Inimese embrüonaalsete tüvirakkude kasvatamine maatriksitel ning ...

Rakke pildistati kasvatamise käigus faaskontrastmikroskoobiga Nikon Diaphot ja Olympus
DP/70 kaameraga.
4.4. Immunofluorestsents (IF)
Inimese embrüonaalsete tüvirakkude liini H9 rakud fikseeriti 4% PFA-ga (15 min) ja
permeabiliseeriti PBS-s, milles oli 0,2% Triton X100 (10 min). Blokeerimiseks kasutati PBSi,
mis sisaldas 1% BSA-d, 0,05% Tween20-t ja 0,1% saponiini. Blokeerimine kestis sõltuvalt
katsest 0,5-1 tundi. Primaarse ja sekundaarse antikehaga ning DAPI-ga inkubeerimised viidi
läbi parafilmil 35 µl-tes tilkades suletud kambris. Antikeha lahjendused tehti
blokeerimislahuseses ja DAPI lahjendati suhtega 1:1000 PBS-s. Rakke inkubeeriti antikeha
lahustes 0,5-1h ja DAPI-ga (Sigma) 15 min. Rakupreparaadid sulustati sulustussegusse
(Dako, Taani). Kõik etapid viidi läbi toatemperatuuril ja kõigi etappide vahel pesti rakke kolm
korda PBS-ga. Preparaate analüüsiti konfokaalmikroskoobiga (Olympus IX81, programm
FV10-ASW 1.6., Jaapan).
Kasutatud antikehad: nimi, (firma), kasutatud lahjendus/konts
1) Primaarsed
a. Oct3/4 hiire monoklonaalne IgG2b (Santa Cruz) 1:50
b. Nanog küüliku polüklonaalne IgG (Santa Cruz) 1:50
c. Küüliku polüklonaalne IgG (Abcam) 1:50
d. Hiire IgG2b (Santa Cruz) 4:50
e. Hiire IgG (Santa Cruz) 1:100
f. Lm111 vastane seerum (Abcam) 1:1000
g. 3H2 – laminiini α4 subühiku vastane hiire IgG 8 µg/ml
h. 4B12 – laminiini α5 subühiku vastane hiire IgG 6 µg/ml
2) Sekundaarsed
a. Alexa Fluor 488 kana küülikuvastane IgG (Invitrogen) 1:200
b. Alexa Fluor 647 kitse hiirevastane IgG F(ab`)2 fragment (Invitrogen) 1:200
c. Alexa Fluor 647 kana hiirevastane IgG2b (Invitrogen) 1:200
32