GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüs ...
GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüs ...
GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüs ...
- No tags were found...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
1.5 DNA <strong>sekveneerimine</strong>1.5.1 Sangeri meetodSekveneerimise tehnoloogia on muutnud kaasaegset bioloogiat, tagades bioloogilistesüsteemide kirjelduste <strong>ja</strong>oks täpsed tööriistad. See tegevusala on kiiresti liikunud võimenikombineerida fenotüübi andmeid DNA järjestusega <strong>ja</strong> seega liita üheselt väiksemadki DNAmuutused [nt ühenukleotiidi polümorfismid (SNP-d)] bioloogiliste fenotüüpidega. Seevõimaldab jälgida nukleiinhapete poolt juhitud protsessidega fundamentaalse elu kulgu ainsasrakus või koguni keerulistes eukarüootsetes organismides (Janitz, 2008).Klassikaline Sangeri sekveneerimismeetod sisaldab üheahelalise DNA sekveneerimistmärklaudspetsiifiliste praimerite, DNA polümeraasi (Sequenase),desoksüribonukleotiididtrifosfaatidega (dNTP) <strong>ja</strong> ahelat termineerivate märgistatuddidesoksüribonukleotiidtrifosfaatidega (ddNTP) (Sanger jt., 1977). Sõltuvaltsekveneerimismasinast võib Sangeri meetodi puhul varieeruda kasutatavatefluorestsentsvärvide <strong>ja</strong> elektroforeesi radade arv. Kui sekveneerimismasinal puudub spektrieristamisvõime, tuleb elektroforeesi puhul kasutada nel<strong>ja</strong> erinevat rada iga DNA molekuli<strong>ja</strong>oks (Ansorge jt., 1990). Kui aga kasutatakse nel<strong>ja</strong> erinevat fluorestsentsvärvi, võib radadearvu kahandada üheni. Kuna ühe fluorestsentsvärvi kasutamise korral ei ole võimalikerinevaid nukleotiide värvi järgi eristada, tuleb elektroforeesil kasutada nel<strong>ja</strong> erinevat rada,mille abil oleks võimalik määrata nukleotiidide järjestus. Siiski pole see meetodi vägamõistlik, kuna geeli kapillaarsus pole igas osas alati sama. Kõige sagedamini kasutatakseSangeri sekveneerimisel nel<strong>ja</strong> erinevat fluorestsentsvärvi ning ühte elektroforeesi rada. Sellepeamiseks kasutamise põhjuseks on suur läbilaskevõime <strong>ja</strong> väga täpne nukleotiidide järjestusemääramine ka pikkade DNA proovide puhul. Sellegipoolest nõuab nel<strong>ja</strong> erineva värvikasutamine ulatuslikke optilisi komponente, et sorteerida värve. Mõningatel juhtudel on tarviska mitmed ergastamisallikad, et efektiivselt ergastada fluorestsentsvärve (Li <strong>ja</strong> Yeung, 1995).12
Change language