Genotüübi mõju NK rakkude käitumisele rakukultuuris

2.2.2 KrüopreservatsioonUtrechti Ülikooli haiglas eraldatud lümfotsüüdid külmutati vitaalselt: 0,5 ml RPMI 1640söötmes (25mM HEPES ja l-glutamiin sisaldusega) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0,01%penitsilliin/streptomütsiini manulusel, üles võetud rakkudekle lisati vahetult enne külmutamist0,5 ml segu, mis koosnes RPMI 1640 söötmest, 40% termotöödeldud (56°C, 1 tund)vasikaseerumist (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY, USA) ja 20% dimetüülsulfoksiidist(AppliChem, Darmstadt, Saksamaa). Külmutatud rakke säilitati vedellämmastikus kunikasutamiseni.Tartu Ülikooli Hematoloogia ja Onkoloogia kliiniku rakud külmutati 0,5 ml 20% inimeseseerumi albumiinis (HSA; Octapharma, Wien, Austria), kuhu oli lisatud 0,5 ml 20%dimetüülsulfoksiidi sisaldusega 20%-list inimese seerumi albumiini. Rakke säilitati temperatuuril-150°C.2.2 Inimese seerumSöötmesse lisatav inimese seerum eraldati Tartu Ülikooli Kliinikumi Verekeskuseskogutud AB reesuspositiivse veregrupiga meessoost doonori verest. Vere hüübimiseks hoiti ilmaantikoagulandita kogutud täisverd 4 tundi temperatuuril 37°C. Seejärel hüübimata osa aspireeritija tsentrifuugiti (4000×g, 30 minutit, 4°C). Eraldatud seerum jagati 15 ml polüpropüleenisttuubidesse (BD labware Europe, Maylan Cedex, Prantsusmaa) 10 ml kaupa ja säilitatitemperatuuril -20°C. Enne kasutamist seerum sulatati ja säilitati temperatuuril 4°C.2.3 Kasutatud rakuliinidKäesolevas töös kasutati NK rakkude tsütotoksilise aktiivsuse testimiseks kuut erinevatrakuliini:1) K562 (HLA-C negatiivne) – inimese erütroleukeemia rakuliin, mis pärineb rakupangastAmerican Type Culture Collection2) Namalwa (HLA-C*07) – inimese lümfoblastoidne Epstein-Barr`i viirust kandevviiruspartikleid mitte tootev rakuliin, mis on saadud Burkitti lümfoomist (pärineb rakupangastAmerican Type Culture Collection)3) LCL 721.221-wt (HLA-C negatiivne) – inimese B-lümfoblastoidne rakuliin4) kolme erinevate HLA-C alleelelidega transfekteeritud LCL 721.221 rakuliini: LCL 721.221-Cw*0401 (IHW03096), 721.221-Cw*1202 (IHW03093) ja 721.221-Cw*1403 (IHW03094).