GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüs ...

1.6.3 PCR-i vabad genotüpiseerimismeetodidEnamus SNP-de genotüpiseerimismeetodeid tuginevad SNP-sid sisaldavate genoomseteregioonide eelamplifikatsioonile polümeraasahelreaktsiooni (PCR) abil. PCR-i tehnoloogiateareng on genoomsetes analüüsides, sealhulgas genotüpiseerimises suuri muutusi toonud,muutes spetsiifilised genoomsed piirkonnad järeleandlikeks otsestele biokeemilisteleavastustele (Tsuchihashi ja Dracopoli, 2002).Üheks PCR-i vabaks genotüpiseerimismeetodiks on Invader meetod Third Wave Technologiespoolt. Invader meetodit võib kombineerida PCR-ga, et kahandada DNA hulga nõuet, mismuudab lisaks vähesele materjalile ka signaali viimistletumaks. See meetod põhinebnukleotiidispetsiifilisel lõhustumisel struktuurispetsiifilise endonukleaasi poolt. Sellereaktsiooni kombineerimine fluorestsents resonantsenergiaga kannab üle oligonukleotiididekassette, tekitades nii kõrgelt alleelspetsiifilise signaali (Tsuchihashi ja Dracopoli, 2002).1.6.4 SNP-de analüüs Illumina Infinium® tehnoloogiagaPraegu on maailmas kõige laialdasemalt kasutusel Illumina Infinium kiibid DNA proovideülgenoomseks genotüpiseerimiseks (Steemers ja Gunderson, 2007). Ühe kiibi peal onvõimalik korraga analüüsida sadu tuhandeid kuni mõned miljonid SNP-d. DNA proovidamplifitseeritakse juhuslikult üle genoomi (whole genome amplification), fragmenteeritakse,ja hübridiseeritakse seejärel kiibile, kus asuvad kohtspetsiifilised oligonukleotiidid.Oligonukleotiidid hübridiseerivad SNP-le eelnevale alale, ja pikendatakse ühe märgistatudnukleotiidi (ddNTP) võrra.1.7 Genotüüp-fenotüüp seos põhjuslike mutatsioonidegaHaigusi tekitavate geenivariantide identifitseerimine tugineb haiguse fenotüübile.Genotüpiseerimist kasutatakse haigusele altide geenide identifitseerimiseks populatsioonides.See võib olla geeni funktsiooni identifitseerimise esimeseks sammuks. Et toetada geeniiseloomustamist, on vaja kasutada kiiremaid ja efektiivsemaid genotüpiseerimismeetodeid(Altshuler jt., 2008).Ühe geeni häire haiguste puhul, mida teatakse ka monogeensete haiguste nime all, on haigusepõhjustajaks mutatsioon ainsas geenis. Polügeensete häirete puhul on haiguse tekitamiseksvaja mutatsioone mitmes geenis.20