaja polümeraasahelreaktsioon on tundlik ja usaldusväärne meetod, midakasutatakse laialdaselt üle maailma. Ometi on selle meetodi võimetus viia läbi analüüseväikese hulga DNA proovidega selle suurimaks piiranguks (Yoshimura jt., 2005). TaqManSNP genotüpiseerimisanalüüsi nimetatakse ka 5' nukleaasi alleelse eristamise analüüsiks ningvajab nii forward ja reverse PCR praimereid kui ka kahe erineva märgistusega TaqManväikese soone sidumisindikaatoreid (MGB, ingl k minor groove binder) (Rickert jt.2004).17

Dialleelne SNP asetseb indikaatori ühes kolmandikus. Iga alleelspetsiifiline MGB indikaatoron märgistatud fluorestsentsvärviga ja seotud fluorestsentsi kustutajaga (joonis 6). Selletulemusena ei fluorestseeru vigastamata MGB indikaatori värv. PCR-i käigus lõikab 5'nukleaasse aktiivsusega Taq DNA polümeraas reportervärvi sellisest MGB indikaatorist, mison täielikult hübridiseerunud DNA ahelale. Kui eemaldada lõikamisega fluorestsentsikustutaja, hakkab DNA proov fluorestseeruma. SNP-de esinemise korral on indikaatoriseondumine DNA-ga destabiliseeritud, mis vähendab indikaatori lõikamise efektiivsust javärvi kustutaja eemaldamist (Shen jt., 2009).Joonis 6 TaqMan meetod 41.6.2 PCR-i ja geelipõhised meetodid1.6.2.1 Alleelspetsiifiline PCRAlleelspetsiifilise PCR meetodiga SNP-de genotüpiseerimine sisaldab genoomse DNAamplifikatsiooni PCR-i kahe alleelspetsiifilise praimeriga. Kokku kasutatakse PCR-l kolmepraimerit, millest kaks on alleelspetsiifilised ja erineva pikkusega ning üks ühine reversepraimer. Pärast amplifikatsiooni analüüsitakse produktide pikkust agaroos geelil. Kuna nendepraimerite 3' terminustes on üks alleelspetsiifiline nukleotiid, seonduvad praimerid vaidselliste DNA molekulidega, millel on vastava 3' terminustega komplementaarne alleel.Vastasel juhul seondumist ei toimu ning DNA-d ei amplifitseerita. Proovide eristamiseksseotakse praimerite 5' terminusse erinevate pikkustega „sabad“, mille tõttu muutuvad kaamplifitseeritavate DNA-de pikkused. Selle abil saab määrata vastavaid polümorfisme(Myakishev jt., 2001). Alleelspetsiifilise PCR-i kasutamine polümorfismidegenotüpiseerimiseks on väga odav ja lihtne. Sellegipoolest võib 100%-lise spetsiifilisusesaavutamiseks vajalik olla optimeerimine.4 http://www.scripps.edu/florida/technologies/genomics/genotyping.html18

1.6.2.2 PCR-RFLPPCR-i restriktsiooni fragmendi pikkuse polümorfismi (RFLP) analüüs on samuti odav SNP-degenotüpiseerimismeetod ning hea ka mutatsioonide avastamisel (Chang jt., 2010). Sellemeetodi puhul amplifitseeritakse genoome DNA PCR-ga, ning seejärel lisatakse proovilerestriktsiooniensüümi, mille lõikamiskohas asub huvipakkuv SNP. Reaktsiooni käigus lõikaballeelspetsiifiline restriktsiooniensüüm DNA katki kindla SNP-i juurest. Selle tulemusenatekib kaks erineva pikkusega fragmenti, mida saab agaroosgeelil eristada ning mille abil saabmäärata SNP alleeli 5 (joonis 7). Võrreldes alleelspetsiifilise PCR-ga on antud meetodrestriktsiooni lisamise tõttu pisut spetsiifilisem, kuid selle võrra ka kallim.Joonis 7 PCR-RFLP genotüpiseerimismeetod A. 429 bp pikkune fragment inimese EIF2AK3 geenist,mille sees paiknev huvipakkuv SNP, amplifitseeriti PCR-i meetodiga. Puhastamata PCR-i produktidlagundati Hhal restriktsiooniensüümi poolt, mis tunneb ära vaid G alleeli SNP-s. B. Lõpptulemusenasaadud fragmendid paljastavad iga indiviidi genotüübi, mis analüüsitakse agaroosgeelil, paralleelseltlagundamata PCR-i produktide ja markeriga; A, G ja A/G vastavad iga proovi SNP alleelidele 65 http://www.finnzymes.com/pdf/pcr_rflp_phusion_blood_app_protocol.pdf6 http://www.finnzymes.com/pdf/pcr_rflp_phusion_blood_app_protocol.pdf19

1.6.3 PCR-i vabad genotüpiseerimismeetodidEnamus SNP-de genotüpiseerimismeetodeid tuginevad SNP-sid sisaldavate genoomseteregioonide eelamplifikatsioonile polümeraasahelreaktsiooni (PCR) abil. PCR-i tehnoloogiateareng on genoomsetes analüüsides, sealhulgas genotüpiseerimises suuri muutusi toonud,muutes spetsiifilised genoomsed piirkonnad järeleandlikeks otsestele biokeemilisteleavastustele (Tsuchihashi ja Dracopoli, 2002).Üheks PCR-i vabaks genotüpiseerimismeetodiks on Invader meetod Third Wave Technologiespoolt. Invader meetodit võib kombineerida PCR-ga, et kahandada DNA hulga nõuet, mismuudab lisaks vähesele materjalile ka signaali viimistletumaks. See meetod põhinebnukleotiidispetsiifilisel lõhustumisel struktuurispetsiifilise endonukleaasi poolt. Sellereaktsiooni kombineerimine fluorestsents resonantsenergiaga kannab üle oligonukleotiididekassette, tekitades nii kõrgelt alleelspetsiifilise signaali (Tsuchihashi ja Dracopoli, 2002).1.6.4 SNP-de analüüs Illumina Infinium® tehnoloogiagaPraegu on maailmas kõige laialdasemalt kasutusel Illumina Infinium kiibid DNA proovideülgenoomseks genotüpiseerimiseks (Steemers ja Gunderson, 2007). Ühe kiibi peal onvõimalik korraga analüüsida sadu tuhandeid kuni mõned miljonid SNP-d. DNA proovidamplifitseeritakse juhuslikult üle genoomi (whole genome amplification), fragmenteeritakse,ja hübridiseeritakse seejärel kiibile, kus asuvad kohtspetsiifilised oligonukleotiidid.Oligonukleotiidid hübridiseerivad SNP-le eelnevale alale, ja pikendatakse ühe märgistatudnukleotiidi (ddNTP) võrra.1.7 Genotüüp-fenotüüp seos põhjuslike mutatsioonidegaHaigusi tekitavate geenivariantide identifitseerimine tugineb haiguse fenotüübile.Genotüpiseerimist kasutatakse haigusele altide geenide identifitseerimiseks populatsioonides.See võib olla geeni funktsiooni identifitseerimise esimeseks sammuks. Et toetada geeniiseloomustamist, on vaja kasutada kiiremaid ja efektiivsemaid genotüpiseerimismeetodeid(Altshuler jt., 2008).Ühe geeni häire haiguste puhul, mida teatakse ka monogeensete haiguste nime all, on haigusepõhjustajaks mutatsioon ainsas geenis. Polügeensete häirete puhul on haiguse tekitamiseksvaja mutatsioone mitmes geenis.20

Tabel 2: Geneetilise põhjuslikkuse määr ja molekulaargeneetilise diagnostika võimsusretsessiivsetes, dominantsetes ja polügeensetes haigustes (Hildebrandt, 2010)GeneetilinepõhjuslikkusGeeniefekti esineminefenotüübisMutatsioonianalüüsiennustuslik võimsusHaiguse puhkemiseaegMolekulaargeneetikalähenemisteedRetsessiineMonogeenneDominantnePolügeenneTugev Keskmine NõrkTäielik Mõnikord ebatäielik NõrkPeaaegu 100% Tugev NõrkLooteiga, lapseiga,noorukiigaOtsene eksonitesekveneeriminetuntud haigusegeenidestTäiskasvanuigaOtsene eksonitesekveneeriminetuntud haigusegeenidestNoorukiiga,täiskasvanuigaAinult relatiivse riskimääramine võimalikEsinemissagedus

2 Eksperimentaalosa2.1 Töö eesmärgidKäesoleva töö praktilise osa eesmärgiks on sekveneerida CAKUT-i haigetel inimestel GDNFgeen ning leida muutused, mis võiksid olla CAKUT-i tekkepõhjusteks.Selleks on püstitatud järgmised uurimisülesanded: Sekveneerida kaasasündinud neeruanomaaliatega inimestel GDNF geen Leida patsientide DNA-s muutusi, mis ei esine tervetel indiviididel.Käesoleva töö autor tegi iseseisvalt Sangeri sekveneerimise katsed UTR1 praimeripaariga,analüüsis kõikide PCR fragmentide järjestusi ning koostas tulemuste tabeleid.2.2 Materjal ja metoodika2.2.1 ValimUurimise läbiviimiseks kasutati Tartu Ülikooli Eesti Geenivaramu üle Eesti kogutudgeenidoonorite DNA proove. Valimisse kaasati inimesed, kellel oli pere- või eriarsti pooltkinnitatud neerude arenguhäirete diagnoosid ja keda oli ka opereeritud. Valimi saamiseksvaadati läbi 51515 geenidoonori terviseandmed, mille tulemusena saadi sobiva diagnoosiga111 isikut, kellest 21 olid mehed ja 69 naised, keskmise vanusega 43 aastat. 111 indiviidiproovist 90 olid võetud CAKUT-i diagnoosiga haigetelt. Kontrollidena kasutatud terveteinimeste proovide arv varieerus 5-21-ni, sõltuvalt sekveneerimisel kasutatud platvormist.Käesoleva töö raames teostavate uuringute läbiviimiseks on Tartu Ülikooli inimuuringuteeetika komitee luba.2.2.2 GDNF-i sekveneerimine Sangeri meetodilDNA proovid amplifitseeriti PCR-i meetodiga iga indiviidi GDNF geenilt viis eksonit ning3'UTR piirkond. Uuritava DNA jaoks disainiti unikaalsed praimerid, mis on välja toodudtabelis 3. Praimerite disainimiseks kasutati Whitehead Institute for Biomedical Research jaHoward Medical Institute’s välja töötatud veebipõhist programmi Primer3 (Rozen jaSkaletsky, 2000). Sellega on võimalik kasutaja poolt sisestatud järjestusele disainidapraimereid, arvestades erinevaid etteantud parameetreid.22

Tabel 3: Polümeraas ahelreaktsioonis kasutatud praimeridPraimeritepaarPraimeri nimetus Järjestus 5'-3' Amplikoni pikkusExon1Exon1nc_foExon1nc_reTCTTACGCCTCTGGAATTGGGGGTGGATCAAAAATCGAGA629 bpExon2Exon2_foExon2_reGTGGTGTCTCGTTCGGATCTGGCCTCTCTCCGGTTCTACT674 bpExon3-4Exon3-4_foExon3-4_reTCCTTTGTAGGGGTGTGAGGAACCGGGCTTCTGGCTAGT597 bpExon5Exon5_foExon5_reGCCCTGCTTGAAACTCTGACAATTCCATCCCCTCTGTGCT684 bpUTR1GDNF_UTR1_fo1GDNF_UTR1_re2GDNF_UTR1_fo2GDNF_UTR1_re1AACAAATGGCAGTGCTTCCTATGCATTGCATCGAGTAGCTTCCGCTAAAAGGTGTGGATGTTTCCAGGGTATGTCTCCACTG916 bp943 bpUTR2GDNF_UTR2_fo1GDNF_UTR2_re1GDNF_UTR2_fo2ATAACCAGCTCCGTTGATGCGAGACAGGGTACCGCACTGTCAGAGACCACTGGCACTTGA1210 bp800 bpUTR3GDNF_UTR3_fo1GDNF_UTR3_re1GAGGTTGGAGCAGGAGGAACCAGTGCATGCAAGGAAGTA918 bpPCR-i reaktsioonid viidi läbi 20 μl mahus. Reaktsioonisegu sisaldas endas: reaktsioonipuhverB [0,8 M Tris-HCl, 0,2 M (NH4)2SO4, 0,2% w/v Tween 20 (Solis BioDyne, Eesti)], 0,2 mMdATP, dCTP, dTTP, dGTP (Fermentas, Leedu), 2 mM MgCl2 (Fermentas, Leedu), 0,8x Qlahus (Qiagen GmbH, SLV), 15 pmol forward ja 15 pmol reverse praimerit, 1 U Taq DNApolümeraasi (Naxo, Eesti), 100 ng genoomset DNA-d ja lõppmahuni lisati ddH2O-d.PCR-ireaktsioonid viidi läbi programmeeritavas termotsükleris (GeneAmp® PCR System 2700,Applied Biosystems, USA).DNA fragmentide amplifitseerimiseks kasutati kolme erinevat 30-tsüklilist programmi, mis on välja toodud lisas, tabelites 7 8 ja 9.Produktid lahutati 2,5% agaroosgeelis geelelektroforeesil 0,5x TBE puhvris (0,045 MTrisboraat; 0,001 M EDTA). Visualiseerimiseks kasutati 6x laadimispuhvrit (6x Loading Dye;Fermentas) ning pikkusmarkeriks oli pUC Mix Marker, 8 (Fermentas).23

PCR-i produktid puhastati kasutamata jäänud praimeritest ja desoküribonukleotiididestensüümtöötlusega. Reaktsioonis, lõppkoguses 7 μl, kasutati 5 μl PCR-i produkti 20 Ueksonukleaasi I (0,5 μl) ja 1 U kreveti aluselist fosfataasi (1 μl). Puhastamise käigusinkubeeriti segu 37ºC juures 20 minutit ja 80ºC juures 15 minutit.Sekveneerimisreaktsioonisegu valmistamine viidi läbi jää peal. Segu, lõppkoguses 10 μl,sisaldas endas: 1,3 μl puhastatud PCR-i produkti, 0,7 μl BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing RR-100 premix’i (Applied Biosystems), 2 µl BigDye® v1.1, 3.1 5x SequencingBuffer’it (Applied Biosystems), 0,9 μl praimerit (lõppkontsentratsiooniga 10 pmol/ μl) ja5,4μl dH2O-d.Reaktsioonid viidi läbi programmeeritavas termotsükleris (GeneAmp® PCRSystem 2700, Applied Biosystems) tabelis 4 välja toodud programmi alusel:Tabel 4 SekveneerimisprogrammTemperatuur (ºC) Aeg Korduste arvDenaturatsioon 95ºC 20 sPraimeriteseondumine50ºC 50 s30xEkstensioon 60ºC 60 sHoida 10ºC juuresSekveneeritud produktid sadestati järgnevalt:1. igasse tuubi lisati 2 μl NaAc + dekstraani segu ning 30 μl külma 96º etanooli2. segu segati ja asetati 30. minutiks -20º juurde3. tsentrifuugiti 20 minutit 4ºC juures 13000 pööret/minutis4. eemaldati supernatant5. sade pesti 120 μl 70º etanooliga ja tsentrifuugiti uuesti 10 minutit 4ºC juures 13000pööret/minutis6. eemaldati supernatant, tuube kuivatati avatud kaantega 37ºC juures7. resuspendeeriti proovid 12 μl formamiidis, segati ja tsentrifuugiti põhjaJärjestuse määramine teostati Eesti Biokeskuse tuumiklaboris, kasutades Applied Biosystems3730 xl DNA Analyzer masinat.2.2.3 Andmete analüüsDNA järjestuste joondamiseks ja analüüsiks kasutati programmi Sequencher (GeneCodes),millega järjestati kõik DNA proovid referents-GDNF geeni vastu (Inimese genoomi versioon(build) 37, hg19). DNA-de võrdluses kasutati vaid neid proove, mis olid etteantud GDNFgeeniga vähemalt 85% ulatuses identsed. Heterosügootsete proovide leidmiseks olikriteeriumiks, et mõlema alleeli signaalitugevuse vahe ei oleks vähem kui 50%. Programmitulemused analüüsiti ja teostati kõigi leitud mutatsioonide kohta visuaalne kontroll.24

2.2.4 GDNF-i sekveneerimine teise põlvkonna sekvenaatorigaLisaks GDNF geeni kodeeriva ja 3’UTR ala sekveneerimisele Sangeri meetodiga, valitikoostöös eriarstiga välja 16 CAKUT-i patsienti, kellel oli lisaks tõestatud diagnoosile kasooritatud neerude või kuseteede operatsioon. Antud patsientide DNA-st amplifitseeriti koguGDNF-i geen koos 10 kb geenist eelneva alaga, mis seejärel sekveneeriti ühel rajal, kasutadesIllumina HiSeq2000 masinat (Milani jt., käsikiri koostamisel). Antud töö raames koostas autorteise põlvkonna sekveneerimise andmete põhjal võrdleva tulemuste tabeli leitudmutatsioonidest, mis esinesid patsientidel, kuid puudusid tervetel kontrollidel (n=16).25

2.3 Tulemused ja arutelu2.3.1 TulemusedSangeri sekveneerimisega leiti kokku 10 mutatsiooni eksonites, kaks mutatsiooni intronitesning 40 mutatsiooni ja üks deletsioon 3'UTR piirkonnas (tabel 5). Üldiselt esinesidmutatsioonid haigetest vaid üksikutel indiviididel ja väga vähestel või mitte ühelgi kontrollil.Kontrollidel esines vaid 12 leitud mutatsiooni. Eriti huvitav oli üks mutatsioon 900 bpkaugusel 3’UTR algusest, mis esines heterosügootsel kujul 51-l patsiendil, kuid puuduskontrollgrupis (n=21).Mutatsioonide seast leiti ka üks SNP, rs-koodiga rs45611434, mis on miRanda andmebaasipoolt ennustatud mikroRNA seondumiskoht (John, jt. 2004). Leitud mikroRNAseondumiskohana märgitud SNP-s olid mutatsioonid vaid haigetel. Kõigi leitud SNP-de jamutatsioonide kohta otsiti infot ka Ensembl ja NCBI dbSNP andmebaasidest, mille sagedusedon välja toodud ka tabelites 5 ja 6.Lisaks mutatsioonidele leiti 3'UTR piirkonnas polümorfset kolmenukleotiidset AGG kordust.Leitud AGG korduste arv näitas, et kuigi osade indiviidide proovid polnud terves alas kaetud,esines kõigil haigetel ja tervetel >15 kolmenukleotiidset kordust. Varasemates artiklites onnäidatud, et suur AGG korduste arv (>15 kordust) on kaitsvaks faktoriks skisofreenia eest(Michelato jt., 2004).Analüüsi tulemusena leiti 3’UTR piirkonnas enamikel haigetel ühe aluspaariga eraldatud kahenukleotiidi heterosügootne deletsioon. Leitud deletsioonid on andmebaasides märgitud kuikolme nukleotiidi polümorfismid või puudub üldse märge, et tegu oleks SNP-dega. Sangerimeetodiga sekveneerides mõlemalt DNA ahelalt selgus, et tegelikkuses on tegu kahedeletsiooniga, mis on eraldatud ühe aluspaariga ning, et mõlemad deletsioonid on omavahel100%-liselt aheldatud. Ensembl andmebaasis 7 on vastava deletsiooni kolm SNP märgitudjärgnevate rs-koodidega: rs146911618, rs35549586 ja rs141939066. Antud heterosügootnedeletsioon esines 42%-l haigetest, kuid ka 52%-l kontrollidest, kokku 44%-l uuritavatest.7http://www.ensembl.org26

Tabel 5: Sanger meetodiga leitud SNP-d ja mutatsioonid. Esile on toodud mutatsioonid, mison kinnitatud mõlemalt DNA ahelalt nii forward kui ka reverse praimerigaKromosoomipositsioonSNP idAsukoht1SNPalleelid(A/B)Mut.alleel (B)Haiged 2 Kontrollid 3 Haiged4Kontrollid5AA AB BB AA AB BB B% B%37840642 rs2075680 exon1 G/T T 78 12 0 3 2 0 7% 20%37840448 rs11747340 intron C/T T 81 9 0 3 3 0 5% 20% 9%37839633 rs2973033 exon2 A/G G 49 29 12 1 3 1 29% 50% 29%37835637 exon4 A/C C 89 1 0 5 0 0 1% 0%37835588 rs45455796 exon4 A/G G 86 4 0 5 0 0 2% 0% 3%37835515 rs138709472 exon4 C/G C 89 1 0 5 0 0 1% 0%37835479 rs143142348 exon4 A/G A 87 0 2 5 0 0 2% 0%37835133 exon5 G/- - 89 0 1 5 0 0 1% 0%37835017 rs149499929 intron A/G G 84 3 1 5 0 0 3% 0%37834872 exon5 A/C C 76 1 0 4 0 0 1% 0%37834760 exon5 C/G G 73 1 0 5 0 0 1% 0%37834648 exon5 C/T T 73 1 0 5 0 0 1% 0%37815737 3'UTR A/C C 68 6 0 19 2 0 4% 5%37815737 3'UTR C/T T 74 0 0 19 2 0 0% 5%37815660 rs45535335 3'UTR A/C/T C/T 72 0 2 21 0 0 3% 0%37815644 3'UTR A/C C 69 3 0 11 1 0 2% 4%37815641 3'UTR A/C C 68 4 0 11 0 0 3% 0%37815638 3'UTR A/C C 71 0 1 11 0 0 1% 0%37815634 3'UTR A/G G 69 3 0 10 1 0 2% 5%37815631 rs11952258 3'UTR A/G G 68 3 2 21 0 0 5% 0%37815629 3'UTR A/T T 31 21 0 8 10 0 20% 28%37815611 3'UTR A/T T 27 45 0 5 16 0 31% 38%37815547 3'UTR A/C C 70 2 0 21 0 0 1% 0%37815525 3'UTR A/G G 68 1 3 20 0 1 5% 5%37815390 rs45611434 3'UTR A/C/T C/T 72 1 1 21 0 0 2% 0%37815260 3'UTR C/T T 20 51 0 21 0 0 36% 0%37814396 3'UTR C/T T 72 0 1 21 0 0 1% 0%37814364 rs78613670 3'UTR A/G G 66 0 2 16 1 0 3% 3% 6%37814282 3'UTR A/T T 63 1 0 19 0 0 1% 0%37814259 3'UTR C/T T 67 0 1 19 0 0 1% 0%37814230 3'UTR A/G G 67 1 0 19 0 0 1% 0%37814183 3'UTR A/G G 67 1 0 19 0 0 1% 0%37814153 3'UTR C/A A 68 0 1 19 0 0 1% 0%37814148 rs3749692 3'UTR C/T C 32 31 11 4 9 2 36% 43% 45%37814114 3'UTR A/G G 57 1 0 18 0 0 1% 0%37814110 3'UTR C/G G 56 2 0 18 0 0 2% 0%37814102 3’UTR A/G G 47 12 2 11 3 0 15% 12%37814060 rs188617599 3'UTR G/T T 70 3 0 17 0 0 2% 0%37813999 3'UTR C/G G/T 71 1 0 21 0 0 1% 0%37813999 3'UTR C/G G 71 1 0 21 0 0 1% 0%37813991 3'UTR C/G G 71 1 0 21 0 0 1% 0%37813953 3'UTR A/G G 71 1 0 19 0 0 1% 0%37813953 3'UTR G/T T 71 1 0 19 0 0 1% 0%37813950 3'UTR C/G G 71 1 0 21 0 0 1% 0%37813949 3'UTR C/G G 70 1 0 21 0 0 1% 0%37813928 3'UTR C/T T 70 1 0 21 0 0 1% 0%37813903 3'UTR C/T T 70 2 0 21 0 0 1% 0%37813901 3'UTR C/T T 70 1 0 21 0 0 1% 0%37813863 3'UTR G/T T 70 1 0 21 0 0 1% 0%37813771 3'UTR G/T T 56 1 0 21 0 0 1% 0%37813497 3'UTR T/A A 69 0 1 20 0 0 1% 0%37812925 3'UTR T/- - 52 0 7 10 0 0 12% 0%37812925 3'UTR A/T T 48 5 0 10 9 0 5% 24%1) Mutatsiooni või SNP asukoht inimese genoomi versioon 37, hg19 järgi2) Erinevate genotüüpidega haigete indiviidide arv3) Erinevate genotüüpidega kontrollindiviidide arv4) Mutantse/minoorse alleeli sagedus haigete indiviidide seas5) Mutantse/minoorse alleeli sagedus kontrollindiviidide seas6) Minoorse alleeli sagedus HapMap CEU populatsioonis (dbSNP andmebaasi järgi)Teise põlvkonna sekveneerimismeetodiga leiti kokku 126 mutatsiooni, keskmiselt 34mutatsiooni indiviidi kohta. Keskendudes mutatsioonidele, mis esinesid ainult haigete seas,leidus viis mutatsiooni 5'UTR piirkonnas, kaks mutatsiooni eksonites, 14 mutatsiooniintronites ja kolm mutatsiooni 3'UTR piirkonnas (tabel 6). Sarnaselt Sangeri meetodigasekveneerides, esinesid NGS-i tulemustes uued mutatsioonid enamasti üksikutel indiviididel.MAF627

Tabel 6: NGS meetodiga leitud SNP-d ja mutatsioonid, mis esinesid ainult haigetelKromosoomipositsioonSNP id Asukoht 1 alleelidSNP(A/B)Mut.alleel(B)Haiged 2 Kontrollid 3 Haiged 4 Kontrollid 5 MAF 6AA AB BB AA AB BB B% B%37847158 rs74843650 5'UTR G/A A 14 2 0 16 0 0 6% 0%37845847 5'UTR A/C C 15 1 0 16 0 0 3% 0%37844895 rs79074117 5'UTR C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37843716 5'UTR G/A A 15 1 0 16 0 0 3% 0%37843464 rs114485991 5'UTR C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37840448 rs11747340 intron C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0% 9%37840248 intron C/A A 14 2 0 16 0 0 6% 0%37839074 rs192552463 intron G/T T 14 2 0 16 0 0 6% 0%37838956 intron A/C A 15 1 0 16 0 0 3% 0%37838922 rs114812377 exon4 G/A A 15 1 0 16 0 0 3% 0%37835588 rs45455796 exon4 A/G G 14 2 0 16 0 0 6% 0% 3%37835017 rs149499929 intron A/G G 14 2 0 16 0 0 6% 0%37833683 rs78899997 intron C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37832798 rs17386472 intron A/G A/G 15 1 0 16 0 0 3% 0%37831533 rs56000387 intron A/G G 15 1 0 16 0 0 3% 0%37824837 rs116214935 intron A/C C 15 1 0 16 0 0 3% 0%37821058 rs33984522 intron A/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37820741 rs62360373 intron C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37820603 rs116740766 intron C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37817034 rs62360371 intron A/G A 15 1 0 16 0 0 3% 0%37814765 rs79669773 3'UTR A/G G 15 1 0 16 0 0 3% 0%37814489 rs62360370 3'UTR C/T T 15 1 0 16 0 0 3% 0%37814364 rs78613670 3'UTR A/G G 14 2 0 16 0 0 6% 0% 6%1) Mutatsiooni või SNP asukoht inimese genoomi versioon 37, hg19 järgi2) Erinevate genotüüpidega haigete indiviidide arv3) Erinevate genotüüpidega kontrollindiviidide arv4) Mutantse/minoorse alleeli sagedus haigete indiviidide seas5) Mutantse/minoorse alleeli sagedus kontrollindiviidide seas6) Minoorse alleeli sagedus HapMap CEU populatsioonis (dbSNP andmebaasi järgi)Kokku identifitseeriti NGS ja Sangeri sekveneerimisega 7 ühist mutatsiooni, mis esinesidNGS tulemustes vaid haigetel. Võrreldes kahe erineva meetodiga leitud polümorfisme, olikuue mutatsiooni puhul 100% korrelatsiooni genotüüpide vahel. Ühe SNP (rs2973033) puhulandsid mitmed genotüübid erineva meetodiga erineva tulemuse ning nende andmete põhjal eiole võimalik otsustada kumb meetod annab korrektsema tulemuse. Seega tuleks andmeteõigsust kontrollida ka mõne genotüpiseerimismeetodiga.2.3.2 AruteluKirjanduses on teada, et GDNF geen on neerude arengus üheks tähtsamaks faktoriks ja etselle geeni puudumisel ilmnevad ka erinevad kaasasündinud neeru ja kuseteede anomaaliad,kuna organite areng pole täielik (Constatini, 2010). Varasemalt on uuritud ka GDNF/RETsignaalraja moodustuvates faktorites esinevate mutatsioonide mõjust erinevatele neeru ja28

kuseteede haigustele (Sanjay, 2009). Senimaani on leitud otsesed seosed vaid vähestehaigustega, näiteks Hirschsprungi sündroomiga ja probleemidega erinevates neeruarengustaadiumites.2009. aastal uuris Alessio Pini Prato koos oma meeskonnaga Hirschsprungi (HSCR) haiguseseoseid CAKUT-ga. Kokku uuriti 84 HSCR haige DNA-d. Kontrollgrupp sisaldas 27CAKUT-i haiget. Antud uuringus leiti 21-l HSCR haigel CAKUT-ga seotud hüpoplaasia, misosutus kõige sagedasemaks diagnoosiks. Kokku leiti viiel haigel RET mutatsioonid ja kolmelhaigel GDNF mutatsioonid. Katses toodi välja üks SNP rs koodiga rs2973033, mis tuvastatika käesolevas töös. C→T mutatsiooni puhul leiti, et haigetel esineb sagedamini minoorsetalleeli T (Prato jt., 2009). Ka siinses töös esines haigete seas sagedalt sama mutatsiooniminoorset alleeli, kuid võrreldes tervetega polnud sagedus piisavalt suur, et pidada sedaoluliseks. Vaatamata sellele leiti antud SNP puhul erinevused Sangeri ja NGSsekveneerimistulemustes, mis tähendab, et enne lõplike järelduste tegemist tuleks tulemusivalideerida.Lisaks eelpool nimetatud katsele viidi 2009. aastal läbi uuring, mille eesmärgiks oli leidaGDNF geeni variatsioonide seos neerude suuruse ja funktsiooniga tervetel Euroopa päritolugavastsündinutel. Katses toodi küll välja mitmed GDNF geeni SNP-d, mille minoorse alleelisagedus oli >5%, kuid ei leitud nende seost neerude suuruse vähenemisega (Zhang jt., 2009).Paar kuud pärast käesoleva töö eksperimentaalosa lõppemist viidi Jeanpierre ja temameeskonna poolt läbi uurimus, kus uuriti RET ja GDNF mutatsioone neeru ageneesi ja teistetõsiste neeru arengu defektidega loodetel. Uuringus kasutati 105 bilateraalsete defektidegaloodet. Katsetes analüüsiti GDNF geeni kodeerivaid järjestusi ja 3'UTR piirkonda. Uuringusei leitud ühtegi GDNF mutatsiooni, mis oleksid võinud olla peamisteks neeru arengudefektide tekkemehhanismideks (Jeanpierre jt., 2011).Kuna siiani pole avaldatud ühtegi mutatsiooni GDNF geenis, mis võiks olla kaasasündinudneeru ja kuseteede anomaaliate põhjustaja, tekkis huvi seda probleemi põhjalikumalt uurida.On teada, et GDNF geeni 3'UTR piirkonnas on mikroRNA-de seondumiskohad, mismõjutavad geeni ekspressioonitaset (Oh-hashi jt., 2012). Sellest tulenevalt tekkis küsimus, kasGDNF geeni 3'UTR piirkonnas olevate mikroRNA-de seondumiskohtades võivad ollamutatsioonid, mille tulemusena väheneb GDNF geeniekspressioonitase ning lõppkokkuvõttestekivad neerude ja kuseteede anomaaliad.29

Käesolevas töös kasutati erinevate neeruanomaaliatega indiviidide DNA proove Eestigeenivaramust, milles analüüsiti GDNF geeni, et leida mutatsioone, mis võiksid olla neerudeanomaalse arengu põhjustajateks.Üheks GDNF geeni ebanormaalse ekspressiooni põhjuseks võib olla töös leitud mutatsioon900 bp kaugusel 3'UTR algusest, mis esines heterosügootsel kujul vaid haigetel ning mitteühelgi kontrollil. Olgugi, et leitud mutatsioon on oma heterosügootse genotüübigapotentsiaalselt heaks kandidaadiks CAKUT-i tekitajana, pole siiski kindel, kas tegu onmutatsiooni või sekveneerimisveaga, kuna mutantne alleel leidus meie eksperimendis vaidühel ahelal. Leitud mutatsioon paikneb ka 7 C homopolümeeride jadas, mis võib tihtisekveneerimisel probleeme valmistada.Töö käigus leidsime ka palju teisi mutatsioone, millest sooviks välja tuua mutatsiooni 3'UTRpiirkonna mikroRNA-de seondumiskohas, mille esinemissagedus polnud küll suur, kuid misesines samuti vaid haigetel. Kuna tegu on mikroRNA seondumiskohaga, võib see leitudmutatsioon põhjustada muudatusi geeniekspressioonisAnalüüsi käigus leiti ka kahe nukleotiidi heterosügootne deletsioon 3'UTR piirkonnas. Kunavastava deletsiooni esinemissagedus oli suurem kontrollide seas, ei või kindlalt väita, et sellelon seos neeruanomaaliate tekkega ning seepärast peaks tulemuste kinnitamiseks veeltäiendavaid katseid läbi viima.Varasemalt on teada, et GDNF geeni 3’UTR piirkond on oluline neerude arengus ning sellepuudumisel tekivad erinevad neerude anomaaliad (Saarma, publitseerimata käsikiri). Kuigiantud töö tulemused näitavad, et haigetel esineb kontrollidega võrreldes kordades rohkemmutatsioone ning paljud neist potentsiaalselt olulistest mutatsioonidest paiknevad ka 3’UTRalas, tuleks neid siiski lähemalt uurida nii usaldusväärsuse kui ka funktsioonide suhtes.30

KokkuvõteKaasasündinud neeruanomaaliad on tihti laste varajase surma põhjuseks ning küllalt sagehaigus täiskasvanueas. Reeglina on kaasasündinud neeruanomaaliad põhjustatud mitme geenimuutuste poolt. Viimaste aastate jooksul on leitud seosed mitmete nefrogeneesis osalevategeenide mutatsioonide ja erinevate neeruanomaaliate vahel, sealhulgas seos CAKUT-ga.Selle töö eesmärgiks oli sekveneerida erinevate neeruanomaaliatega inimestel GDNF geenning leida GDNF geenis olevad muutused, mis võiksid olla neeruanomaaliate tekke ühekspõhjuseks. Selleks otsiti haigete DNA proovidest muutused, mis puuduksid või esineksväiksema sagedusega tervetel kontrollidel.Leitud andmetest võib välja tuua erinevad polümorfismid, mille minoorsete alleelideesinemissagedused haigetel erinesid veebipõhistes andmebaasides olevatega ning võivadseega olla anomaaliate tekke põhjusteks. Saadud tulemuste seas leidus ka üksikuid uusimutatsioone, mida pole mainitud avalikes andmebaasides, kuid mille esinemine haigete seasoli märkimisväärselt kõrge. Põhiliselt leiti üksikuid mutatsioone vaid haigetel ning needpaiknesid nii intronites, eksonites kui ka 3’UTR alas.3'UTR alguses vaid haigetel leitud mutatsioon on oma heterosügootse genotüübigapotentsiaalselt heaks kandidaadiks CAKUT-i tekitajana, kuid sellegipoolest ei selgunudanalüüsi käigus põhjus, miks leitud mutatsioon õnnestus detekteerida ainult ühes suunassekveneerides, aga mitte komplementaarselt ahelalt. Käesoleva töö põhjal võib oletada, etkuna haigetel leiti kontrollidega võrreldes rohkem mutatsioone GDNF geenis, on võimalikseos GDNF geeni ja neeruanomaaliate tekke vahel. Seda just põhjusel, et enamusmutatsioonidest paiknesid 3’UTR alas, mis on varasemast teada oluline piirkond neerudenormaalse arengu saavutamiseks. Sellegipoolest tuleks selle töö andmete valideerimiseks jamutatsioonide funktsioonide uurimiseks teha veel täiendavaid primaarstruktuuri analüüsiteiste meetoditega, et valideerida leitud mutatsioonid, mis annaksid aluse tuua mõned neistvälja kui haiguse põhjustajad..31

Sequencing and analysis of mutations in the GDNF gene inindividuals with congenital kidney anomaliesSummaryKidney anomalies and CAKUT (congenital anomalies of the kidney and urinary tract) arepolygenic diseases which are caused by mutations in many different genes. Recent studieshave shown that mutations in the GDNF gene, which is crucial in nefrogenesis, may be one ofmany to cause these kind of diseases. Still the studies carried out have not found the causativemutations responsible for the given diseases.The aim of this study was to find mutations which could be involved in causing congenitalkidney anomalies. In the study, 90 individuals diagnosed with CAKUT and 21 healthyindividuals were selected from the biobank of the Estonian Genome Center of the Universityof Tartu. DNA samples from the selected subjects were sequenced using traditional Sangersequencing, where DNA fragments were amplified by PCR, purified, and sent to the corefacility of the Estonian Biocentre.The sequence fragments were aligned to the reference GDNF sequence and analyzed usingthe Sequencher programme (GeneCodes, Inc). Aditionally, mutations called in the GDNFgene from sequences generated by long-range PCR and multiplexed second generationsequencing using the HiSeq2000 (Illumina) were analyzed. Both technologies revealed a fewSNPs with frequencies different from those in the NCBI dbSNP database, and several newmutations. The minor allele of several polymorphisms was more frequent in the cases. Thesingle mutations which occurred in more than 10 patients were located in exons, introns andthe 3’UTR.These findings may play a role in the development of CAKUT or other kidney anomalies.However, more research must be done to confirm these discoveries, the number of examinedsubjects should be increased, in order to make proper conclusions.32

TänusõnadEelkõige sooviksin tänada oma juhendajat Lili Milanit toetuse ja suure abi eest. Samutisooviksin tänada oma kaasjuhendajat professor Andres Metspalu, tänu kellele sain tegeleda niihuvitava uurimustööga.Lisaks tänan Mart Kalsi NGS tulemuste analüüsi eest ning biotehnoloogia õppetoolikollektiivi ja Heidi Saulepit.Tänusõnad lähevad ka Eesti Biokeskuse töötajatele, kes viisid läbi sekveneerimise.Viimaks soovin ära mainida oma perekonna ja lähedased, kes mind töö valmimisel toetasid.33

Kasutatud kirjandusAiraksinen, M.S., Saarma, M. (2002) The GDNF family: signalling, biological functions andtherapeutic value, Nat. Rev. Neurosci. 3(5):383-94Airavaara, M., Pletnikova, O., Doyle, M.E., Zhang, Y.E., Troncoso, J.C., Liu, Q.-R. (2011)Identification of Novel GDNF Isoforms and cis-Antisense GDNFOS Gene and TheirRegulation in Human Middle Temporal Gyrus of Alzheimer Disease, The Journal ofBiological Chemistry 286: 45093-45102Ansorge, W., Zimmermann, J., Schwager, C., Stegemann, J., Erfle, H., Voss, H. (1990) Onelabel, one tube, Sanger DNA sequencing in one and two lanes on a gel. Nucleic Acids Res.18(11):3419-3420Argüello, J.R., Little, A.-M., Pay, A.L., Gallardo, D., Rojas, I., Marsh, S.G.E., Goldman, J.M.,Madrigal, J.A. (1998) Mutation detection and typing of polymorphic loci through doublestrandconformation analysis, Nature Genetics 18: 192-194Balzer, S., Malde, K., Lanzen, A., Sharma, A., Jonassen, I. (2010) Characteristics of 454pyrosequencing data – enabling realistic simulation with flowsim, Bioinformatics 26(18):i420-i425Bennett, S. (2004) Solexa Ltd. Pharmacogenomics 5(4):433-8Bibikova, M., Le, J., Barnes, B., Saedinia-Melnyk, S., Zhou, L., Shen, R., Gunderson, K.L.(2009) Genome-wide DNA methylation profiling using Infinium ® assay.Epigenomics1(1):177-200Braslavsky, I., Hebert, B., Kartalov, E., Quake, S.R. (2002) Sequence information can beobtained from single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA 100(7):3960-3964Chang, H.-W., Cheng, Y.-H., Chuang, L.Y., Yang, C.-H. (2010) SNP-RFLP 2: an updated andintegrated PCR-RFLP tool for SNP genotyping BMC Bioinformatics 11:173Constantini, F. (2010) GDNF/Ret signaling and renal branching morphogenesis Frommesenchymal signals to epithelial cell behaviors, Organogenesis 6(4): 252-262Grimm, L., Holinski-Feder, E., Teodoridis, J., Scheffer, B., Schindelhauer, D., Meitinger, T.,Ueffing, M. (1998) Analysis of the Human GDNF Gene Reveals an Inducible Promoter,Three Exons, a Triplet Repeat Within the 3'-UTR and Alternative Splice Products. Hum. Mol.Genet. 7(12): 1873-1886Altshuler, D., Daly, M.J., Lander, E.S. (2008) Genetic mapping in human disease. Science322(5903):881-8Hahn H., (2010) Genetics of kidney development: pathogenesis of renal anomalies. Korean JPediatr. 53(7): 729–734.Hildebrandt, F. (2010) Genetic kidney diseases. The Lancet, 375(9722): 1287-1295Hsu, T.M., Law, S.M., Duan, S., Neri, B.P., Kwok, P.-Y. (2001) Genotyping Single-NucleotidePolymorphisms by the Invader Assay with Dual-Color Fluorescence PolarizationDetection.Clinical Chemistry, 47(8): 1373-137734

Janitz, M., 2008. Next-generation genome sequencing: towards personalized medicine. 1 st ed.,p.3-6. Wiley-VCH, New JerseyJeanpierre, C., Mace, G., Parisot, M., Moriniere, V., Pawtowsky, A., Benabou, M., Martinovic,J., Amiel, J., Attie-Bitach, T., Delezoide, A.-L., Loget, P., Blanchet, P., Gaillard, D., Gonzales,M., Carpentier, W., Nitschke, P., Tores, F., Heidet, L., Antignac, C., Salomon, R., SocieteFrancaise de Foetopathologie (2011) RET and GDNF mutations are rare in fetuses with renalagenesis or other severe kidney development defects. J.Med.Genet. 48(7):497-504Jing, S., Wen, D., Yu, Y., Holst, P.L., Luo, Y., Fang, M., Tamir, R., Antonio, L., Hu, Z.,Cupples, R., Louis, J.-C., Hu, S., Altrock, B.W., Fox, G.M. (1996) GDNF-Induced Activationof the Ret Protein Tyrosine Kinase Is Mediated by GDNFR-α, a Novel Receptor for GDNF.Cell 85:1113-1124John, B., Enright, A.J., Aravin, A., Tuschl, T., Sander, C., Marks, D.S. (2004) HumanMicroRNA targets. PloS Biol.2(11):e363Li, Q., Yeung, E.W. (1995) Simple Two-Color Base-Calling Schemes for DNA SequenchingBased on Standard Four-Label Sanger Chemistry. Applied Spectroscopy 49(10):1528-1533Lin, L.F., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S., Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell linederivedneurotrophic factor for misbrain dopaminergic neurons. Science 260(5111):1130-1132Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. (2011) dbNSFP: A Lightweight Database of HumanNonsynonymous SNPs and Their Functional Predictions. Human Mutation 32(8): 894-899Mardis, E.R. (2008) The impact of next-generation sequencing technology on genetics.Trends Genet. 24(3): 133-41Margulies, M., Egholm, M., Altman, W.E., Attiya, S., Bader, J.S., Bemben, L.A., Berka, J.,Braveman, M.S., Chen, Y.J., Chen, Z, Dewell, S.B., Du, L., Fierro, J.M., Gomes, X.V.,Godwin, B.C., He, W., Helgesem, S., Ho, C.H., Irzyk, G.P., Jando, S.C., Alenquer, M.L.,Jarvie, T.P., Jirage, K.B., Kim, J.B., Knight, J.R., Lanza, J.R., Leamon, J.H., Lefkowitz, S.M.,Lei, M., Li, J., Lohman, K.L., Lu, H., Makhijani, V.B., McDade, K.E., McKenna, M.P.,Myers, E.W., Nickerson, E., Nobile, J.R., Plant, R., Puc, B.P., Ronan, M.T., Roth, G.T., Sarkis,G.J., Simons, J.F., Simpson, J.W., Srinivasan, M., Tartaro, K.R., Tomasz, A., Vogt, K.A.,Volkmer, G.A., Wang, S.H., Wang, Y., Weiner, M.P., Yu, P., Begley, R.F., Rothberg, J.M.(2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature437(7057):376-80Michelato, A., Bonvicini, C., Ventriglia, M., Scassellati, C., Randazzo, R., Bignotti, S.,Beneduce, R., Riva, M.A., Gennarelli, M. (2004) 3'UTR (AGG)n repeat of glial cell linederivedneurotrophic factor (GDNF) gene polymorphism in schizophrenia. NeuroscienceLetters 3(11):235-237Michos O., Cebrian C., Hyink D., Grieshammer U., Williams L., D'Agati V., Licht J.D.,Martin G.R., Costantini F. (2010) Kidney development in the absence of Gdnf and Spry1requires Fgf10. PloS Genet. 15;6(1):e1000809Mitra, R.D., Shendure, J., Olejnik, J., Edyta-Krzymanska-Olejnik, Church, G.M. (2003)Sluorescent in situ sequencing on polymerase colonies. Anal Biochem 320(1):55-65Moritz K.M., Bertram J.F., Caruana G. (2008) Factors influencing mammalian kidneydevelopment:implications for health in adult life. Adv Anat Embryol Cell Biol. 196:1-7835

Morozova, O., Marra, M. A. (2008) Applications of next-generation sequencing technologiesin functional genomics. Genomics 92(5): 255-264Myakishev, M.V., Khripin, Y., Hu, S., Hamer, D.H. (2001) High-Throughput SNP Genotypingby Allele-Specific PCR with Universal Energy-Transfer-Labeled Primers Genome Res.11:163-169Nyren, P., Pettersson, B., Uhlen, M. (1993) Solid phase DNA minisequencing by anenzymatic luminometric inorganic pyrophosphate detection assay. Anal Biochem.208(1):171-5Oh-hashi, K., Hirata, Y., Kiuchi, K. (2012) Characterization of 3'-untranslated region of themouse GDNF gene. BMC Mol Biol. 13:2Ondov, B.D., Varadarajan, A., Passalacqua, K.D., Bergman, N.H. Efficient mapping ofApplied Biosystems SOLiD sequence data to a reference genome for functional genomicapplications. Bioinformatics 24(23):2776-2777Prato, A., Musso, M., Ceccherini, I., Mattioli, G., Giunta, C., Ghiggeri G.M., Jasonni, V.(2009) Hirschsprung Disease and Congenital Anomalies of the Kidney and Urinary Tract(CAKUT): A Novel Syndromic Association. Medicine 88(2): 83-90Rickert, A.M., Borodina, T.A., Eckehard, K.J., Lehrach, H., Sperling, S. (2004) Refinement ofsingle-nucleotide polymorphism genotyping methods on human genomic DNA: amplifluorallele-specific polymerase chain reaction versus ligation detection reaction – TaqMan.Analytical Biochemistry 330(2): 288-297Read, A., Strachan, T. 2010. Human Molecular Genetics, 4 th ed., p.406, 416-421. GarlandScience, New YorkRonaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. (1996) Real-Time DNASequencing Using Detection of Pyrophosphate Release. Analytical Biochemistry 242(1):84-89Rozen, S., Skaletsky, H. (2000). Primer3 on the WWW for general users and for biologistprogrammers. Methods Mol Biol. 132: 365-386.Sainio, K., Suvanto, P., Davies, J., Wartiovaara, J., Wartiovaara, K., Saarma, M., Arumäe, U.,Meng, X., Lindahl, M., Pachnis, V., Sariola, H. (1997) Glial-cell-line-derived neurotrophicfactor is required for bud initiation from ureteric epithelium. Development 124: 4077-4087Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. 74(12): 5463-5467Sanjay, J. (2009) The many faces of RET dysfunction in kidney. Organogenesis 5(4): 95-108Saisawat, P., Tasic, V., Vega-Warner, V., Kehinde, E.O., Günther, B., Airik, R., Innis, J.,W.,Hoskins, B.E., Hoefele, J., Otto, E.A., Hildebrandt, F. (2012) Identification of two novelCAKUT-causing genes by massively parallel exon resequencing of candidate genes inpatients with unilateral renal agenesis. Kidney International, 81: 196-200Saxen, L., Sariola, H. (1986) Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology 1(3):385-392Schadt, E.E., Turner, S., Kasarskis, A. (2010) A window into third-generation sequencing.36

Hum. Mol. Genet. 19(R2):R227-40Schindelhauer, D., Schuffenhauer, S., Gasser, T., Steinkasserer, A., Meitinger, T. (1995) Thegene coding for glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) maps to chromosome5p12-p13.1. Genomics 28:605-607Shen, G.-Q., Abdullah, K.G., Wang, Q.K. (2009) The TaqMan Method for SNP Genotyping.Methods in Molecular Biology 578(6): 293-306Shendure, J., Ji, H. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26(10):1135-45Shendure, J., Porreca, G.J., Reppas, N.B., Lin, X., McCutcheon, J.P., Rosebaum, A.M., Wang,M.D., Zhang, K., Miltra, R.D., Church, G.M. (2005) Accurate multiplex polony sequencing ofan evolved bacterial genome. Science 309(5741):1728-32Shoemaker, R., Deng, J., Wang, W., Zhang, K. (2010) Allele-specific methylation is prevalentand is contributed by CpG-SNPs in the human genome. Genome Res. 20(7):883-9Snustad, P. D., Simmons, M. J., 2008. Principles of Genetics, 5 th ed., p.349. John Wiley &Sons, New JerseySong R., Yosypiv I.V. (2010) Genetics of congenital anomalies of the kidney and urinary tract.Pediatr Nephrol. 26(3): 353-364Steemers, F.J., Gunderson, K.L. (2005) Whole genome genotyping technologies on theBeadArray platform. Pharmacogenomics. 6(7):777-82Syvänen, A.-C. (2005) Toward genome-wide SNP genotyping Nature Genetics 37, S5-S10Zhang, Z., Quinlan, J., Grote, D., Lemire, M., Hudson, T., Benjamin, A., Roy, A., Pascuet, E.,Goodyer, M., Raju, C., Houghton, F., Bouchard, M., Goodyer, P. (2009) Common variants ofthe glial cell-derived neurotrophic factor gene do not influence kidney size of the healthynewborn. Pediatr. Nephrol. 24:1151-1157Tsuchihashi, Z., Dracopoli, N.C. (2002) Progress in high throughput SNP genotypingmethods. The Pharmacogenomics Journal 2: 103-110Vize P.D., Woolf A.S., Bard J.B.L., 2003. The kidney: from normal development to congenitaldisease, p.108-118. Academic Press, San DiegoWinnick, E., (2004) DNA sequencing Industry Sets its Sights on the Future New technologiesmay duke it out with upgrades of the current method. The Scientist, 18(18):44Yegnasubramanian, S., Isaacs, W.B., 2010. Modern Molecular Biology: Approaches forUnbiased Discovery in Cancer Research, 1 st ed., p.21-23. Springer-Verlag, New YorkYoshimura, M., Nakamura, S., Ogawa, H., (2005) TaqMan Real-Time PCR QuantificationConventional and Modified Methods. Methods in Molecular Medicine, 108(3): 189-19837

Kasutatud veebiaadressidhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/http://www.scripps.edu/florida/technologies/genomics/genotyping.htmlhttp://454.com/products/gs-flx-system/index.asphttp://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-nextgeneration-sequencing.htmlhttp://www.illumina.com/systems/hiseq_systems.ilmnhttp://www.ensembl.comhttp://www.microrna.org/microrna/home.dohttp://www.finnzymes.com/pdf/pcr_rflp_phusion_blood_app_protocol.pdf38

LisadPCR-i jaoks kasutati praimeritepaarist sõltuvalt kolme erinevat tsüklit.Tabel 7: Praimeritepaari 1, 2 ja 5 jaoks kasutatud PCR-i programmTemperatuur (ºC) Aeg Korduste arvAlgne denaturatsioon 94ºC 1 minDenaturatsioon 94ºC 10 sPraimerite seondumine 62ºC 30 s10xPraimerite ekstensioon 72ºC 50 sDenaturatsioon 94ºC 10 sPraimerite seondumine 60ºC 30 s25xPraimerite ekstensioon 72ºC 50 sLõpp-ekstensioon 72ºC 7 minTabel 8: 3. praimeripaari jaoks kasutatud PCR-i programmTemperatuur (ºC) Aeg Korduste arvAlgne denaturatsioon 94ºC 1 minDenaturatsioon 94ºC 30 sPraimerite seondumine 64ºC 30 s10xPraimerite ekstensioon 72ºC 1,30 minDenaturatsioon 94ºC 10 sPraimerite seondumine 60ºC 30 s25xPraimerite ekstensioon 72ºC 1,30 minLõpp-ekstensioon 72ºC 10 minTabel 9: 4. praimeripaari jaoks kasutatud PCR-i programmTemperatuur (ºC) Aeg Korduste arvAlgne denaturatsioon 94ºC 1 minDenaturatsioon 94ºC 10 sPraimerite seondumine 64ºC 30 s10xPraimerite ekstensioon 72ºC 50 sDenaturatsioon 84ºC 10 sPraimerite seondumine 60ºC 30 s25xPraimerite ekstensioon 72ºC 50 sLõpp-ekstensioon 72ºC 7 min39