Genotüübi mõju NK rakkude käitumisele rakukultuuris

2. MATERJAL JA METOODIKA2.1 NK rakkude kogumineTöös kasutatud lümfotsüüdid pärinevad Utrechti Ülikooli haiglast ja Tartu ÜlikooliHematoloogia ja Onkoloogia Kliiniku Hematoloogia ja Luuüdi Transplantatsiooni osakonnast.Utrechti Ülikooli haigla rakud saadi kahekümne kaheksa terve omavahel suguluses mitte olevadoonori perifeersest verest. Eelnevalt oli doonor informeeritud vastavalt Utrechti Ülikoolieetikakomisjoni nõuetele. Tartu Ülikooli Kliinikumi rakud olid saadud ühe terve doonoriperifeersest verest vastavalt Tartu Ülikooli Inimuuringute Eetika Komiteelt saadud nõusolekule(151/101; 21.08.2006).Utrechti Ülikooli doonorite HLA-A, -B ja -C tüpiseerimise andmed saadi sekveneerimiseabil, kasutades SBTexcellator kiti koos SBTengine tarkvaraga (Genome Diagnostics, Utrecht,Holland). HLA-C epitoobi analüüs tehti Q-PCR analüüsi abil. KIR genotüübid olid määratud SSP(Sequence Specific Priming) analüüsi abil. Doonorite HLA ja KIR andmed on esitatud tabelis 1.Tartu Ülikooli doonori kohta ei ole HLA ja KIR tüpiseerimise andmeid veel teada.2.1.1 LümfopreparatsioonKõikide doonorite perifeerse vere mononukleaarsed rakud eraldati täisverestgradienttsentrifuugimisega lümfopreparatsioonil Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences)kiti abil. Täisveri (25 ml) segati võrdses mahus DPBS-ga (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY,USA). Lahjendatud veri (50 ml) lisati ettevaatlikult kahte 15 ml tuubi Ficoll-Paque kihile vältidessegunemist. Peale tsentrifuugimist (400×g, 30 minutit, 18°C) aspireeriti ettevaatlikultmoodustunud lümfotsüütide kiht seroloogilise pipetiga. Seejärel pesti rakke kaks korda DPBS-gaja külmutati krüoviaalides 10-20×10 6 kaupa.30