Genotüübi mõju NK rakkude käitumisele rakukultuuris

Töös kasutatud antikehad olid ostetud BD Biosciences Pharmigen, San Jose, CA, USA.Ühe proovi jaoks võeti ligikaudu 100000 rakku, tsentrifuugiti eppendorfi põhja (500×g 5minutit), pesti kaks korda DPBS-ga, resuspendeeriti 20 µl 0,1% inimese albumiini sisaldusegaDPBS-s ning lisati 1µl igat antikeha. Seejärel segati proovid Vortex`il ning inkubeeriti jääl 20-30minutit. Seondumata antikehade eemaldamiseks pesti rakud kaks korda DPBS-ga, resuspendeeritiseejärel 50-100 µl DPBS-s ning hoiti enne analüüsimist jääl.2.7 Tsütotoksilisuse reaktsioonide ettevalmistusDoonori NK rakkude aktiivsust analüüsiti kuue kasvaja rakuliini vastu: K562, Namalwa,LCL 721.221- HLA negatiivse rakuliini ning kolme erineva HLA-C grupi alleeligatransfekteeritud LCL 721.221 rakuliini. Nende rakuliinide kasutamine võimaldas hinnata NKrakkude aktiivsuse sõltuvust nende KIR molekulidest ja märklaudrakkude pinnal olevatest MHCklass I ligandidest.Doonorrakkude (edaspidi efektorrakud) ja kasvajarakkude (edaspidi märklaudrakud) suhevarieerus vahemikus 12:1 kuni 0,5:1.Rakukultuuri plaadil olevad doonorrakudrakud suspendeeriti hoolikalt ning seejärel loetiBürkeri hematotsütomeetris (Brand GMBH, Wertheim, Saksamaa). Vajalik kogusrakususpensiooni (~ 4 miljonit rakku) koguti tuubi ja tsentrifuugiti põhja 500×g 5 minutit. Rakudresuspendeeriti RPMI 1640 söötmes tihedusega 1×10 6 /ml ning hoiti enne kasutamist jääl.Märklaudrakud suspendeeriti, loeti ning vajalik hulk (300000-400000 rakku) tõsteti tuubi.Peale tsentrifuugimist (500×g 5 minutit) resuspendeeriti rakud 1 ml RPMI 1640 söötmes.Märklaudrakkude värvimiseks kasutati CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit (MolecularProbes, Leiden, Holland). RPMI 1640 söötmes resuspendeeritud rakkudele lisati CFSE lahustlõppkontsentratsioonini 1 µM ning inkubeeriti temperatuuril 37°C 15 minutit. Seejäreltsentrifuugiti rakud põhja (500×g 5 minutit) ning seondumata CFSE eemaldamiseks pesti kakskorda RPMI 1640 söötmes, misjärel tsentrifuugiti rakud uuesti põhja ja resuspendeeriti RPMI1640 söötmes tihedusega 1×10 6 /ml. Proove hoiti enne kasutamist jääl.Tsütotoksilisuse reaktsioonid segati kokku 96 kaevuga V-kujulise põhja ristlõikegamikrotiiter plaadil (Deltalab S.L., Barcelona, Hispaania). Enamikes reaktsioonides jäetimärklaudrakkude hulk konstantseks (10000 rakku) ning muudeti efektorrakkude hulka(vahemikus 10000-120000 rakku), välja arvatud väga madala efektor/märklaudrakkude suhtegareaktsioonid, kus suurendati märklaudrakkude hulka. Esimesena kanti plaadile märklaudrakud,34