Susanna Tamman

estriktsioonifragmentidesse. Selle meetodi abil on võimalik analüüsidarestriktsioonifragmente PCR-il, omamata eelteadmisi DNA järjestuse kohta. Ka võimaldabsee meetod paljude erinevate restriktsioonifragmentide samaaegset amplifikatsiooni (Vos jt.,1995).AFLP analüüsiks kasutatakse tavaliselt kahte restriktaasi, millest üks lõikab keskmiseja teine kõrge sagedusega. Adapterid, mis restriktsioonifragmentidele lisatakse, disainitaksenii, et ligeerimisel ei saa taastekkida restriktsioonisaiti. See võimaldab restriktsiooni jaligeerimist läbi viia üheaegselt (Vos jt., 1995).Praimerid, mis PCR-il kasutatakse, on adapteritele spetsiifilised, kuid nende 3’ otsason ühe kuni kolme nukleotiidi pikkune lisa, mistõttu on restriktsioonifragmentideamplifikatsioon selektiivne (Vos jt., 1995).Saadud fragmendid eraldatakse elektroforeesil polüakrüülamiidgeelil. Selliselmeetodil saadud mustrid võimaldavad eristada bakteritüvesid, kuna saadud fragmentidepikkust ja hulka mõjutavad kolme tüüpi mutatsioonid bakteri genoomis:1) mutatsioonid restriktaaside lõikesaitides;2) mutatsioonid piirkondades, mis külgnevad restriktsioonisaitidega ning onkomplementaarsed praimerite pikendustega;3) restriktsioonifragmentide sisesed insertsioonid ja deletsioonid.AFLP on võrreldes teiste PCR-põhinevate meetoditega, nagu näiteks RFPL ja RAPD,paremini korratav, sest PCR-il kasutatav praimerite seondumistemperatuur on teistemeetoditega võrreldes tunduvalt kõrgem, suurendades seega spetsiifilisust (Savelkoul jt.,1999).Eristamisvõime on AFLP analüüsil väga hea, sest analüüsiks kasutatakse bakterigenoomi kogu ulatuses. Tänu kasutatavate praimerite disainile on meetod tundlikmutatsioonidele restriktsioonisaitides, restriktsioonisaitidele järgnevates nukleotiidides ninginsertsioonidele ja deletsioonidele restriktsioonisatide vahele jäävates piirkondades (Savelkouljt., 1999).AFLP läbiviimiseks on vaja ainult väike hulk DNA-d, mis peab küll olema puhas jakaheahelaline, kuid mille kindel kontsentratsioon ei avalda eriti mõju lõpptulemustele. Sellemeetodi ainsaks suuremaks miinuseks on restriktsioonifragmentide arv, mis tõstab külleristamisvõimet, kuid raskendab tulemuste analüüsi. (Savelkoul jt., 1999).15