Inimese embrüonaalsete tüvirakkude kasvatamine maatriksitel ning ...

3. hESC-de koekultuuris kasvatamine
3.1. hESC-de toiterakkudel kasvatamine
3.1.1 hESC-de hiire embrüonaalsetel fibroblastidel kasvatamine
1998. aastal loodi esimesed inimese embrüonaalsete tüvirakkude liinid: Thomson jt.
õnnestus 14-st blastotsüsti staadiumis oleva embrüo sisemisest rakumassist kasvatada MEFdel*,
mille rakutsükkel oli mitoosis peatatud, viis tüvirakuliini (H1, H7, H9, H13, H14). Nad
kasutasid söötmena DMEM-i (ilma bFGF-ta), millele oli lisatud 20% veise loote seerumit
(foetal bovine serum, ingl. k., FBS). Nendes rakkudes ekspresseerusid pluripotentsusmarkerid
SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 ja Tra-1-81 ning neil oli kõrge fosfataasi ja telomeraasi aktiivsus
ning stabiilne karüotüüp. 4-5 kuu pärast olid need rakud suutelised moodustama kõigi kolme
lootelehe rakke ja tootma koorioni gonadotropiini. Reubinoff jt. kordasid seda katset 2000.
aastal ning said samasugusel toitekihil ja söötmes embrüo sisemise rakumassi rakkudest kaks
hESC rakuliini: HES1 ja HES2. Mõlemad töörühmad täheldasid, et hESC-d vajavad
pluripotentsuse säilitamiseks MEF-de maatriksit ning hESC-d erinevalt mESC-dest ei
ekspresseeri pinnamarkerit SSEA-1. Park jt. (2003) näitasid. et inimese embrüonaalseid
tüvirakke saab lisaks hiire primaarsetele fibroblastidele, mida kasutasid Thomson ja
Reubinoff, kasvatada ka STO-rakuliinil. STO-rakuliin on saadud SIM hiireliini (Sandos
Inbred Mice, ingl. k., SIM) embrüonaalsetest fibroblastidest. PMEF-de (Primary Mouse
Embryonic Fibroblasts, primaarsed hiire embrüonaalsed fibroblastid, ingl.k) kasutamine
kätkeb endas ohtu kanda hESC-dele edasi viirusi, mükoplasmasid ja seeni. Erinevalt STOrakkudest
on PMEF-de jagunemine piiratud, mistõttu neid tuleb korduvalt hiire embrüotest
eraldada, ja passeerimiste arvu suurenedes väheneb nende võime toetada hESC-de
pluripotentsust. 2009. aastal said Camarasa jt. veel kolm hiire embrüonaalsete fibroblastide
liini, millest tehtud toitekihil säilus kuue hESC liini pluripotentsus.
*Nii MEF-de, PMEF-de kui ka kõigi teiste rakkude, mida toitekihina kasutatakse, rakujagunemine tuleb peatada mitoosis
enne kui neil kasvatada embrüonaalseid tüvirakke. Selleks kasutatakse γ-kiirgust või töötlust mitomütsiin C-ga. Kiiritamine
tekitab DNA-ahelatesse katked, samas kui mitomütsiin tekitab CpG-järjestusspetsiifilisi sildu.
3.1.2. hESC-de inimese rakkudel kasvatamine
3.1.2.1. hESC-de inimese fibroblastidel kasvatamine
Richards jt. (2002) olid esimesed, kes kasvatasid hESC-sid inimesest pärit
toiterakkudel. Seejuures katsetasid nad toitekihina fibroblaste, mis pärinesid kas
embrüonaalsest lihaskoest, embrüonaalsest nahast või täiskasvanud inimese munajuha
epiteelkoest. Fibroblaste kasvatati tingimustes, kus puudusid ksenogeensed molekulid.
22