GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analÃ¼Ã¼s ...

More documents

Recommendations

Info

Joonis 5 (a) 454 ja SOLiD kasutavad emulsiooni PCR-i, mis sisaldab amplifitseerimisel pärlitekasutamist. Iga pärl kannab oma pinnal DNA fragmentide koopiaid. (b) Solexa tehnoloogia kasutabamplifitseerimisel „silla“ põhimõtet. Iga klaster sisaldab lõpptulemusena ligikaudu tuhat koopiat(Shendure ja Ji, 2008)1.5.2.4 Teise generatsiooni sekveneerimistehnoloogiate eelisedTavapärase sekveneerimise (nt Sanger) rakendus on muutunud väga mitmekesiseks. Väikeseskaalaga projektide jaoks, mille suurused varieeruvad kilo-aluspaaridest mega-aluspaarideni,jäävad tavapärased sekveneerimistehnoloogiad üheks valikuks ka tulevikus (Shendure ja Ji,2008). Paraku on praegusel hetkel teise põlvkonna tehnoloogiad hakanud asendama tuntudSanger meetodit just oma odavuse ja suure läbilaskevõime poolest (tabel 1) (Morozova jaMarra, 2008). Seepärast jäävadki ilmselt suuremahulised projektid tuginema enamjaolt uuteletehnoloogiatele. Seda on näidanud ka fakt, et Venteri genoomi sekveneerimiseks kasutatitraditsioonilist Sangeri meetodit, kuid Watsoni genoom sekveneeriti juba 454pürosekveneerimismeetodiga. Kuigi teise põlvkonna sekvenaatorid toodavad kokkuvõtteslühemaid järjestusi, on nende kasutamine suuremates projektides odavam ja kiirem kuiesimese põlvkonna tehnoloogiate kasutamine (Shendure ja Ji, 2008).Tabel 1: Erinevate teise põlvkonna sekveneerimismeetodite võrdlus. 123Tehnoloogia/MeetodLähenemisviisMaksimaalnelugemispikkusAluspaari katsekohtaAutomatiseeritudSangerSüntees märgistatudterminaatorite juuresolekul900 bp 96 kb454/Roche Pürosekveneerimine tahke toega 700 bp 700 MbIllumina/SolexaABI/SOLiDSekveneerimine sünteesiga koos„pööratavate“ terminaatoritegaMassiivne paralleelnesekveneerimine ligeerimisega150 bp 600 Gb75 bp 300 Gb1 http://www.illumina.com/systems/hiseq_systems.ilmn2 http://454.com/products/gs-flx-system/index.asp3 http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generationsequencing.html16
1.6 SNP-de genotüpiseerimineDNA sekveneerimise tulemusena on leitud hulgaliselt ühenukleotiidseid polümorfisme(SNP-d), mis on muutused ühes aluspaaris genoomi kindlas positsioonis. SNP-sid on leitudinimese genoomis umbes iga 100-300 aluspaari järel ning definitsiooni järgi on nendeesinemissagedus (alleelisagedus) populatsioonis >1%. SNP-d on genoomis kõigesagedasemalt leitud polümorfismid ning neid on kasutatud ka keeruliste geneetiliste tunnusteuurimiseks (Hsu jt., 2001). SNP-d on olnud abiks selgitamaks tavaliste, keeruliste haigustegeneetilist tausta. Koos analüüsi astmetega on oluline ka haiguste funktsionaalneennustamine, et prioriseerida mittesünonüümsed SNP-d edasiseks analüüsiks. (Liu jt., 2011).Vaatamata sekveneerimistehnoloogiate edenemisele ja terve genoomi või eksoomisekveneerimise hinna langusele, on need meetodid siiski väga kallid ja seega pole suure hulgaindiviidide genoomide sekveneerimine veel mõeldav paljudele laboritele. Selle pärast onmõistlik sekveneerida mõned väga hästi iseloomustatud patsiendid ja seejärel leitudmutatsioonide sageduse määramine mõne genotüpiseerimismeetodiga suuremas hulgaspatsientides ning tervetel indiviididel.Konkreetse genotüpiseerimisprojekti jaoks valitav meetod sõltub SNP-de arvust ja DNAproovide hulgast, mida genotüpiseeritakse. Terve genoomi või suuremõõdulise projekti jaoks,kus uuritakse ülegenoomselt leiduvaid SNP-sid, on ideaalsed Affymetrix SNP GeneChip jaIllumina Infinium BeadChips analüüsid. Väikese hulga SNP-de ja suure DNA proovidehulgaga kasutatakse tavaliselt TaqMan analüüsi, kuna see tehnoloogia on suureläbilaskevõimega, väga täpne, kiire ja odav (Shen jt., 2009).Enamus SNP-de genotüpiseerimismeetodeid on liiga aeglased ja kallid, et neid rutiinseltsuurtes, sadade SNP-de ja suure hulga DNA proovidega ühendatud uuringutes kasutada.Sellegipoolest on SNP-de genotüpiseerimistehnoloogiad väga kiiresti arenenud ning selletulemusena on täiustatud vanu meetodeid ning esile on kerkinud ka kiiremad ja odavamadmeetodid (Syvänen, 2005).1.6.1 Taqmani meetod SNP-de genotüpiseerimiseksTaqMan reaalaja polümeraasahelreaktsioon on tundlik ja usaldusväärne meetod, midakasutatakse laialdaselt üle maailma. Ometi on selle meetodi võimetus viia läbi analüüseväikese hulga DNA proovidega selle suurimaks piiranguks (Yoshimura jt., 2005). TaqManSNP genotüpiseerimisanalüüsi nimetatakse ka 5' nukleaasi alleelse eristamise analüüsiks ningvajab nii forward ja reverse PCR praimereid kui ka kahe erineva märgistusega TaqManväikese soone sidumisindikaatoreid (MGB, ingl k minor groove binder) (Rickert jt.2004).17
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOLLOODUS- JA TEHNOLOOGI
Page 3 and 4: Kasutatud lühendidATPbpCAKUTGDNFGD
Page 5 and 6: 1. Kirjanduse ülevaade1.1 Neerude
Page 7 and 8: vastastikune signaliseerimine võim
Page 9 and 10: eguleerimisel üle 3'UTR piirkonna
Page 11 and 12: tulemusel ei sünteesita mRNA-lt en
Page 13 and 14: Joonis 4 Sangeri meetod (Winnick, 2
Page 15: fragmenti. Seejärel blokeeritakse
Page 19 and 20: 1.6.2.2 PCR-RFLPPCR-i restriktsioon
Page 21 and 22: Tabel 2: Geneetilise põhjuslikkuse
Page 23 and 24: Tabel 3: Polümeraas ahelreaktsioon
Page 25 and 26: 2.2.4 GDNF-i sekveneerimine teise p
Page 27 and 28: Tabel 5: Sanger meetodiga leitud SN
Page 29 and 30: kuseteede haigustele (Sanjay, 2009)
Page 31 and 32: KokkuvõteKaasasündinud neeruanoma
Page 33 and 34: TänusõnadEelkõige sooviksin tän
Page 35 and 36: Janitz, M., 2008. Next-generation g
Page 37 and 38: Hum. Mol. Genet. 19(R2):R227-40Schi
Page 39: LisadPCR-i jaoks kasutati praimerit

GDNF geeni sekveneerimine ja mutatsioonide analÃ¼Ã¼s ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?