GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analüüs ...

odavalt terve genoomi järjestuse määramise, mis omakorda võimaldab avastada mutatsiooneja ka genotüpiseerida polümorfisme. Lisaks on teise põlvkonna sekvenaatoritega võimalikideaalselt uurida geenide transkriptsiooni regulatsiooni, kas sekveneerides otse RNA-d (shväiksemat mittekodeerivat RNA-d) või kaardistada transkriptsioonifaktorite seondumistkromatiinide immunosadestamise abil (Mardis, 2008).Viimase kuue aasta jooksul on kättesaadavaks muutunud mitmed paralleelsed DNAsekveneerimismeetodid, mis on vähendanud DNA sekveneerimise hinda ja võimaldanudgenoomi mahuga proove sekveneerida ka üksikute laborite poolt. Need uued tehnoloogiadarenevad väga kiiresti, luues järjestuste raamatukogusid ning arendades andmeanalüüsi. Teisepõlvkonna DNA sekveneerimisel on potentsiaalne võime kiirendada uuringuid biolooga jabiomeditsiini aladel, võimaldades üldisel genoomide analüüsil, transkriptidel jainteraktoomidel muutuda odavamaks, rutiinseks ja laialt levinuks (Shendure ja Ji, 2008).Teise põlvkonna sekveneerimistehnoloogiate arenguga on intensiivistunud ka konkurentsvastavate tehnoloogiate arenguga tegelevate firmade vahel. 454 Life Technologies (Marguliesjt., 2005), hiljem omandatud Roche'i poolt, oli esimene firma, mis andis välja NGS platvormi.Solexa (Bennett, 2004), mis nüüd on Illumina üks osa, andis välja järgmise platvormi, misomandati Agencourtilt. Helicos oli esimene firma, mis väljastas üksiku molekulisekveneerimise (Braslavsky jt., 2002) NGS platvormi, mida nüüd mitmed firmad kasutavad,sealhulgas Complete Genomics, Pacific Biosciences ja Ion Torrents.Praeguseks on olemas ka kolmanda põlvkonna sekveneerimismeetod „Oxford Nanopore“, mispõhineb ühe molekuli sekveneerimisel (Schadt jt., 2010). DNA sekveneerimise alternatiivsedstrateegiad võib grupeerida erinevatesse kategooriatesse. Need kategooriad oleksid:mikroelektroforeesi meetodid, sekveneerimine hübridisatsiooniga, reaal-aja üksikutemolekulide jälgimine ja tsüklilise rea sekveneerimine (Shendure ja Ji, 2008).1.5.2.1 Illumina/SolexaIllumina/Solexa sekveneerimismeetodit (Bennett, 2004) kasutatakse hetkel kõige rohkem teisepõlvkonna meetoditest. Illumina raamatukogud ehitatakse mõnesaja aluspaari pikkusteadapterkülgnevate fragmentide segust, mis saadakse DNA juhusliku fragmenteerimise teel võiPCR-i reaktsioonil. Amplifitseerimine on läbi viidud kiibil nn PCR silla abil. Selliselähenemisega on nii forward kui ka reverse PCR-i praimerid kinnitatud paindliku adapterigatahkele kandjale nii, et kõik DNA koopiad (amplikonid) jääksid amplifikatsiooni käigusimmobiliseerituks kindlale asukohale. Amplifikatsiooni käigus painduvad üheahelalised DNAfragmendid, ühenduvad komplementaarsele adapterile ning moodustavad „silla“ (joonis 5).Lõpptulemusena saadakse mitu miljonit klastrit, millest igaüks sisaldab umbes tuhat kloonitud14