Genotüübi mõju NK rakkude käitumisele rakukultuuris

eristades neid rakufragmentidest, seejärel reguleeriti erinevate kanalite voltaažid. Salvestati10000-20000 elusa raku andmed.Tsütotoksilisuse analüüsi proovide sisselugemiseks kasutati BD LSRII kõrgeläbilaskevõimega lugejat, mis võimaldab analüüsida proove otse mikrotiiterplaadilt. Esmaltdefineeriti SSC versus FSC dotplotil rakkude piirkond R1 (rakud) eristamaks neidrakufragmentidest ja prügist (Joonis 4A). Edaspidi defineeriti 7-AAD versus CFSE dotplotilefektorrakkude populatsioon (R4), kasutades selleks värvimata efektorrakkude kontrollproovi(Joonis 4D). R4 piirkonnast jäeti välja 7-AAD positiivsed surnud efektorrakud. Märklaudrakkudepiirkonna (R2) defineerimiseks 7-AAD versus CFSE dotplotil analüüsiti CFSE ja 7-AAD-gavärvitud märklaudrakke (ilma efektorrakkudeta kontrollproov) (Joonis 4B). R3 –permeabiliseerunud märklaudrakkude piirkonna leidmiseks analüüsiti TritonX-100-lüüsitudmärklaudrakke (Joonis 4C). Mõlemad piironnad võeti piisavalt kitsad, et välistadarakufragmentide sattumine anlüüsipiirkonda. 7-AAD-ga värvitud märklaudrakkude anlüüsimiselarvestati sellega, et permeabeliseeritud rakkude populatsioon võib olla 7-AAD teljel kaheosaline(Joonis 3). Analüüsi täpsuse huvides salvestati igast proovist andmeid 10000-20000 raku kohta.Joonisel 2 on kujutatud ühe tsütotoksilise reaktisooni 7-AAD versus CFSE näidis dotplot ningselle statistilised andmed.ABJoonis 3: Tsütotoksilisuse reaktsiooni analüüs. 7-AAD versus CFSE dotplot (A) ningpopulatsioonide hierarhia ja väärtused (B).36