Echerichia coli kasvu heterogeensus ja toksiin-antitoksiini süsteemid

Elektroporatsioonil kasutati režiimi, kus elektroodide vahe oli 2 mm, mahtuvus 25 µF ningvoolutugevus oli 2,5 kV. Pärast elektroporeerimist lisati segu 1 ml SOB vedelsöötmesse, missisaldab 0,2% glükoosi ja inkubeeriti 1 h 37°C juures ning siis veel pool tundi 42°C juures.Elektroporatsiooni produkt plaaditi LB Tet (tetratsükliin) 8 µg/ml tassile ja inkubeeriti üleöö37°C juures.Konstrukte kontrolliti GFP ekspressiooni järgi voolutsütomeetril BD LSR II.2.1.7. HipA külmatundliku tüve HM22 kasvu uurimine.Rakke kasvatati üleöö 3 ml LB 37°C juures. Üleöökultuurist tehti 100x lahjendused 3 ml LBsöötmesse. Peale 2 h 37°C juures kasvatamist lisati IPTG (isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiid)lõppkontsentratsiooniga 1 mM ja inkubeeriti veel 1,5 h samal temperatuuril. Võeti 1 ml kultuurining tsentrifuugiti 2 minutit 10000 rpm toatemperatuuril. Rakke pesti 1 ml LB-ga (jälletsentrifuugiti 2 min 10000 rpm toatemperatuuril). Bakterid resuspendeeriti 1 ml LB ja see lisati20 ml LB-le. Rakke kasvatati 2 h temeratuuril 30°C ja siis 3 h temperatuuril 37°C. Alatesbakterite 30°C juurde viimisest võeti iga poole tunni tagant proove. Samuti võeti iga poole tunnitagant 1 ml kultuuri spektrofotomeetril Heλiosβ OD600 juures kasvu jälgimiseks. Katse tehtikolmes korduses.2.1.8. Külma-ja kuumatundlike E.coli mutantide kasvu uurimine.Üheteistkümnesse kuuma-või külmatundlikusse E. coli tüvesse elektroporeeriti punktis 2.1.4.kirjeldatud metoodika alusel pET-gfpmut2 plasmiid. Osasid tüvesid polnud võimalikelektroporeerida ja neisse viidi plasmiid transformatsiooniga. Bakteritüvede PS265, PS266 jaM54 transforamtsioon viidi läbi punktis 2.1.3. kirjeldatud protokolli järgi.Bakterite kasvu uurisimiseks kasutati punktis 2.1.7. toodud protokolli mõningate erinevustega.Kuumatundlikke tüvesid hoiti tund 42°C juures ja külmatundlikke tund 30°C juures ja siisinkubeeriti neid temperatuuril 37°C . Proove võeti vastavalt 0 min, 60 min, 150 min ja 240 minajapunktides, kus nullajapunktiks oli bakterite inkubeerimise alustamine, kas 30 või 42°C juures.20