Echerichia coli kasvu heterogeensus ja toksiin-antitoksiini süsteemid

Söötmetele oli sõltuvalt tüvest plasmiidi selektiivsuse tagamiseks lisatud, kas kanamütsiin (Kan)lõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml, CAM lõppkontsentratsiooniga 25 µg/ml, või ampitsilliini(Amp) lõppkontsentratsiooniga 100 µg/ml. Osad tüved vajasid kasvamiseks ka tümiinilõppkontsentratsiooniga 50 µg/ml või DAPi (diaminopimeelhape) lõppkontsentratsiooniga 75µg/ml.2.1.3. TransformatsioonBakterite transformatsiooniks kompetentseks tegemiseks ja plasmiidide bakteritessetransformeerimiseks kasutati Douglas Hanahani kirjeldatud metoodikat (Hanahan, 1983). Rakudsulatati jääl ning neile lisati plasmiidi ja lasti jääl 30 min seista. Sellele järgnes kuumašokk 1minut ja 30 sekundit temperatuuril 42°C ja kiire jahutamine jääl. Lisati 1 ml LB söödet ninginkubeeriti tund 37°C juures. Kultuur plaaditi tardsöötmele.2.1.4. ElektroporatsioonBakterid külvati üleöö tardsöötmele 37°C juurde kasvama. Kõik elektroporatsioonil kasutatudlahused ja bakterid hoiti jääl. Hommikul lisati 1 ml 10% glütserooli lahusele Milli-Q veeskülvinõela otsa täis bakterikultuuri. Rakke pesti 3x 10% glütserooliga, tsentrifuugides neid üksminut 13500 rpm. Rakud suspendeeriti 40 µl 10% glütseroolis ja lisati plasmiidi. Bakteri japlasmiidi lahust elektroporeeriti kasutades Bio-Rad GenePulser Xcell-i. Elektroporatsioonilkasutati režiimi, kus elektroodide vahe oli 2 mm, mahtuvus 25 µF ning voolutugevus 2,5 kV.Pärast elektroporeerimist lisati segu 1 ml LB vedelsöötmesse ja inkubeeriti 1h 37°C juures.Rakususpensioon plaaditi ja inkubeeriti üleöö.2.1.5. DNA eraldamine ja kloneeriminePlasmiidi eraldamiseks transformeeriti see kompetentsetesse NOVA-XG rakkudesse. Rakkekasvatati üleöö 37°C juures LB vedelsöötmes ning plasmiidi eraldamiseks kasutati Invisorb SpinPlasmid Mini Two Kiti.GFP-d sünteesiva geeni viimine plasmiidi pAH162 teostati kahes etapis. Kloneerimiseks kasutatistandartset metoodikat. Kõik kasutatavad ensüümid ja puhvrid pärinesid firmalt Fermentas. Kõikpuhvrid olid reaktsioonisegus ühekordsed.18