Marit Orav

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR-JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

MIKROBIOLOOGIA JA VIROLOOGIA ÕPPETOOL 

Marit Orav 

Tüvirakkude kasutamise võimalusi inimese papilloomiviiruse 

uurimisel 

Bakalaureusetöö 

Juhendaja PhD Ene Ustav 

Tartu 2008

SISUKOKKUVÕTE 

Sisukokkuvõte...........................................................................................................................2 

Kasutatud lühendid ..................................................................................................................3 

Sissejuhatus ...............................................................................................................................5 

1. Inimese papilloomiviiruse ja raku interaktsioonid ...........................................................6 

1.1 Inimese papilloomiviirus ..................................................................................................6 

1.2 HPV ja haigused ...............................................................................................................6 

1.3 HPV nakatab naha- ja limasepiteeli keratinotsüüte..........................................................8 

1.3.1 Naha ehitus ja naharakkude diferentseerumisprotsess ..............................................8 

1.3.2 HPV replikatsiooni- ja elutsükli seos epiteelirakkude diferentseerumisprogrammiga 

............................................................................................................................................9 

2. Tüvirakud ja inimese papilloomiviirus ............................................................................13 

2.1 Tüvirakud .......................................................................................................................13 

2.1.1 Embrüonaalsed tüvirakud........................................................................................13 

2.1.2 Koespetsiifilised tüvirakud......................................................................................14 

2.1.3 Indutseeritud pluripotentsed rakud (iPS rakud).......................................................15 

2.1.4 Terapeutiline kloonimine.........................................................................................16 

2.2 Naha tüvirakud ...............................................................................................................16 

2.3 Tüvirakkude osa naha- ja limaskesta koevigastuste parandamises ................................20 

2.4 Koeparandamise ja HPV infektsiooni seos ....................................................................22 

2.5 Tüvirakkude osa papilloomiviiruste indutseeritud kartsinogeneesis..............................22 

3. Tüvirakkude diferentseerumise suunamine. Sissejuhatus .............................................24 

3.1 Embrüonaalsete tüvirakkude diferentseerimine .............................................................26 

3.2 Koespetsiifiliste tüvirakkude diferentseerimine .............................................................27 

3.3 Tüvirakkude kultiveerimise eeldused.............................................................................27 

3.4 Tüvirakkude diferentseerimise suunamise etapid...........................................................28 

4. Tüvirakkude diferentseerumise suunamise strateegiad .................................................28 

4.1 Keratinotsüüdideks diferentseerumisele pühendumise indutseerimine..........................28 

4.1.1 Kindla koostisega keskkonna kasutamine ...............................................................28 

4.1.2 Geneetiline modulatsioon........................................................................................29 

4.2 Pühendunud eellasrakkude selekteerimine ja sorteerimine............................................29 

4.3 Pühendunud eellasrakkude lõpliku diferentseerumise indutseerimine...........................30 

4.3.1 Kindla koostisega keskkonna kasutamine ...............................................................30 

4.3.2 Ekstratsellulaarse maatriksi kasutamine..................................................................31 

4.3.3 Ko-kultuuride kasutamine .......................................................................................32 

4.3.4 Gap-ühenduste moodustumise soodustamine..........................................................33 

4.3.5 Tsütoplasmaatiliste ekstraktide kasutamine ja cybridization ..................................34 

4.3.6 Muud diferentseerumist soodustavad tegurid..........................................................34 

Kokkuvõte ...............................................................................................................................35 

Résumé.....................................................................................................................................36 

Kirjanduse loetelu ..................................................................................................................37 

Kasutatud veebiaadressid ......................................................................................................42 

2

KASUTATUD LÜHENDID 

(h)ESC – (inimese) embrüonaalsed tüvirakud (human embryonic stem cells) 

2D – kahemõõtmeline (two-dimensional) 

3D – kolmemõõtmeline (three-dimensional) 

BMP – bone morphogenetic protein 

BMP-4 – bone morphogenetic protein-4 

E1-7 – papilloomiviiruse varajased valgud 

ECM – rakuväline maatriks (extracellular matrix) 

EGF – epidermaalne kasvufaktor (epidermal growth factor) 

FACS – fluorescence-activated cell sorting 

FGF – fibroblast growth factor 

GAG – glükoosaminoglükaan (glycosaminoglycan) 

GATA-3 - transkriptsioonifaktor 

GFP – green fluorescent protein 

HPV – inimese papilloomiviirus (human papillomavirus) 

HSP – heat shock protein 

ICM – sisemine rakumass (inner cell mass) 

IF – intermediaalsed filamendid 

IGF – insuliini-sarnane kasvufaktor (insuline-like growth factor) 

iPS rakud – indutseeritud pluripotentsed tüvirakud (induced pluripotent stem cells) 

K1, K5, K10, K14 – keratiini tüübid 

KFG – keratinocyte growth factor 

L1-2 – papilloomiviiruse hilised valgud 

Lef1 – lymphoid-enhancing factor 1 

MACS – magnetic affinity cell sorting 

PML kehad – viiruse arvatavad replikatsioonitsentrid 

PPAR – peroxisome proliferator-activated retseptor 

PV – papilloomiviirus (papillomavirus) 

Shh – Sonic hedgehog 

Tap63 – transkriptsioonifaktor p63 

Tcf3 – transcription factor 3 

TGF – transformeeriv kasvufaktori (transforming growth factor) 

TGFβ – transformeeriv kasvufaktor-β (transforming growth factor) 

URR – upstream regulatory region 

UV-B – B ultraviolettkiirgus 

3

Wnt – wingless 

4

SISSEJUHATUS 

Inimese papilloomiviirused (HPVd) on maailmas laialt levinud olulised patogeenid, mis 

nakatavad organismi epiteelkoe keratinotsüüte ja põhjustavad emakakaelvähi, 

genitaalpiirkonna soolatüügaste ja healoomuliste papilloomide teket. 

Seoses papilloomiviiruste elu- ja replikatsioonitsükli seotusega epiteelkoe rakkude 

diferentseerumisprogrammiga, on neid koekultuuri tingimustes keeruline uurida. Tänapäeval 

on HPV uurimisel enim levinud viiruspartiklite ekstraktis inkubeeritud epiteelkoe siirdamine 

immuunpuudulikele hiirtele või organotüüpsete parvkultuuride kasutamine. 

Kuna püsiva infektsiooni tekkimiseks peaks HPV nakatama nahas leiduvaid tüvirakke, oleks 

väga kasulik, kui papilloomiviirusi saaks uurida keratinotsüütide diferentseerumisrada läbima 

indutseeritud tüvirakkudes. Selline mudel järgiks ehk tõelähedasemalt in vivo 

papilloomiviiruse infektsiooniga kaasnevat olukorda ja oleks alternatiiviks juba 

olemasolevatele mudelitele. 

Tüvirakkude kasutamist papilloomiviiruste uurimisel koekultuuri tingimustes soodustab ka 

asjaolu, et tüvirakud on võimelised oma populatsiooni pidevalt uuendama, sel ajal kui 

organotüüpsetes parvkultuurides kasutatavad rakud tuleb eelnevalt immortaliseerida. 

Antud töö toob välja seosed inimese papilloomiviiruse infektsiooni ja naha tüvirakkude vahel 

ning tutvustab erinevaid meetodeid, mille abil saaks tüvirakke suunata keratinotsüütideks 

diferentseeruma. 

5

TÜVIRAKKUDE KASUTAMISE VÕIMALUSI INIMESE PAPILLOOMIVIIRUSTE 

UURIMISEL 

1. INIMESE PAPILLOOMIVIIRUSE JA RAKU INTERAKTSIOONID 

1.1 Inimese papilloomiviirus 

Papilloomiviirused (PV) on väikese kaheahelalise DNA genoomiga viirused, mis nakatavad 

peamiselt epiteelkudesid. PVd on mitmekesine viiruste rühm, neid on leitud enam kui 

kahekümnelt imetajate liigilt ning nad võivad nakatada ka linde ja roomajaid. Inimese 

papilloomiviirused (HPVd) jagatakse nukleotiidse järjestushomoloogia alusel kolme 

evolutsioonilisse rühma: A supergruppi kuuluvad sugulisel teel ülekantavad 

papilloomiviirused nagu HPV-16 ja HPV-18, mis võivad tekitada onkogeense potentsiaaliga 

limaskudede haavandeid, tavalisi soolatüükaid või healoomulisi papilloome. B supergrupi 

liikmed (nagu HPV-5) tekitavad tavaliselt asümptomaatilisi või latentseid infektsioone, kuid 

immuunpuudulikel või spetsiifilist pärilikku eelsoodumust omavatel indiviididel võivad 

tekitada nahavähki. Ülejäänud papilloomiviirused kuuluvad E supergruppi ning tekitavad 

naha papilloome ja soolatüükaid (Doorbar, 2004). Onkogeense potentsiaali järgi jagatakse 

papilloomiviirusi kõrge ja madala riski viirusteks. Kõige levinumad kõrge riski 

papilloomiviirused on HPV-16 ja -18. Madala riskigrupi viirustest on sagedasemad HPV-6 ja 

-11. Kokku on kirjeldatud üle 100 erineva HPV tüübi, millest ligikaudu 30 nakatavad 

genitaaltrakti (Klug S.J. , 2007). 

1.2 HPV ja haigused 

On tõestatud, et kõrgriski inimese papilloomiviirused põhjustavad emakakaelavähki. HPV 

DNAd on leitud 90-100%-st emakakaelavähi koeproovidest, sel ajal kui tervetelt patsientidelt 

võetud proovidest esineb seda vaid 5-20%-l. Kõige sagedamini tuvastatakse proovidest HPV- 

16 (50%) ja HPV-18 (10%) genoomset materjali, kuid ka tüüpe -31, -33, -35, -45, -51, -52, - 

58 ja -59 tuleks pidada inimesele kartsinogeenseks (Bosch F.X. jt, 2002). Need harvad 

emakakaelavähi juhud, kus ei ole tuvastatud HPV osalust, on seletatavad tavaliste vähitekke 

protsesside toimumisega epiteelkoes ning esinevad üldjuhul väga vanadel naistel. 

Emakakaelas esineb väikese sagedusega ka mitte-epiteelse vähi juhtumeid. 

6

Vähi arenemine on seotud HPV poolt ekspresseeritavate onkogeenide E6 ja E7 võimega 

interakteeruda ja modifitseerida või lagundada rakutsükli tähtsaid regulatoorseid komponente. 

E6 valk seob ning degradeerib peremeesraku p53 valku, takistades niiviisi viimase apoptoosi. 

p53 on seotud ka rakule oluliste kontrollmehhanismidega, mis aitavad vältida geneetilise 

materjali kahjustusi. Valgu inaktiveerimine võib viia mutatsioonide kuhjumiseni rakus ning 

aidata veelgi kaasa vähitekke protsessidele. Samuti aktiveerib E6 telomeraasi, mis osaleb 

peremeesraku immortaliseerumisel. E7 seob pRB valku, mille tagajärjel vabanevad E2F 

transkriptsioonifaktorid, mis on olulised peremehe ja viiruse genoomse DNA sünteesi 

regulatsioonil. Samuti seob ja aktiveerib E7 rakutsüklit kontrollivaid tsükliini komplekse. 

Emakakaelavähi koeproovidest ilmneb, et nakatatud rakus on viiruse genoomne DNA tihti 

raku kromosomaalsesse DNAsse integreerunud. Sageli on see toimunud viisil, mille käigus 

E6 ja E7 valgu repressorvalk E2 on inaktiveerunud, mistõttu on võimalik mõlema onkogeense 

valgu üleekspressioon. 

Vähitekke protsess on tavaliselt pikaajaline ja enne haigestumist on naised aastaid või isegi 

aastakümneid HPV infektsiooni kandjad. Samuti on hakanud üha enam kogunema 

tõestusmaterjali inimese papilloomiviiruste seotusest teiste suguteedes esinevate vähkide 

tekkega (Bosch F.X. jt, 2002). 

Genitaalpiirkonna soolatüükaid seostatakse enamasti madala riski HPVdega, samas on 

peaaegu kõikidel papilloomiviirustel võime neid tekitada (Bosch F.X. jt, 2002). 

2005. aasta andmetel oli Ameerika Ühendriikides 10%-l populatsioonist aktiivne HPV 

nakkus, 4%-l oli nakkus, mis põhjustas tsütoloogilisi ebanormaalsusi, ja veel lisaks 1%-l 

tekitas HPV genitaalpiirkonna soolatüükaid. Aastaga lisandub ligikaudu 6.3 miljonit uut 

nakkusjuhtu, kuid kuna papilloomiviiruse infektsioon on tihti asümptomaatiline, jääb enamus 

neist tuvastamata. Samuti tuleb immuunsüsteem HPV infektsiooni tõrjumisega tavaliselt 

piisavalt hästi toime. Hinnanguliselt ligikaudu 50% seksuaalselt aktiivsetest indiviididest 

puutuvad oma elu mingil perioodil inimese papilloomiviirusega kokku. Häid ravimeetodeid 

soolatüügaste või emakakaela kahjustuste raviks ei ole – kuigi kahjustatud kude suudetakse 

eemaldada, ei kõrvalda see harilikult organismist papilloomiviirust ning epiteelkoe 

kahjustuste taastekkimine on tõenäoline (Ault K.A, 2005). 

7

1.3 HPV nakatab naha- ja limasepiteeli keratinotsüüte 

1.3.1 Naha ehitus ja naharakkude diferentseerumisprotsess 

Nahk peab organismi kaitsma veekaotuse, vigastuste ja nakkuste eest. Selle tulemusel on välja 

arenenud keerukas diferentseerumise protsess, mis tagab vastupidava, veekindla ja pidevalt 

uueneva välise katte moodustumise. Imetajate nahk koosneb kolmest kihist: epidermis ehk 

marrasnahk, dermis ehk pärisnahk ja hüpodermis ehk alusnahk. Inimese papilloomiviirused 

nakatavad epidermise rakke ehk keratinotsüüte. 

Imetajate epidermis on mitmekihiline kude, mis on kinnitunud basaalmembraanile. Otse 

basaalmembraani peal olev rakukiht ehk basaalkiht sisaldab paljunevaid rakke, mis on 

suhteliselt vähe diferentseerunud, kuigi omavad keratinotsüütidele iseloomulikku 10 nm 

pikkuste keratiinist intermediaalsete filamentide võrgustikku. Basaalkihi rakkudest mõned on 

koespetsiifilised naha tüvirakud, mis jagunevad harva, tekitades ühe tüviraku ja ühe kiiresti 

paljuneva suurema diferentseerituse astmega raku. Kiiresti jagunevate basaalkihi rakkude 

paljunemine on samuti vähemalt osaliselt asümmeetriline - tekib keratinotsüüdiks 

diferentseerumisele pühendunud membraanilt lahkuma määratud rakk ja paljunemisvõimeline 

basaalmembraanile jääv rakk (Lechler ja Fuchs, 2005). Teine võimalus on, et basaalkihi rakud 

paljunevad sümmeetriliselt ning kasvava populatsiooni surve sunnib osasid neist membraanilt 

eralduma ja ülespoole liikumist alustama. 

Joonis 1. (A) Naha histoloogilise ehituse ülevaade. (B) Naharakkude paljunemise skeem. 

Joonised võetud L. Alonso ja E. Fuchsi artiklist Stem cells of the skin epithelium, 2003 

Basaalmembraanilt lahkudes kaotavad rakud võime mitootiliselt jaguneda. Esimese 

muutusena tugevdavad rakud oma intermediaalsete filamentide (IF) võrgustikku sünteesides 

suures koguses keratiine K1 ja K10 ning assambleerides need filamentideks. Kuna 

8

asaalmembraanile kinnitunult sünteesivad naha rakud keratiine K14 ja K5, siis on K1 ja K10 

sünteesile ümberlülitumine kõige kindlam indikaator, et rakk on alustanud terminaalse 

diferentseerumise protsessi (Fuchs E, 2007). Üksikud filamendid ühinevad kimpudeks, mis 

seostuvad rakkudevaheliste ühenduskohtade desmosoomidega. Nii saavutavad mitte ainult 

üksikud rakud, vaid kogu kude vastupidavuse mehhaaniliste stresside suhtes. 

Desmosoomide kaudu seotud rakkude rühmad hakkavad järk-järgult liikuma naha pealispinna 

poole. Järgmise sammuna loovad nad endale sarvja ümbrise, mis tekib rakumembraani alla 

varutavate valkude ensümaatilise ristsidumise tagajärjel. Need rakud toodavad ka 

lamellaarseid graanuleid, mis täidetakse lipiididega ning väljutatakse sarvja ümbrise peale, 

kus nad moodustavad veekindla kihi, mis takistab kehavedelike reguleerimata kadu 

organismist. Pärast kõikide vajalike naha komponentide sünteesi peatavad rakud valkude 

tootmise ja oma ainevahetuslikud protsessid ning läbivad programmeeritud rakusurma, mis on 

mõneti sarnane apoptoosiga. Rakkude jäänuseid lükatakse altpoolt tulevate uute rakkude tõttu 

aina ülespoole kuni nad lõpuks naha pinnale jõuavad ja sealt maha kooruvad. 

Hiirtes võtab kogu diferentseerumise protsess aega 10-14 päeva, inimestel toimub see 

aeglasemalt (Alonso ja Fuchs, 2003). 

1.3.2 HPV DNA replikatsiooni- ja elutsükli seos epiteelirakkude 

diferentseerumisprogrammiga 

Inimese papilloomiviirused sisenevad nahka vigastuste kaudu ja nakatavad epidermise 

basaalkihi rakke. Ühe hüpoteesi järgi peab viirus eduka infektsiooni toimumiseks nakatama 

spetsiifiliselt naha tüvirakku, mitte mõnda selle kiiresti jagunevat pühendunud tütarrakku 

(Stanley M, 2006). Seda toetavad mitmed uuringud, mis on näidanud, et karvafolliikulis, kuhu 

naha tüvirakud on peamiselt koondunud, võib väga tihti PCRi kasutades detekteerida B1 

supergrupi (levinuim papilloomiviiruste rühm) HPVde DNAd, mis võib viidata sellele, et 

papilloomiviirused tõesti eelistavad nakatada tüvirakke (Doorbar J., 2004). 

HPVde rakupinna retseptor ei ole teada, kuid üldiselt seostatakse viiruse võimet rakku 

siseneda hepariinsulfaadi olemasoluga. Viiruspartikli sisenemine arvatakse olevat küllaltki 

aeglane protsess ning see toimub klatriiniga kaetud vesiikulite endotsütoosi kaudu (Culp ja 

Christensen, 2004). Viiruspartiklite lahtipakkimine võib sõltuda kapsomeeri-siseste 

disulfiidsildade katkemisest raku redutseerivas keskkonnas, millele järgneb viiruse genoomi 

tuuma transportimine (Li M jne, 1998). 

9

Joonisel 2 on kujutatud papilloomiviiruse elutsükli etappe ja erinevate valkude ekspressiooni 

seotuna asukohaga epiteelis. Joonis võetud I.H. Frazeri artiklist Prevention of cervical cancer 

through papillomavirus vaccination, 2004. 

Peremeesraku tuumas toimub papilloomiviiruste genoomse materjali paljundamine ning selle 

viib läbi raku replikatsiooni aparatuur, mille värbamises on osalised kaks viiruselist 

replikatsioonivalku E1 ja E2. Viirus on võimeline mõjutama peremeesraku rakutsüklit, millest 

tuleneb ka tema onkogeenne potentsiaal. Papilloomiviiruste elutsükkel on seotud naharakkude 

diferentseerumise programmiga ja seetõttu on HPV produktiivse infektsiooni saamine 

rakukultuuris keeruline. 

Pärast raku nakatamist toimub esialgne genoomi amplifikatsioon ja pärast seda jääb viirus 

ligikaudu 50-100 koopiaga episomaalse DNA plasmiidina rakutuuma püsima. Arvatavasti 

toimub sellel ajal madalal tasemel viiruse varajaste valkude E1, E2, E6 ja E7 ekspressioon. E1 

ja E2 valke on vaja viraalsete episoomide säilitamiseks ja nende korrektseks tütarrakkude 

vaheliseks segregatsiooniks, E6 ja E7 täpne roll selles infektsiooni staadiumis on vaieldav 

(Doorbar J, 2004). Nakatatud raku basaalmembraanilt lahkumine ehk epiteelse 

diferentseerumise algus initsieerib papilloomiviiruse elutsükli produktiivse etapi alustamise, 

mille käigus toimub genoomi amplifikatsioon, hilise geeniekspressiooni aktivatsioon ja 

viiruspartiklite kokkupakkimine (Moody C.A jne, 2007). 

10

Joonis 3, HPV-31 genoom. Joonisel on välja toodud varajaste (E) ja hiliste (L) geenide avatud 

lugemisraamid, URR (origin) piirkond, viiruse mõlemad promootorid ja 

polüadenülatsioonisaidid. Joonis võetud F. Fehrmanni ja L.A. Laiminsi artiklist Human 

papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation, 

2003. 

Kõigepealt muudab E6 ja E7 valkude ekspressioon epidermise alumistes kihtides raku 

normaalse lõpliku diferentseerumise protsessi, sundides rakku taaskord sisenema S-faasi. Nii 

E6, E7 kui ka teisi HPV varajasi valke (E1, E2, E4 ja E5) sünteesitakse viiruse varajaselt 

promootorilt (Doorbar J, 2005), näiteks p97 HPV-16 korral, p105 HPV-18-l. 

Epiteeli keskmises või ülemises osas aktiveeritakse HPV hiline promootor, mis asub E7 

avatud lugemisraami sees ning suurendab viiruse genoomi amplifitseerimises osalevate 

valkude (E1, E2, E4 ja E5) ekspressiooni taset. E2 seondumine HPV regulaatorpiirkonnaga 

on vajalik E1 helikaasi värbamiseks viraalse replikatsiooni alguspunkti, E1/E2 

initsiaatorkompleks omakorda juhib kohale raku replikatsiooniaparatuuri, mis võimaldab 

viiruse genoomi amplifikatsiooni. E4 ja E5 täpne roll genoomi amplifikatsioonis ei ole veel 

teada (Doorbar J, 2005). 

Kogu viiruse elutsükli jooksul kontrollitakse varajaste ja hiliste valkude ekspressioonitaset 

erinevate promootorite ja splaissimissaitide kasutamisega (Doorbar J, 2005). 

11

Papilloomiviirused kodeerivad kahte struktuurset valku, mida sünteesitakse nakatatud koe 

ülemistes kihtides pärast genoomi amplifikatsiooni lõpetamist. L2 valk akumuleerub virionide 

kokkupakkimise ajal PML kehade nime all tuntud tuumsetes struktuurides. Arvatakse, et 

PML struktuurid on seotud viiruse plasmiidse DNA replikatsioonitsentritega. HPV virionide 

ülesehituseks on vaja keskmes olevat viiruse genoomi, 360 L1 valgu koopiat ja arvatavasti 12 

L2 valgu koopiat, mis on organiseeritud 72 kapsomeersesse ikosaeedrilisse kesta (Doorbar J, 

2005). 

Papilloomiviirused ei ole lüütilised viirused ning virione ei vabastata enne kui peremeesrakk 

jõuab naha pinnale. Kuna keratinotsüüt on rakk, mis on määratud surema, et ole HPV-l 

tegelikult vajagi oma peremeest kuidagi ise tappa. Pigem takistavad viiruse valgud raku 

tuuma kondenseerumist, et enda genoomi replitseerida, lükates sellega raku surma edasi 

(Stanley M, 2006). Virionide väljutamine ei ole papilloomiviirusel siiski täielikult passiivne 

protsess. E4 valk võib mängida rolli viiruspartiklite vabastamisel rakust keratiinivõrgustiku 

terviklikkuse ja sarvja ümbrise tekke mõjutamise kaudu (Doorbar J, 2005). On ka näidatud, et 

HPVd aktiveerivad diferentseeruvas nakatanud rakus kaspaasid –9, -3 ja –7, mida nad vajavad 

oma genoomi amplifikatsiooniks. Kuna kaspaasid on laialdaselt tuntud apoptoosi 

esikutsujatena, on võimalik, et neid vajatakse virionide rakust väljutamise kergendamiseks 

lisaks nende rollile viiruse replikatsioonis (Moody C.A. jne, 2007). 

Lisaks sellele, et papilloomiviiruse elu- ja replikatsioonitsükkel sõltub epiteeli rakkude 

diferentseerumisprotsessist, on in vitro näidatud, et kõrgeriski viiruste gruppi kuuluv HPV-16 

suudab mõjutada keratinotsüütide normaalset diferentseerumist (McCance D.J. jne, 1988). 

Koekultuuri tingimustes kultiveeritud ja papilloomiviirusega nakatatud keratinotsüüdid 

ekspresseerisid küll diferentseerunud rakkudele omaseid markereid, kuid omasid 

diferentseerumata fenotüüpi. Juba rakukultuuri ülemistesse kihtidesse liikunud rakud 

meenutasid basaalkihi rakke ning olid osaliselt mitootiliselt aktiivsed. Lisaks täheldati 

vakuoolide olemasolu tsütoplasmas, tavatut kromosoomide värvumist ning tuumatsütoplasma 

vähendatud suhet. Nakatatud rakukultuuri iseloomustavad histoloogilised 

ebanormaalsused olid analoogsed papilloomiviiruste poolt põhjustatud genitaalpiirkonnas 

esinevate histoloogiliste ebanormaalsustega (McCance D.J. jne, 1988). Seega on tõenäoline, 

et kui HPV suudab epiteelide diferentseerumisprogrammi muuta ka in vivo, on see 

papilloomiviiruse infektsiooniga kaasneda võivate haiguste tekke põhjuseks. 

12

2. TÜVIRAKUD JA INIMESE PAPILLOOMIVIIRUS 

2.1 Tüvirakud 

Tüvirakke iseloomustab võime diferentseeruda erinevateks organismis leiduvateks 

rakuliinideks. Traditsiooniliselt jagatakse tüvirakke päritolu järgi embrüonaalseteks 

tüvirakkudeks ja täiskasvanud organismis leiduvateks koespetsiifilisteks tüvirakkudeks, 

viimasel ajal on neile lisandunud ka indutseeritud pluripotentsed rakud ehk iPS (induced 

pluripotent stem) rakud. 

2.1.1 Embrüonaalsed tüvirakud 

Embrüonaalsed tüvirakud ehk ESCd on pärit blastotsüsti sisemisest rakumassist ehk ICMist 

(inner cell mass) ning neid peetakse ainsana tõeliselt pluripotentseteks, kuna nad võivad anda 

aluse rakuliinidele kõigist kolmest lootelehest. Rakukultuuris saab ESC rakke kasvatada 

toiterakkude (feeder cells) kihi peal. Toiterakkudena on laialdaselt kasutatud hiire 

embrüonaalseid fibroblaste, kuid võimaliku kliinilise kasutamise huvides oleks parem, kui 

inimese tüvirakkude kultiveerimisel ei kasutataks võõrliikidelt pärinevaid produkte. Hiire 

embrüonaalsete fibroblastide asemel saab toiterakkudena kasutada inimese fibroblaste või 

inimlootelt pärinevaid kudesid. Toiterakud on võimalik asendada hiire embrüonaalsetest 

fibroblastidest eraldatud rakuvälise maatriksi või kollageen IV, fibronektiini, laminiini ja 

vitronektiini seguga. (Mountford J.C., 2008). 

Kõik tänapäeval olemasolevad hESC liinid on pärit kunstliku viljastamise jaoks loodud 

embrüotest, mis olid kas üleliigsed või implantatsiooniks sobimatud (Mountford J.C., 2008). 

Kuna nende rakuliinide päritolu on paljude jaoks eetiliselt vastuvõetamatu, on otsitud 

embrüonaalsete tüvirakkude saamiseks alternatiivseid meetodeid. Esimene oleks kultiveerida 

hESCsid nendest kunstliku viljastamise protseduuridest pärinevatest embrüotest, mis on oma 

arengus peatunud, kuid milles leidub siiski eluvõimelisi rakke. Teiseks on demonstreeritud, et 

tüvirakuliine saab kultiveerida üksikust 8 või 10-raku staadiumis olevast blastotsüstist 

eraldatud rakust. Ühe raku eemaldamine ei tohiks embrüot liigselt kahjustada ning seda 

meetodit kasutakse praegu implantatsiooni-eelses geneetilises diagnostikas, millega 

kontrollitakse, et arenema hakkavad organismil ei esineks tõsiseid geneetilisi defekte. 

Embrüonaalsed tüvirakud tunduvad olevat võimeliselt lõpmatult koekultuuri tingimustes 

paljunema ilma vananemise märke ilmutamata, mis teeks nende populatsioonide 

suurendamise küllaltki lihtsaks. Samuti on olemas erinevaid markereid, mis võimaldavad 

13

eristada diferentseerumata tüvirakke pühendunud tüvirakkudest ja mille abil saaks 

olemasolevaid rakupopulatsioone regulaarselt puhastada siiski tekkinud ebasoovitavatest 

rakkudest (Mountford J.C., 2008). 

Samas on näidatud, et pikka aega rakukultuuris kasvatatud embrüonaalsetel tüvirakkudel 

tekivad genoomsed ümberkorraldused, sh koopiaarvu muutused, mutatsioonid 

mitokondriaalses DNAs ning promootorite metüleerimismustrite muutused. Kõiki vastavaid 

erinevusi normaalse raku genoomist on täheldatud ka inimese vähkide korral (Maitra A jne, 

2005). 

2.1.2 Koespetsiifilised tüvirakud 

Täiskasvanud organismi kudedes ja organites leidub rakke, mis käituvad väga sarnaselt 

tüvirakkudega. Need rakud on võimelised andma järeltulijaid, mis diferentseeruvad vastava 

koe rakkudeks ning osalevad vigastuste parandamises ja koe uuendamises. 

Koespetsiifilised tüvirakud on väga heterogeenne populatsioon ning andmed nende 

erinevateks rakuliinideks diferentseerumise kohta on vastukäivad. Arvatavasti võib nende 

hulgas leida nii pluripotentseid kui ka juba pühendunud rakke, millel on ka vastavalt erinevad 

enese-uuenduslikud ja plastilised omadused (Ratajczak M.Z., 2007). Pluripotentsete rakkude 

hulk täiskasvanud organismis on ilmselt väga väike ning nende naaberrakkudest eraldamine 

nõuaks põhjalikku puhastamist. Samuti on tõenäoline, et elu jooksul on koespetsiifiliste 

tüvirakkude geneetiline materjal keskkonnamõjude ja replikatsioonil tehtud vigade tõttu 

kahjustada saanud (Heng B.C. jne, 2005). 

Koespetsiifilised tüvirakud on diferentseerumata, aeglaselt jagunevad ja paiknevad tihti 

spetsiaalse mikrokeskkonnaga “nišis”. Neid iseloomustab suur tsütoplasma ja tuuma suhe 

ning väike organellide arv. Nagu ka peatükis 1.3.1 juba kirjeldatud, võivad tüvirakud 

paljuneda kas sümmeetriliselt või asümmeetriliselt, andes järeltulijateks vastavalt kaks 

identset tütarrakku või ühe tüviraku ja ühe pühendunud eellasraku. Pärast jagunemist hakkab 

tüviraku tütarrakk, mis on niši keskkonnast väljunud, kiiresti jagunema ning aina rohkem ja 

rohkem diferentseeruma, kuni temast tekib lõplikult diferentseerunud rakk. 

Tüvirakkude käitumine koes (jagunemise kiirus, diferentseerumise suund jms) on 

reguleeritud nii väliste (teiste rakkude või niši poolt genereeritud stiimulid) kui ka sisemiste 

(tüvirakkude enda “programm”) tegurite poolt (Miller S.J., 2005). 

14

Joonis 4, tüvirakkude jagunemise erinevad mudelid. Joonis võetud S.J. Milleri jne artiklist 

Interpreting epithelial cancer biology in the context of stem cells: Tumor properties and 

therapeutic implications, 2005. 

2.1.3 Indutseeritud pluripotentsed rakud (iPS rakud) 

2007. aastal demonstreeriti, kuidas inimese naha fibroblaste saab pluripotentseteks rakkudeks 

ümber programmeerida kasutades geenide Oct-4, Sox-2, c-Myc ja Klf-4 indutseeritud 

ekspressiooni (Takahashi K jne, 2007). Saadud iPS rakkude liinid sarnanesid embrüonaalsete 

tüvirakkudega nii morfoloogia, pinnamarkerite ekspressiooni, epigeneetilise staatuse, 

diferentseerumispotentsiaali kui ka üldise geeniekspressiooni mustri poolest. 

iPS rakkude loomiseks on kasutatud ka geene Oct-4, Sox-2, nanog ja Lin28 (Yu J jne, 2007), 

millest võib järeldada, et eriti olulised on pluripotentsuse indutseerimisel just Oct-4 ja Sox-2. 

Siiski ei ole veel päris selge, kas iPS rakud tekivad somaatilistest rakkudest või ainult 

koespetsiifilistest tüvirakkudest, mis kasutatud populatsioonis esinesid (Durcova-Hills G, 

2008). 

Kuid iPS rakkudel on ka puudusi. Nii transduktsioonis kasutatavad viiruvektorid kui ka 

mõned sisestatud geenid ise võivad põhjustada vähki, mistõttu praegu on uueks eesmärgiks 

leida valgud või keemilised ühendid, mis suudaksid vajalikke geene aktiveerida rakke 

15

geneetiliselt manipuleerimata. Samuti ei ole veel täielikult kindlaks tehtud, et iPS rakud 

suudavad diferentseeruda sama mitmekesiselt ja stabiilselt kui tüvirakud, kuna esialgsed 

uuringud, mis siiamaani läbi on viidud, ei ole olnud piisavalt põhjalikud. Senini on uuritud 

kaudseid tunnuseid nagu pinnamarkerid, et kinnitada kahe rakupopulatsiooni sarnaseid 

tunnuseid, kuid samade markerite ekspresseerimine ei anna alati veel rakkudele samasuguseid 

omadusi. Olemasolevate iPS rakuliinide vahel esineb ka märkimisväärseid erinevusi, mistõttu 

erinevatest liinidest pärit rakkude omadused ei pruugi olla sarnased. Samuti ei saa öelda, et 

koos pluripotentsuse indutseerimisega oleks kadunud eetilised probleemid, mis kaasnesid hES 

rakkudega, kuna teoreetiliselt oleks võimalik iPS rakkudest tekitada gameete ning kasutada 

neid elusorganismide loomiseks (Cyranoski D, 2008). 

Kokkuvõtteks võib öelda, et indutseeritud pluripotentsete rakkude loomine on paljulubav, 

kuid veel põhjalikku uurimist vajav tehnoloogia. 

2.1.4 Terapeutiline kloonimine 

Tüvirakke on loodud kandes somaatilise raku tuuma üle viljastatud ilma tuumata munarakku. 

Sellega on ka tõestatud, et epigeneetilised muutused, mis leiavad aset raku diferentseerumise 

käigus on tagasipööratavad ning lõplik diferentseerumine ei piira tuuma potentsiaali panna 

alus terve uue organismi arengule. 

Tuuma reprogrammeerimine viljastatud munarakus on küllaltki ebaefektiivne ning kuna 

normaalselt läbivad tulevased sugurakud tõenäoliselt gametogeneesi käigus teistkordse 

ümberprogrammeerimise, mis terapeutilise kloonimise puhul vahele jääb, ka vigane. 

Probleeme võib tekitada ka mitokondriaalse ning tuuma DNA kokkusobimatus. Siiski on 

somaatilise tuuma ülekanne üks arvestatavaid meetodeid pluripotentsete tüvirakkude 

loomiseks (Hochedlinger K ja Jaenisch R, 2006). 

2.2 Naha tüvirakud 

Tüvirakke on täiskasvanud organismi ükskõik millises koes suhteliselt väike hulk ja nende 

eristamine tavalistest naaberrakkudest on keeruline. Peamine tüvirakkude nišš nahas asub 

karvafolliikulis, basaalkihi rakkude hulgas on neid kõigest 2-7%. Karvafolliikuli tüvirakud 

paiknevad karvatupe väljasopistuses (bulge) karvapüstitajalihase läheduses rasunäärme all. 

Tüvirakud on seal hästi kaitstud ning neid ümbritsevas koes on rikkalikult närvijätkeid ja 

veresooni, mis tagab rakkudele hea varustatuse toitainete ja hapnikuga (Fuchs E, 2007). 

16

Naha tüvirakud osalevad karvafolliikuli tsüklilise arengu käigus folliikuli taastamises ja uue 

karva kasvus ning vigastuste korral epidermise ja rasunäärmete taastamisel (Fuchs E, 2007). 

Joonis 5. Väljasopistuses paiknevate tüvirakkude võimalikud diferentseerumisrajad. Joonise 

aluseks on võetud skeem E. Fuchsi artiklist Scratching the surface of skin development, 2007. 

On identifitseeritud ligikaudu 150 geeni, mille ekspressioon on iseloomulik just väljasopistuse 

rakkudele. Nende hulgas on ka BMP (bone morphogenetic protein) ja transformeeriva 

kasvufaktor-β signaalirajaga seotud geenid, mis ilmselt vastutavad tüvirakkude inaktiivse 

oleku eest. Kuigi on kindlaks tehtud, et väljasopistuse rakkude hulgas on tüvirakke, ei ole 

kindel, kas enamus seal paiknevaid rakke on multipotentsed, kuna vigastuste või uue karva 

tekke alguses aktiveeritakse neist vaid väike osa ning ülejäänud jäävad inaktiivseks. Samas on 

tõestatud, et folliikuli-sisese epidermise rakud ei ole erinevalt väljasopistuses paiknevatest 

rakkudest võimelised diferentseeruma kõikideks naha rakuliinideks, mis annab alust 

spekulatsioonidele, et nad ei ole mitte tüvirakud, vaid tõeliste naha multipotentsete 

tüvirakkude kiiresti jagunevad ja juba mingile spetsialiseerumisrajale pühendunud järglased 

(Fuchs E, 2007). 

Elu jooksul toimub pidevalt karvafolliikulite uuenemine ja uute karvade kasv nahal. Ei ole 

täpselt teada, mis signaalid osalevad väljasopistuse tüvirakkude aktiveerimisel karvafolliikuli 

17

taastamiseks, kuid ühe hüpoteesi järgi on selleks vajalik karva näsa lähedus. Karvafolliikuli 

degradatsiooni käigus tõuseb karva näsa ülespoole naha tüvirakkude lähedusse. Kui karva 

näsa uue karvakasvu tsükli alguses väljasopistusest eemaldub, taastub ka tüvirakkude vaikiv 

olek (Fuchs E, 2007). 

Karvafolliikuli tüvirakud ei osale tavatingimustes epiteeli homöostaasis, mistõttu nad ei ole ka 

hädavajalikud epidermise säilimiseks. Epidermise uuenemises on olulised hoopis basaalkihi 

rakud. Kuid vigastuste korral toimub folliikulist pärit tüvirakkude migreerumine kahjustatud 

kohta, kus nad osalevad kahjustada saanud piirkonna taaskatmises epiteelkoega. Kuna haava 

piirkonda liikunud rakud on omandanud epiteelse fenotüübi, on see tõestuseks sellele, et 

karvafolliikuli tüvirakud on tõesti võimelised diferentseeruma kõikideks epiteeli rakuliinideks 

(Ito M jne, 2005). 

Veel ei ole kindlaks tehtud, missugused on signaalid, mis osalevad tüvirakkude 

aktiviseerimises koekahjustuste korral, kuid viimasel ajal on esile kerkinud arvamus, et selle 

protsessiga võivad olla seotud rakkudevahelised ühendused. On võimalik, et kui nahk on 

vigastatud, initsieerib rakkudevaheliste adhereen-ühenduste vähesus rakkude migratsiooni 

vastavasse piirkonda, nende jagunemise seal ja immuunsüsteemi värbamise võimalikku 

infektsiooni vältimiseks. Kui optimaalne ühenduste arv on taastatud, toimub olukorra 

normaliseerumine (Fuchs E, 2007). 

Tüvirakuliste omaduste omandamist ja säilitamist nahas on seostatud Wnt signaalirajaga, 

mille keskseks ühendiks on β-kateniin. β-kateniin on multifunktsionaalne valk, mis aktiveerib 

Lef/Tcf perekonna DNA siduvaid valke. Wnt valgu poolt antava signaali mõjul moodustavad 

embrüonaalsed epiteeli tüvirakud karvafolliikuli. Selle protsessi juures on oluline ka BMP 

signaaliraja inhibeerimine. Kui β-kateniini pidevalt transgeense hiire nahas ekspresseerida, 

siis käitub ka folliikulite vaheline epidermis kui embrüonaalne nahk ning võib valida 

epidermaalse või karvafolliikuli staatuse vahel. Samasugune mõju on β-kateniinil ka naha 

mesenhümaalsetele rakkudele (Alonso L ja Fuchs E, 2003). 

18

Joonis 6. Skeemil on ülevaatlikult kujutatud Wnt signaalirada. Joonis pärineb 

internetileheküljelt http://www.pandasthumb.org/archives/2005/01/a-complex-regul.html 

Lef1/Tcf perekonna valkude aktiivsus võib olla määrava tähtsusega tüviraku 

diferentseerumise raja valikul. Kui Lef1 on nahas ja suu epiteelkoes üleekspresseeritud, võib 

täheldada karva ja hammaste kasvu tavatutes kohtades (Zhou P jne, 1995). Kui Wnt 

signaalrada takistada, tekivad folliikulite asemel epidermaalsed tsüstid (Huelsken J jne, 2001). 

Lef1/Tcf perekonda kuuluv transkriptsioonifaktor Tcf3 mängib suurt rolli naha tüvirakkude 

omaduste säilitamises ja inhibeerib kõiki kolme naha eellasrakkude diferentseerumisrada. 

Kaks neist, epidermaalne ja rasunäärme rada, ei olnud varem teadaolevalt Wnt signaalirajaga 

seotud. 

Tcf3 valku ekspresseeritakse naha eellasrakkudes nii embrüonaalselt kui ka pärast sündi, 

diferentseerumise käigus kaasneb aga selle taseme langus. Kui Tcf3 valgu taset kunstlikult 

tõsta, säilivad rakkudevaheline adhesioon ja epidermise-dermise vaheline piir, kuid 

diferentseerumist näitavate molekulaarsete markerite ekspressioon on alla surutud. Kuna Tcf3 

ilmneb nahas kõigepealt kohas, kuhu tekib hiljem tüvirakkude nišš, võib see anda aimdust, 

kuidas ja millal tekib nahas tüvirakkude reservuaar (Nguyen H jne, 2006). 

Tcf3 indutseerimise korral muutub epidermises ligikaudu 300 geeni ekspressioonimuster. 

Geenid, mis osalevad lipiidide metabolismis ja elektronide transpordis, olid eelistatult alla 

19

surutud, suhkrute metabolismi ja rakkude liikuvusega seotud geenide ekspressioon oli 

eelistatult soodustatud. Üldjoontes sarnaneb Tcf3 indutseeritud geeniekspressiooni muster 

väga naha eellasrakkude geeniekspressiooni mustriga. Ainus üllatus oli see, et vaid mõned 

rakkude jagunemisega seotud geenid on Tcf3 poolt negatiivselt mõjutatud. Seetõttu on 

tõenäoline, et kui Tcf3 mängib rolli tüvirakkude rakutsükli aeglustamises, ei tee ta seda 

üksinda (Nguyen H jne, 2006). 

Üks Tcf3 poolt kõige tugevamini inhibeeritud geene kodeerib PPA (peroxisome proliferatoractivated) 

retseptoreid ehk PPARe. Kuna iga PPAR geeni promootoris paikneb Tcf/Lef1 

regulatoorne element, millele Tcf3 on võimeline seonduma nii in vitro kui ka in vivo, on väga 

tõenäoline, et Tcf3 suudab PPAR geenide ekspressiooni otseselt mõjutada. PPAR 

transkriptsioonifaktorid on olulised nii epidermaalses kui ka rasunäärmete diferentseerumises, 

mistõttu Tcf3 olemasolul rakus on need diferentatsioonirajad blokeeritud. On ka näidatud, et 

Tcf3 juuresolekul ei suuda degenereerunud karvafolliikulid enam uuesti siseneda karvade 

tsüklilisse arengusse ning uusi folliikuleid ei teki (Nguyen H jne, 2006). 

Spetsiifilisi naha tüvirakkude markereid veel leitud ei ole. Üheks kandidaadiks on integriini 

perekonna transmembraansed retseptorid, mis on osalised basaalkihi rakkude kinnitumisel 

basaalmembraanile, teiseks on transferriini retseptor. Kuna naha tüvirakud paiknevad kas 

basaalmembraanil või karvafolliikulis, siis on potentsiaalsete markeritena huvitavad just 

molekulid, mis osalevad rakkude adhesioonil substraadile. Adhesiooni molekulide uurimist 

toetab ka see, et tõenäoliselt vajavad tüvirakud oma iseloomulike tunnuste säilitamiseks kas 

niši spetsiifilist mikrokeskkonda või kinnitumist basaalmembraanile (Alonso L ja Fuchs E, 

2003). 

2.3 Tüvirakkude osa naha- ja limaskesta koevigastuste parandamises 

Vigastuste parandamine on igale organismile elutähtis protsess. Kuna papilloomiviirus 

siseneb organismi just epiteeli vigastuste kaudu, on see tähtis aspekt ka HPV uurimisel. 

Naha- ja limaskesta vigastuste parandamise juures mängivad põhirolli kaks protsessi: reepiteliseerumine 

ja sidekoe kokkutõmbumine. Täiskasvanud organismis liiguvad eesmised 

epidermaalsed rakud haava sulgemiseks üle vigastuse piirkonna, samaaegselt toimub sidekoe 

kokkutõmbumine eriliste müofibroblastide abil. Vigastuste paranemisel ei taastata 

20

epidermaalsed ja dermaalsed struktuurid täielikult ning kahjustada saanud kohta tekib arm. 

(Nodder S ja Martin P, 1996) 

Epiteeli vigastuste korral hakkavad kahjustuse serval basaalkihi keratinotsüüdid ettepoole 

liikuma üle ajutise fibronektiini ja fibrinogeeni maatriksi, mis tekib haava dermise ja fibriinist 

kärna vahele. Esimeste ridade rakkudel moodustuvad sõrme-laadsed lamellipoodid ning 

nende integriinide ekspressioonimuster muutub, nii et nad hakkavad rohkem tootma 

fibronektiini/fibrinogeeni siduvaid integriine ja relokaliseerivad kollageeni/laminiini siduvad 

integriinid, mis võimaldab epidermaalsete rakkude kihil kinnituda alumisele koele ja vedada 

ennast edasi üle haavapinna. Juhtivad epidermaalsed rakud hakkavad ka sekreteerima mitmeid 

proteaase ja proteaaside regulaatoreid, mis võimaldab neil liikuda läbi kuivanud dermise ja 

kärna (Nodder S ja Martin P, 1996). 

Juhul, kui vigastuse piirkonnas on säilinud karvafolliikulid, mängivad haava taaskatmisel 

epiteelkoega väga suurt osa tüvirakud. Vastava signaali saamise järel hakkavad karvafolliikuli 

tüvirakud lineaarselt kahjustuse suunas liikuma. Enamasti liiguvad mobiliseerunud tüvirakud 

epidermise pealmistesse kihtidesse, kuid sügavama haava puhul basaalkihti, mis tähendab, et 

neid suunatakse otseselt piirkonna suunas, kus rakke puudu on. Migreerumise ajal 

ekspresseerivad folliikuli rakud juba keratinotsüütidele iseloomulikke markereid, mis näitab, 

et nad on alustanud epiteeli rakkudeks diferentseerumist. Vigastatud kohas jagunevad need 

rakud kiiresti ning osalevad epidermise taastamises, kuid aja möödudes folliikulist pärit 

rakkude arv vigastatud koes väheneb. Arvatakse, et see on märk epidermaalset päritolu 

rakkude ellujäämis-eelisest võrreldes tüvirakkude järglastega, kuna pühendunud eellased ei 

ole uues kohas ilmselt võimelised oma omadusi säilitama ja on määratud lõplikult 

diferentseeruma (Ito M jne, 2005). Tüvirakkude olulisust vigastuste parandamisel rõhutab 

see, et juhul kui karvafolliikulid on ulatusliku kahjustuse käigus hävinud, suudab organism 

haava parandada ainult äärtest (Alonso L ja Fuchs E, 2003). 

Mitmeid tunde pärast naha vigastamist aktiveeritakse lähedalasuvad tavaliselt paiksed 

dermaalsed fibroblastid, mis liiguvad kahjustatud kohta, paljunevad seal ja moodustavad 

puuduva sidekoe asendamiseks maatriksi. Uude sidekoesse tungib eelnevalt olemasolevatest 

veresoontest tekkinud kapillaaride võrgustik. Moodustunud koekompleksi tuntakse 

granulatsioonikoena ning just see on vastutav haava kokkutõmbumise eest koeparandamise 

protsessis. Granulatsioonikoe kokkutõmbevõimelised rakud on müofibroblastid, mis tekivad 

tavalistest haava fibroblastidest, kuid meenutavad pigem silelihasrakke. Müofibroblastide 

21

teket indutseerib TGFβ ja teiste kasvufaktorite olemasolu kombinatsioon mehhaaniliste 

stiimulitega vigastuste sulgumisel (Nodder S ja Martin P, 1996). 

Erinevate tsütokiinide ja kasvufaktorite vabastamine vereliistakutest põhjustab haava 

ümbruses põletiku tekke. Arvatakse, et just need signaalid initsieerivad ja juhivad ka teisi 

vigastuste parandamise protsesse ning on vastutavad neutrofiilide ja makrofiilide värbamise 

eest vigastatud piirkonda. 

Lisaks patogeenide ja raku laguproduktide fagotsüteerimisele muutuvad immuunsüsteemi 

rakud pärast esialgsete signaalide kadumist kahjustatud koes tsütokiinide ja kasvufaktorite 

allikaks ning kui nende ligipääsu haavale takistada, on paranemisprotsess tugevalt pärsitud 

(Nodder S ja Martin P, 1996). 

2.4 Koeparandamise ja HPV infektsiooni seos 

Kuna papilloomiviirus siseneb organismi epiteeli vigastuste kaudu ning nende vigastuste 

parandamisel mängivad suurt rolli tüvirakud, on väga tõenäoline, et HPV puutub kokku ja 

nakatab ka tüvirakke. Võib oletada, pikaajalise infektsiooni tekkeks on vaja just aeglaselt 

jagunevate tüvirakkude nakatumine, kuna juhul kui HPV siseneb kiiresti paljunevatesse 

pühendunud eellasrakkudesse, kaob viirus eespool kirjeldatud keratinotsüütide elutsükli 

iseärasustest tingituna organismist suhteliselt lühikese aja jooksul. 

2.5 Tüvirakkude osa papilloomiviiruste indutseeritud kartsinogeneesis 

Ligi 90%-i inimeste kasvajaid saab alguse epiteelkoest. Organismi epiteelid läbivad pidevat 

uuendumist ja ümberkorraldumist, milles osaleb terve hierarhia erineva 

jagunemispotentsiaaliga rakke. Rakupopulatsioonide uuenemine saab alguse aeglaselt 

jagunevatest tüvirakkudest, jätkub nende pühendunud järglaste kiire paljunemisega ning 

tipneb terve suure hulga organiseeritud lõplikult diferentseerunud rakkude moodustamisega. 

Vähi teket võib tihti vaadelda kui normaalse koe homöostaasi hälbinud varianti, kuna see 

kordab oma arengus tüvirakk → pühendunud eellane → diferentseerunud rakk järgnevust 

(Miller S.J. jne, 2005). 

On välja pakutud kaks kasvaja suurenemise mudelit. Stohhastilise mudeli järgi on 

põhimõtteliselt kõik kasvaja rakud võimelised kiiresti jagunema. Tüviraku mudeli järgi on 

22

ainult väike protsent kasvaja rakkudest võimelised pika aja jooksul säilitama 

paljunemisvõimet, kuna enamus rakke läbib muundunud kujul terminaalse diferentseerumise 

protsessi. Vähi tüvirakud arenevad koespetsiifilistest tüvirakkudest samade aeglaste 

protsesside läbi nagu vähirakud tavalistest normaalse koe rakkudest (Miller S.J. jne, 2005). 

Kineetilised analüüsid ja katsed inimeste rakkudega koekultuuri tingimustes näitavad, et 

inimese puhul peab toimuma 4-7 suureulatuslikku mutatsiooni homöostaasi jaoks vajalikes 

geenides, et normaalsest rakust areneks vähirakk (Miller S.J. jne, 2005). Nende 

mutatsioonidega peavad rakus kaasnema järgnevad muutused: (i) kasvusignaalide suhtes 

naaberrakkudest sõltumatuks muutumine, (ii) tundetus kasvu inhibiitorite suhtes, (iii) 

apoptoosi vältimine, (iv) piiramatu potentsiaal jaguneda, (v) võime soodustada veresoonte 

teket, (vi) võime tungida teistesse kudedesse ja tekitada metastaase. Kõikide nende tunnuste 

tekkimise eelduseks on seitsmes muutus genoomse ebastabiilsuse näol (Miller S.J. jne, 2005). 

On palju tõendeid selle kohta, et just tüvirakud on organismi rakkude hulgas selliste 

mutatsioonide sihtmärkpopulatsioon, üks kõige ilmselgemaid on see, et kuna epiteeli 

uuenemise toimub inimestel 4 nädala jooksul, siis on ainult tüvirakud epiteeli rakkudest 

organismis piisavalt kaua nende mutatsioonide kogunemiseks. Kuid on ka näidatud, et vähi 

teke võib alguse saada rohkem diferentseerunud eellasrakkudest. Kuna vähitekke protsess on 

pika-ajaline, on võimalik, et sellisel juhul toimuvad varased mutatsioonid tüvirakkudes, kuid 

lõplik transformatsioon alles tüvirakkude pühendunud järglastes (Miller S.J. jne, 2005). 

Mutatsioonid toimuvad rakkudes enne fenotüübiliste muutuste teket ning mõnede 

perekondlikult päranduvate vähkide puhul võivad need olemas olla isegi enne organismi 

sündi. Tüviraku niššides toimub rakkude klonaalne evolutsioon ning kui peaks juhtuma, et 

omandatud mutatsioon suurendab tüviraku kohasust, võib toimuda niši sees geneetiliselt 

muundunud raku klonaalne ekspansioon. Mutatsiooniga rakkude arvu kasv omakorda 

suurendab tõenäosust, et kui peaks toimuma teistkordne geneetilise materjali teisenemine, 

toimub see juba eelnevalt pro-onkogeenses rakus. Muteerunud rakkude paljunemisele niši 

sees järgneb nende populatsiooni laienemine väljapoole nišši, mille käigus tekivad epiteelses 

koes kahjustunud geneetilise materjaliga rakkudega kaetud piirkonnad. Mutatsioonide 

lisandumine nendesse aladesse võib lõppeda vähi tekkega (Miller S.J. jne, 2005). 

Kuna papilloomiviirused nakatavad eelistatult tüvirakke ning ekspresseerivad pro-onkogeene, 

on HPV infektsioon vähiteket soodustav tegur. Eriti kui tegu on kroonilise nakkusega, millega 

23

kaasnevad pika-ajalised epiteel- või limaskoe kahjustused. On ka näidatud, et 

papilloomiviiruse elutsüklis võib amplifikatsioonilise replikatsiooni vigane masinavärk olla 

vastutav genoomse ebastabiilsuse tekke eest (Kadaja M jne, 2007). Kõrgeriski HPV genoomi 

enda üleamplifikatsioon võib viia subgenoomsete origin-fragmentide kogunemisele rakus ja 

nende seejärgsele integratsioonile peremeesraku genoomi. Mingil etapil võivad ühes rakus 

sama-aegselt koos eksisteerida nii integreerunud kui ka episomaalne HPV genoomne DNA, 

kusjuures episomaalse genoomi pealt sünteesitud E1 ja E2 valgud võivad algatada 

replikatsiooni ka integreerunud HPV URR (origin) piirkonnalt, mille tulemusena toimub nii 

papilloomiviiruse DNA kui ka sellega piirneva raku genoomse materjali amplifikatsioon. 

Tekkinud fragmendid võivad olla sihtmärgiks raku reparatsiooni/rekombinatsiooni 

aparatuurile, mis kokkuvõttes võib viia genoomsete ümberkorralduste ja nendest tuleneva 

genoomse ebastabiilsuse põhjustatud vähi tekkeni (Kadaja M jne, 2007). 

On võimalik, et ka in vitro näidatud HPV-16 võime pärssida epiteeli rakkude 

diferentseerumist (McCance D.J. jne, 1988) võib soodustada vähi teket. Kui HPV hoiab oma 

peremeesrakku diferentseerumata olekus ning laseb tal olla jagunemisvõimelisena kauem kui 

loomulik, suurendab see nii rakus transformeerivate mutatsioonide toimumise kui ka 

muteerunud raku paljunemise tõenäosust. 

3. TÜVIRAKKUDE DIFERENTSEERUMISE SUUNAMINE. SISSEJUHATUS 

Seoses inimese papilloomiviiruse elutsükli seotusega epiteeli rakkude 

diferentseerumisprogrammiga ning tõsiasjaga, et eduka infektsiooni tekkeks peab HPV 

nakatama just naha tüvirakke, oleks väga kasulik, kui papilloomiviirust saaks laboratoorselt 

uurida tüvirakkude koekultuuris, mida saab indutseerida diferentseeruma keratinotsüütideks. 

Elusate loomamudelite peal on viiruse ja organismi interaktsioone raske uurida, samuti on 

loommudelite kasutamine kallis ja tülikas. Lisaks takistab papilloomiviiruse suur 

koespetsiifilisus katseloomade otsese nakatamise viiruspartiklitega (Fang L jne, 2005). 

Võimalus koekultuuris eksperimenteerida HPV nakkuse elulähedase mudeliga tuleks kindlasti 

kasuks ka võimalikes varajastes ravimikatsetustes, kuna see võimaldab saata edasistesse 

etappidesse põhjalikumalt läbiuuritud ja kontrollitud ravimikandidaadi, mis suurendab 

tõenäosust, et uuritavad kandidaadid on tõepoolest efektiivsed ning hoiaks kokkuvõttes ka 

raha kokku. 

24

Praegu kasutatakse HPV elutsükli uurimisel peamiselt inimeste papilloomiviirustega 

nakatatud epiteelkoe siirdamist immuunpuudulikele hiirtele või organotüüpset parvkultuuri. 

Inimese epiteeli siirdamine immuunpuudulikele hiirtele võeti esmakordselt kasutusse Kreideri 

jne poolt 1985. aastal (Fang L jne, 2005). Inimese epiteeli õhendatud tükikesi inkubeeriti 

rakuvabas viiruse ekstraktis, mis pärines genitaalpiirkonna soolatüügaste käes vaevlevatelt 

patsientidelt, ning siirdati hiirte neerude fibrooskihnu alla. Pärast 3 kuu pikkust inkubatsiooni 

arenesid nendesse piirkondadesse viirusepartikleid produtseerivad epiteelsed tsüstid, mis 

sarnanesid loomulikult esinevate suguorganite kondüloomidega. Selline mudel on laialt 

kasutatav viirus produktsiooni, papilloomi tekkega seostuvate molekulaarsete sündmuste ja 

viiruse-vastaste ainete toime uurimisel. Kuid siirdamise meetodi kasutamist piirab asjaolu, et 

nakkust ei saa esile kutsuda HPV DNA abil, kuna kõrge riski papilloomiviiruste geneetilist 

materjali on kliinilisest materjalist raske kätte saada ja lisaks välistab see viiruse elutsükli 

uurimise genoomi manipulatsiooni kaudu (Fang L jne, 2005). 

Organotüüpne parvkultuur koosneb epiteelsetest rakkudest, mis on külvatud fibroblaste 

sisaldava kollageenmaatriksi peale. Kogu kompleks asub raamistikul ning seda toidetakse 

altpoolt söötmega. Selline parvkultuur jäljendab lähedaselt epiteelkoe diferentatsiooni ja 

ülesehitust ning võimaldab viia läbi viiruse päriliku materjali geneetilist analüüsi ning 

elutsükli uuringuid. Epidermaalsete rakkude allikana kasutatakse kas naha biopsiatest 

eraldatud rakke või sobivaid keratinotsüütide rakuliine. Kuna inimese primaarsed 

keratinotsüüdid on piiratud elueaga, mille jooksul HPV ei jõua parvkultuuris lõpetada 

produktiivset elutsüklit, kasutatakse harilikult immortaliseeritud rakuliine, kuigi sellised 

rakuliinid ei pruugi alati järgida normaalset keratinotsüütide diferentseerumismustrit (Fang L 

jne, 2005). 

25

Joonis 7. Organotüüpse parvkultuuri skeem. Joonis võetud H.J. Starki jne artiklist 

Organotypic cocultures as skin equivalents: A complex and sophisticated in vitro system, 

2004. 

Diferentseeruma suunatud tüvirakkude kasutamine võiks olla inimese papilloomiviiruse 

uurimisel nende kahe meetodi alternatiiviks. Kuna tüvirakkude oluline tunnus on võime 

ennast pidevalt uuendada, siis peaks nende pika-ajaline säilitamine laboritingimustes olema ka 

küllaltki lihtne. Samas tuleks arvesse võtta peatükis 2.1.1 välja toodud muutuseid, mis 

tüvirakkude populatsioonis koekultuuris mitme põlvkonna jooksul toimuvad (Maitra A. jne, 

2005), kuna need võivad mõjutada katsetulemusi (eriti kui uuritakse HPV infektsiooni rolli 

vähitekke protsessis) ning viia valede järeldusteni. 

Diferentseeruma on võimalik suunata embrüonaalseid tüvirakke, naha tüvirakke ning isegi 

organismi teistest kudedest pärit tüvirakke, mis on võimelised keratinotsüütideks transdiferentseeruma. 

3.1 Embrüonaalsete tüvirakkude diferentseerimine 

Kõige olulisem hES rakkude kasutamise eelis on nende surematus ja võime piiramatult iseuueneda, 

mis võimaldab neil anda piiramatus koguses diferentseerunud keratinotsüüte või 

nende eellasrakke. Seoses mitmete eetiliste probleemidega, mis nende kasutamist 

ümbritsevad, võib embrüonaalsete tüvirakkude saamine aga osutuda probleemseks. hES 

rakkude puhul on ka väga tõenäoline spontaanne diferentseerumine mitte-soovitud 

rakuliinideks ning sellega kaasnev diferentseerumise vähenenud efektiivsus. 

26

3.2 Koespetsiifiliste tüvirakkude diferentseerimine 

Multipotentsed koespetsiifilised tüvirakud on omadustelt ilmselt küllaltki sarnased 

embrüonaalsete tüvirakkudega: suure klonogeense potentsiaaliga ja võimelised 

diferentseeruma mitmeteks erinevateks rakutüüpideks. On teada, et karvafolliikuli 

väljasopistuses on multipotentseid tüvirakke, kuid nende hulk seal on küsitav, mistõttu on 

tõenäoline, et enne võimalikku praktilist kasutamist tuleb tõeliselt multipotentsed rakud 

naaberrakkude seast eristada ja eraldada. On avaldatud ka palju artikleid selle kohta, et 

koespetsiifiliste tüvirakkude enese-uuendamise potentsiaal võib olla piiratud ning aja jooksul 

väheneda (Heng B.C. jne, 2005). 

Kuna naha tüvirakud on pärit inimeste koeproovidest, tuleb neid kultuure testida 

infektsiooniliste patogeenide vastu. Eriti suur on oht, et rakupopulatsioon võib olla saastunud 

seni tundmatute või alles arenevate haigustekitajatega. Samuti on tõenäoline, et elu jooksul on 

koespetsiifilistesse tüvirakkudesse kogunenud geneetilise materjali kahjustusi. Mõlemad 

faktorid võivad laboratoorsete uuringute käigus viia ekslike tulemusteni (Heng B.C. jne, 

2005). 

Kuna naha tüvirakkudel on juba teatud eeldused diferentseeruda keratinotsüütideks, on nende 

kasutamine efektiivsem ning kergem kui embrüonaalsete tüvirakkude kasutamine. Kuid samal 

põhjusel on raskendatud teistest kudedest pärit tüvirakkude trans-diferentseerimine (Heng 

B.C. jne, 2005). 

3.3 Tüvirakkude kultiveerimise eeldused 

Nii embrüonaalsete kui ka koespetsiifiliste tüvirakkude puhul on oluline doonorite 

meditsiinilise tausta kindlakstegemine ja kirjaliku nõusoleku omandamine enne rakuliinide 

loomist. 

Rakuliine on soovitav kultiveerida tundmatutest komponentidest vabas keskkonnas, 

soovitatavalt kasutades inimeselt pärit toiterakke (feeder cells) ning ainult täpselt teadaoleva 

koostisega söötmeid. Igasuguste tundmatute ja teistelt organismidelt peale inimese pärinevate 

komponentide sisaldumisega rakukultuuris kaasneb ka oht seni identifitseerimata patogeenide 

ülekandeks ning suureneb kasvukeskkonna varieeruvus, mis võib oluliselt mõjutada 

katsetulemusi. Seetõttu peaksid kasutatavad söötmed olema eelistatult seerumi-vabad või 

27

sisaldama kunstlikke seerumi asendajaid, mille keemiline koostis oleks täpselt kindlaks 

määratud. 

Kuna ilma seerumita rakkude kasvatamisel on mitmeid puudusi, nagu rakkude aeglasem 

jagunemine, apoptootiliseks muutumine ja halvem kinnitumine substraadile, siis oleks kasulik 

kasutada seerumi asendajaid (Heng B.C. jne, 2004). 

3.4 Tüvirakkude diferentseerimise suunamise etapid 

Tüvirakkude diferentseerimisel keratinotsüütideks on 3 peamist etappi: (i) tüvirakkudes 

keratinotsüütideks diferentseerumise pühendumise esilekutsumine, (ii) pühendunud eellaste 

eristamine ja puhastamine, (iii) pühendunud eellasrakkude paljundamine ja lõplik 

diferentseerimine. 

4. TÜVIRAKKUDE DIFERENTSEERUMISE SUUNAMISE STRATEEGIAD 

4.1 Keratinotsüütideks diferentseerumisele pühendumise indutseerimine 

Keratinotsüütideks diferentseerumisele pühendumine on vajalik ainult embrüonaalsete 

tüvirakkude ja nende koespetsiifiliste tüvirakkude puhul, mis ei ole nahast pärit. Naha 

tüvirakkudel on juba olemas eeldused keratinotsüütideks arenemiseks (Heng B.C. jne, 2005). 

4.1.1 Kindla koostisega keskkonna kasutamine 

Üks võimalus kutsuda esile tüvirakkude diferentseerumist keratinotsüütideks on kasvatada 

neid kindlaks määratud koostisega keskkonnas, mis sisaldab tsütokiine, kasvufaktoreid, 

kemikaale ja rakuvälise maatriksi ehk ECMi (extracellular matrix) komponente, mis 

soodustavad vastavat diferentseerumist. Selle meetodi suurim puudus on ebaefektiivsus, kuna 

paljud kasutatavatest komponentidest soodustavad mitmeteks rakutüüpideks 

diferentseerumist, seega tekiks lisaks soovitud keratinotsüütide eellasrakkudele veel mitmete 

teiste rakuliinide eellasi. Parimal juhul saaks kasvukeskkonna koostist katse-eksitus meetodil 

optimeerida nii, et võimalikult palju tekiks soovitud rakuliini eellasi, kuid igal juhul nõuab 

meetod laiaulatuslikku rakkude selekteerimist ja sellele järgnevat paljundamist, mis teeb selle 

nii aeganõudvaks kui ka töömahukaks protsessiks (Heng B.C. jne, 2005). 

28

Hiirte peal on õnnestunud indutseerida tüvirakkude pühendumine ja diferentseerumine 

keratinotsüütideks kasutades kasvukeskkonda, mis sisaldas BMP-4 (bone morphogenetic 

protein-4), C vitamiini ja nii inimeste kui ka hiirte fibroblastidelt pärit ECMi (Coraux C jne, 

2003). 

4.1.2 Geneetiline modulatsioon 

Tüvirakkude transfekteerimine keratinotsüütideks diferentseerumist soodustavaid 

signaalvalke kodeerivate DNA konstruktiga oleks efektiivsem meetod pühendunud 

eellasrakkude saamiseks. Huvipakkuvad kandidaadid oleksid Wnt-signaaliraja poolt 

kontrollitavad Lef1/Tcf perekonna transkriptsioonifaktorid, c-myc ning 

transkriptsioonifaktorid p63 (Tap63) ja GATA-3 (Heng B.C. jne, 2005). 

Geneetilise modulatsiooni puhul oleks soovitav kasutada promootoreid, mida saab väliste 

kemikaalide, kuumašoki või valguse abil sisse ja välja lülitada, kuna nii on võimalik 

sisestatud konstruktidelt toimuvat valgusünteesi kontrollida. 

On näidatud, et transkriptsioonifaktorid on võimelised ilma signaalpeptiidi olemasoluta 

rakkude vaheliste otseste kontaktide kaudu rakust rakku liikuma ning toimima parakriinsete 

regulaatoritena (Prochiantz A ja Joliot A, 2007). Kui lisada transfekteeritavatele 

konstruktidele järjestused, mis kodeerivad sellist aktiivsust võimaldavat domääni, saaks 

oluliselt suurendada geneetilise modulatsiooni meetodi efektiivsust keratinotsüüdiks 

diferentseerumisele pühendumisele (Heng B.C. jne, 2005). 

4.2 Pühendunud eellasrakkude selekteerimine ja sorteerimine 

Naha tüvirakkude puhul saab neid epidermaalse koe jääkidest puhastada kiire seondumise abil 

tüüp IV kollageenile (Heng B.C. jne, 2005). Embrüonaalsete ja teistest kudedest pärit 

tüvirakkude puhul saab selekteerimiseks kasutada nii spetsiifilisi pinnamarkereid kui ka 

keratinotsüütideks diferentseerumisele pühendumiseks vajalike endogeensete geenidega 

liidetud markergeenide ekspressiooni. 

Pinnamarkereid kasutades saab pühendunud eellasrakke sorteerida spetsiifilisi märgistatud 

antikehi kasutades kas fluerestsentsi (FACS ehk fluorescence-activated cell sorting) või 

magneetilise afiinsuse (MACS ehk magnetic affinity cell sorting) abil. Huvipakkuvateks 

29

pinnamarkeriteks on β1-integriin ning kõrge α6-integriini ekspressioon kombineeritult madala 

transferriini retseptori ekspressiooniga (Heng B.C. jne, 2005). 

Markergeenidena on laialdast kasutust leidnud GFP (green fluorescent protein) ja neomütsiini 

resistentsuse kassett (Heng B.C. jne, 2005). Markergeenid ei pea olema otseselt seotud 

diferentseerumiseks vajaliku geeniga, see võib olla koespetsiifilise promootori kontrolli all. 

Samuti võib ebasoovitavale koele tüüpilise promootori kontrolli all viia rakkudesse sisse 

suitsiidigeene kodeerivad konstrukte (Hentze H. jne, 2006). 

4.3 Pühendunud eellasrakkude lõpliku diferentseerumise indutseerimine 

Pühendunud eellasrakud on hoolimata eeldusele diferentseeruda just keratinotsüütideks siiski 

võimelised arenema ka teisteks rakuliinideks, mistõttu on kasulik nende edasist 

diferentseerumist suunata. Selles staadiumis rakud on küll jagunemisvõimelised, kuid ei 

suuda oma populatsiooni uuendada. 

4.3.1 Kindla koostisega keskkonna kasutamine 

Ka pühendunud eellasrakkude diferentseerumist indutseeriv keskkond peaks olema täpselt 

defineeritud koostisega ning eelistatult seerumivaba või sisaldama kunstlikku seerumi 

asendajat. Diferentseerumist soodustava keskkonna loomisel on oluline kasutada söötmes 

sobivaid tsütokiine ja kasvufaktoreid. 

Kõige levinumad primaarsete keratinotsüütide kultiveerimisel kasutatavad tsütokiinid on 

epidermaalne kasvufaktor EGF (epidermal growth factor) ning insuliin või insuliini-laadse 

kasvufaktori IGF (insuline-like growth factor) isovormid (Heng B.C. jne, 2005). Nii EGFi kui 

ka IGFi kohta on näidatud, et nad mängivad tähtsat rolli naha homöostaasis (Tavakkol A jne, 

1999), EGF perekonna liige epireguliin on aga üks keratinotsüütide autokriinsetest 

kasvufaktoritest (Shirakata Y jne, 2000). FGF (fibroblast growth factor) ning talle 

struktuurselt sarnane KFG (keratinocyte growth factor) on samuti keratinotsüütide 

jagunemise ja morfogeneesi stimulaatorid (Heng B.C. jne, 2005). On näidatud, et 

transformeerivate kasvufaktorite (TGF ehk transforming growth factor) perekonna liige BMP 

mõjub soodustavalt keratinotsüütideks diferentseerumisele (D’Souza S.J. jne, 2001). 

Keratinotsüütideks diferentseerumise indutseerijatena on veel ära märgitud tüviraku faktorit, 

angiopoietiiniga seotud kasvufaktorit, granulotsüütide/ markofaagide kolooniaid stimuleeriv 

30

faktor, kasvu diferentatsiooni faktor, tümotsüüte (T-raku eellasrakk) aktiveeriv faktor, kasvaja 

nekroosi faktor-α, interleukiin-1 ja närvi kasvufaktor (Heng B.C. jne, 2005). 

Lisaks tsütokiinidele ja kasvufaktoritele on võimalik kasutada ka mitte-valgulisi keemilisi 

lisandeid. Sellised kemikaalid on valkudest stabiilsemad ning püsivad söötmes kauem 

aktiivsena, mis on kasulik pikema in vitro koekultuuris hoidmise juures. Samuti saab selliseid 

ühendeid keemiliste reaktsioonide abil lihtsalt toota, mis on võrreldes valkude tootmisega 

palju kergem, ning nad ei vaja ka post-translatsioonilist modifikatsiooni. 

Keratinotsüütideks diferentseerumist soodustavad askorbiinhape, naatrium butüraat, 

staurosporiin, keramiid, kolesterooli derivaadid nagu oksüsterool, farnesool, kaltsiumi 

retseptori aktivaator NSP R-467, 1, 25-dihüdroksüvitamiin D ja selle analoogid, retinoolhape, 

prostaglandiin 12 ja selle analoogid, nikotiin, biotiin ja arotinoid etüülester. Lisaks oma 

stimuleerivat efekti söötme kõrgendatud kaltsiumisisaldus (Heng B.C. jne, 2005). 

4.3.2 Ekstratsellulaarse maatriksi kasutamine 

Organismis koosneb nahk mitmetest erinevatest rakutüüpidest, mis on ümbritsetud rakuvälise 

maatriksi ehk ECMi poolt. ECMi ülesandeks on säilitada koe strukturaalset terviklikkust, kuid 

tal on ka füsioloogiline roll rakkude mikrokeskkonna mõjutamise kaudu. 

Naha ECM koosneb peamiselt üheksast kollageeni tüübist, millest valdav on tüüp I. Maatriksi 

mitte-kollageensed komponendid on ehituslikke ülesandeid täitvad valgud nagu fibronektiin, 

laminiin ja elastiin koos erinevate proteoglükaanide ja glükoosaminoglükaanidega (GAGid 

ehk glycosaminoglycans) (Heng B.C. jne, 2005). 

Vastava ekstratsellulaarse maatriksi kasutamine soodustaks kindlasti pühendunud 

eellasrakkude lõplikku diferentseerumist keratinotsüütideks. Kuigi ECM võib koosneda nii 

loomulikult nahas esinevatest komponentidest kui ka sünteetilistest materjalidest, on oluline, 

et see oleks rakukultuuris kasutamiseks sobiv ega oleks tsütotoksiline. 3D maatriksite 

kasutamine või rakukultuuri kasvatamine kahe maatriksi kihi vahel jäljendab loomulikumalt 

naha struktuuri ning on näidatud, et sellised kultuurid on edukamad diferentseerunud 

keratinotsüütide fenotüübi säilitamisel kui tavalised 2D kultuurid (Heng B.C. jne, 2005). 

Keratinotsüütide kinnitumine ja bioloogilised funktsioonid paranevad ka koos ECMi 

suurenenud konarlikkuse, hüdrofiilsuse ja poorsusega (Heng B.C. jne, 2005). Olulised on ka 

maatriksi elektrostaatiline laeng ning geomeetriline konfiguratsioon (Heng B.C. jne, 2004). 

31

Et paremini imiteerida organismis esinevat keskkonda oleks soovitatav, et maatriks koosneks 

loomulikult naharakkude ECMis esinevatest komponentidest nagu kollageen. On kindlaks 

tehtud, et kollageeni maatriksi kasutamine aitab säilitada keratinotsüütide fenotüüpi 

koekultuuri tingimustes, kuid on ka näidatud, et 3D kollageeni maatriksi ning sobivate söötme 

lisanditega saab panna reesusahvide embrüonaalseid tüvirakke diferentseeruma 

keratinotsüütideks (Chen S.S. jne, 2003). 

Et parandada peamiselt kollageenist koosneva ECMi omadusi, võib sellele lisada veel 

erinevaid teisi ühendeid nagu polülaktiid glükoliid, alginaat, fibronektiin, elastiin, polü-ιlüsiin, 

GAGid või kitosaan (Heng B.C. jne, 2005). Naha ekstratsellulaarse maatriksi 

mittevalgulised komponendid ongi peamiselt GAG molekulid, mis on enamuses sulfaatrühma 

sisaldavad pika hargneva ahelaga suhkrumolekulid. 

Lisaks üksikute ECMi komponentide kasutamisele võib pühendunud eellasrakkude lõpliku 

keratinotsüütideks diferentseerumise soodustamiseks kasutada ka ekstratsellulaarse maatriksi 

heterogeenseid segusid, näiteks Engelbeth-Swarmi hiire sarkoomi basaalmembraani ekstrakti, 

inimese fibroblastide ECMi ekstrakte või isegi külmutatud inimese nahka (Heng B.C. jne, 

2005). 

ECMi komponentidena on kasutatud ka nahas mitteleiduvaid ühendeid nagu želatiin, 

kitosaan, fibriin ja alginaat. Kasutada võib ka sünteetilisi ühendeid nagu polüglükoolhape, 

polüetüleenglükool ja dektstraan (Heng B.C. jne, 2005). 

4.3.3 Ko-kultuuride kasutamine 

Ko-kultuuride kasutamise peamiseks eeliseks on erinevate rakutüüpide vahel esinevad 

lähedased kokkupuuted, mis võib viia pühendunud eellasrakkude lõplikuks 

diferentseerumiseks vajalike molekulaarsete signaalide efektiivsema ülekandumiseni. Samas 

suureneb sellistes kultuurides ka risk patogeenide, eriti viiruste ülekandumiseks. 

Nahk koosneb peamiselt keratinotsüüte sisaldavast marrasnahast ja dermaalseid fibroblaste 

sisaldavast pärisnahast, mida lahutab basaalmembraan. Seega jäljendaks keratinotsüütide 

eellaste kultiveerimine koos dermaalsete fibroblastidega loomulikku koekeskkonda ning 

mõjuks positiivselt eellasrakkude diferentseerumisele. 

32

Uuringud on näidanud, et keratinotsüütide eellasrakkude kasvatamine ko-kultuuris 

fibroblastidega suurendab nii keratinotsüütide diferentseerumisele iseloomulike markerite 

ekspressiooni kui ka ECMi ja basaalmembraani komponentide sünteesi. Lisaks täheldati 

selliste ko-kultuuride puhul naha-laadsete struktuuride teket (Heng B.C. jne, 2005). 

Keratinotsüütide eellasrakkude lõplikku diferentseerumist soodustab ka ko-kultuur 

adipotsüütidega (Sugihara H jne, 2001). 

Kuna primaarsed dermaalsed fibroblastid pärinevad annetatud koeproovidest, ei ole need alati 

vabalt kättesaadavad. Alternatiiv oleks kasutada nende asemel fibroblastide rakuliine. On 

näidatud, et üks selline rakuliin, mis pandi üleekspresseerima Sonic hedgehog (Shh) valku, 

kiirendas keratinotsüütide paljunemist ja diferentseerumist (Kameda T jne, 2001). 

Ko-kultuuride kasutamisel on vaja pärast erinevad rakutüübid üksteisest lahutada, mis on 

tülikas protsess, samuti on nende puhul oht, et erinevad rakutüübid võivad ühineda (Ying 

Q.L. jne, 2002). Neid probleeme saaks vältida kui hoida erinevad rakupopulatsioonid 

poolläbilaskva filtri abil eraldatuna, kuna rakkude otsene füüsiline kontakt ei ole alati 

hädavajalik. On ka võimalik kasvatada keratinotsüütide eellasi söötmes, mida on eelnevalt 

kasutatud fibroblastide kasvatamisel ning mis peaks sisaldama kõik diferentseerumist 

soodustavaid ühendeid, kuid need ühendid võivad söötmes kiiresti laguneda või oma 

funktsionaalsuse muul viisil kaotada. 

4.3.4 Gap-ühenduste moodustumise soodustamine 

Gap-ühenduste vahendatud rakkudevaheline paardumine mängib olulist rolli epidermise 

homöostaasis. Tüvirakkudel puuduvad ühendused teiste rakkudega ning arvatakse, et nende 

diferentseerumise käigus väljakujunemine osaleb ka diferentseerumisprotsessi 

koordineerimisel. Seega on võimalik, et suurendades gap-ühenduste hulka saab soodustada 

pühendunud eellasrakkude diferentseerumist. 

On näidatud, et rakkude vahelist paardumist soodustavad mitmed ühendid nagu dibutüül 

cAMP, madala tihedusega lipoproteiinid ja dopamiin (Heng B.C. jne, 2005). Samas puuduvad 

andmed selle kohta, kas gap-ühenduste suurem arv soodustab keratinotsüütideks 

diferentseerumist või mitte. 

33

4.3.5 Tsütoplasmaatiliste ekstraktide kasutamine ja cybridization 

Pühendunud eellasrakkude keratinotsüütideks diferentseerumist võib teoreetiliselt esile 

kutsuda, kui töödelda permeabiliseeritud rakke lõplikult diferentseerunud keratinotsüütide 

kontsentreeritud tsütoplasma ekstraktiga. Kuna tsütoplasmaatilise ekstrakti tegemisel on 

võimalik, et labiilsed rakusisesed signaalmolukulid protsessi käigus hävivad, on alternatiivina 

võimalik liita eellasraku tuum ilma tuumata keratinotsüüdiga. Tekib niinimetatud 

tsütoplasmaatiline hübriid ehk cybrid. 

Mõlema meetodi puhul arvatakse, et tsütoplasmas leiduvad transkriptsioonifaktorid ja 

signaalmolekulid on võimelised seni lõplikult diferentseerumata tuuma ümber 

programmeerima. Nende meetodite puuduseks on patogeenide ülekande, aneuploidsuse ja 

raku strukturaalsete häirete tekke oht ning madal efektiivsus. Eriti ebaefektiivne on 

cybridization, kuna tekkivad hübriidrakud on madala elujõulisusega (Heng B.C. jne, 2004). 

4.3.6 Muud diferentseerumist soodustavad tegurid 

Keratinotsüütide eellasrakkude diferentseerumist saab suunata ka mitmete füüsikaliste 

stiimulite abil. 

On teada, et nii endogeensetel elektriväljadel kui ka madala intensiivsusega elektrivoolul on 

stimuleeriv mõju haavade parandamisele (Heng B.C. jne, 2005). Samuti on näidatud, et 

elektriväljad soodustavad primaarsete keratinotsüütide ja keratinotsüütide eellasrakkude 

diferentseerumist (Hinsenkamp M jne, 1997). Ka madala sagedusega pulseerivad 

magnetväljad mõjuvad positiivselt primaarsete keratinotsüütide paljunemisele (Manni V jne, 

2002) ning diferentseerumisele (Manni V jne, 2004). 

Keratinotsüütide diferentseerumise regulatsiooniga on seotud mitmed kuumašoki valgud ehk 

HSPd (heat shock protein) nagu HSP 25, HSP 27 ja HSP 70 (Heng B.C. jne, 2005). Siiski ei 

ole uuritud kõrge temperatuuri mõju naharakkude eellaste lõpliku diferentatsiooni 

suunamisele. 

Nii B ultraviolettkiirgus (UV-B) kui ka tsükliline mehhaaniline venitamine stimuleerivad 

keratinotsüütideks diferentseerumist, kusjuures mõlemad teevad seda proteiinkinaas C 

signaalraja kaudu. Lisaks mõjuvad soodustavalt vähendatud suhteline niiskus ja oksüdatiivne 

stress (Heng B.C. jne, 2005). 

34

KOKKUVÕTE 

Käesolev töö tõi välja seosed inimese papilloomiviiruse infektsiooni ja naha tüvirakkude 

vahel ning tutvustas erinevaid meetodeid, mille abil on võimalik indutseerida tüvirakke 

keratinotsüütideks diferentseeruma. 

Papilloomiviirused sisenevad organismi epiteel vigastuste kaudu, mille parandamisel on 

olulised karvafolliikuli väljasopistuses paiknevad tüvirakud. Kuna keratinotsüüdid on rakud, 

mis on määratud surema, saab pikaajaline HPV infektsioon tekkida siis, kui viirus siseneb 

aeglaselt jagunevasse basaalkihis paiknevasse tüvirakku. 

Produktiivne infektsioon toimub vaid siis, kui peremeesrakk läbib keratinotsüütide lõpliku 

diferentseerumise raja. Lisaks on HPV-16 puhul näidatud, et papilloomiviirus on võimeline 

pärssima peremeesraku diferentseerumist in vitro. 

Seoses HPV infektsiooni ja naha tüvirakkude seotusele oleks väga kasulik, kui 

papilloomiviirust saaks uurida tüvirakkude koekultuuris, mida saaks indutseerida 

keratinotsüütideks diferentseeruma. 

Tüvirakkude keratinotsüütideks diferentseerumisel on 3 peamist etappi: (i) tüvirakkudes 

keratinotsüütideks diferentseerumise pühendumise esilekutsumine, (ii) pühendunud eellaste 

eristamine ja puhastamine, (iii) pühendunud eellasrakkude paljundamine ja lõplik 

diferentseerimine. 

Diferentseerumist saab esile kutsuda kultiveerides rakke kindlas sobiva koostisega 

kasvukeskkonnas, kasutades geneetilist modulatsiooni, ko-kultuure, vastava ekstratsellulaarse 

maatriksi komponente, diferentseerunud rakkude tsütoplasmaatilisi ekstrakte või 

tsübridiseerimist (cybridization), Gap-ühenduste moodustumise soodustamist ning sobivaid 

füüsikalisi stiimuleid. 

35

THE POSSIBILITIES OF USING STEM CELLS IN HUMAN PAPILLOMAVIRUS 

RESEARCH 

RÉSUMÉ 

This paper concentrated on emphasizing the role of stem cells in human papillomavirus 

(HPV) infection and discussing possible methods of inducing stem cell differentiation into the 

keratinocyte lineage in vitro. 

Stem cells are connected with HPV in numerous ways. First, human papillomavirus enters the 

epithelium through microlesions and wounds, and it is very likely that upon entry it comes 

into contact with stem cells that are stimulated to migrate to the damaged area to take part in 

the re-epithelialisation of the wound. Second, due to the peculiarities of the keratinocyte life 

cycle it is only possible for HPV to establish a permanent and productive infection when 

infecting the stem cells of the basal layer. In case of HPV-16 it has been shown that 

papillomaviruses are capable of altering human epithelial cell differentiation in vitro. 

All that indicates that human papillomavirus research might benefit from a model system 

where stem cells are induced to differentiate into the keratinocyte lineage in vitro. 

Inducing differentiation into the keratinocyte lineage is a 3 step process: (i) inducing 

commitment of stem cells into keratinocyte progenitors, (ii) selection and purification of the 

committed keratinocytes, (iii) proliferation and terminal differentiation of keratinocyte 

progenitors. 

The differentiation process can be directed using cultivation of stem cells in a defined culture 

milieu with suitable cytokines and growth factors, genetic modulation, co-cultures, suitable 

extracellular matrix components, cytoplasmic extracts of differentiated keratinocytes or 

cybridization, induced gap-junction formation and appropriate physical stimuli. 

36

KIRJANDUSE LOETELU 

Alonso, L. and Fuchs, L. (2003). Stem cells of the skin epithelium. PNAS 100:11830-11835 

Ault, K.A. (2006). Epidemiology and Natural History of Human Papillomavirus Infections in 

the Female Genital Tract. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2006:1-5 

Bosch, F.X., Lorincz, A., Munoz, N., Meijer, C.J.L.M. and Shah, K.V. (2002). The causal 

relation between human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathol. 55:244-265 

Chen, S.S., Revoltella, R.P., Papini, S., Michelini, M., Fitzgerald, W., Zimmerberg, J. and 

Margolis, L. (2003).Multilineage Differentiation of Rhesus Monkey Embryonic Stem Cells in 

Three-Dimensional Culture Systems. Stem Cells 21:281-295 

Coraux, C., Hilmi, C., Rouleau, M., Spadafora, A., Hinnrasky, J., Ortonne, J.-P., Dani, C. and 

Aberdam, D. (2003). Reconstituted skin from murine embryonic stem cells. Curr. Biol. 

13(10):738-853 

Culp, T.D. and Christensen, N.D. (2004). Kinetics of in vitro adsorption and entry of 

papillomavirus virions Virology 319:152-161 

Cyranoski, D. (2008). Stem cells: 5 things to know before jumping on the iPS bandwagon. 

Nature 452:406-408 

D’Souza, S.J.A., Pajak, A., Balazsi, K. and Dagnino, L. (2001). Ca2+ and BMP-6 Signaling 

Regulate E2F during Epidermal Keratinocyte Differentiation. The Journal of Biological 

Chemistry 276(26):23531-23538 

Doorbar, J. (2005) The papillomavirus life cycle. J. Clinical. Virol. 32:7-15 

Durcova-Hills, G. (2008). Induced reprogramming of human somatic cells into pluripotency: 

a new way how to generate pluripotent stem cells. Differentiation 76:323-325 

37

Fang, L., Meyers, C., Budgeon, L.R. and Howett, M.K. (2006). Induction of productive 

human papillomavirus type 11 life cycle in epithelial cells grown in organotypic raft cultures. 

Virology 347:28-35 

Fehrmann, F. and Laimins, L.A. (2003). Human papillomaviruses: targeting differentiating 

epithelial cells for malignant transformation. Oncogene 22:5201-5207 

Frazer, I.H. (2004). Prevention of cervical cancer through papillomavirus vaccination. Nature 

Reviews Immunology 4:46-54 

Fuchs, E. (2007). Scratching the surface of skin development. Nature 445:834-842 

Heng B.C., Cao, T., Liu, H. and Phan, T.T. (2005). Directing stem cells into the keratinocyte 

lineage in vitro. Exp. Dermatol. 14:1-16 

Heng, B.C., Cao, T., Stanton, L.W., Robson, P. and Olsen, B. (2004). JBMR 19 (9):1379- 

1394 

Hentze, H., Graichen, R. and Colman, A. (2006). Cell therapy and the safety of embryonic 

stem cell-derived grafts. Trends in Biotechnology 25(1):24-32 

Hinsenkamp, M., Jercinovic, A., de Graef, C., Wilaert, F. and Heenen, M. (1997). Effects of 

Low Frequency Pulsed Electrical Current on Keratinocytes In Vitro. Bioelectromagnetics 

18:250-254 

Hochedlinger, K. and Jaenisch, R. (2006). Nuclear reprogramming and pluripotency. Nature 

441:1061-1067 

Huelsken, J., Vogel, R., Erdmann, B., Cotsarelis, G. and Birchmeier, W. (2001). β-Catenin 

Controls Hair Follicle Morphogenesis and Stem Cell Differentiation in the Skin. Cell 

105:533-545 

Ito, M., Liu, Y., Yang, Z., Nguyen, J., Laing, F., Morris, R.J. and Cotsarelis, G. (2005). Stem 

cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the 

epidermis. Nature Medicine 11(12):1351-1354 

38

Kadaja, M., Sumerina, A., Verst, T., Ojarand, M., Ustav, E. and Ustav, M. (2007). Genomic 

instability of the host cell induced by the human papillomavirus replication machinery. 

EMBO J. 26:2180-2191 

Kameda, T., Hatakeyama, S., Terada, K. and Sugiyama, T. (2001). Acceleration of the 

formation of cultured epithelium using the sonic hedgehog expressing feeder cells. Tissue 

Eng. 7(5):545-555 

Klug, S.J., Hukelmann, M. and Blettner, M. (2008). Knowledge about infection with human 

papillomavirus: A systematic review. Preventive Medicine 46: 87-98 

Lechler, T. and Fuchs, E. (2005). Asymmetric cell divisions promote stratification and 

differentiation of mammalian skin. Nature 437:275-280 

Li, M., Beard, P., Estes, P.A., Lyon, M.K. and Garcea, R.L. (1998). Intercapsomeric Disulfide 

Bonds in Papillomavirus Assembly and Disassembly. Journal of Virology 72:2160-2167 

Maitra, A., Arking, D.E., Shivapurkar, N., Ikeda, M., Stastny, V., Kassauei, K., Sui, G., 

Cutler, D.J., Liu, Y., Brimble, S.N., Noaksson, K., Hyllner, J., Schulz, T.C., Zeng, X., Freed, 

W.J., Crook, J., Abraham, S., Colman, A., Sartipy, P., Matsui, S.I., Carpenter, M., Gazdar, 

A.F., Rao, M. and Chakravarti, A. (2005). Genomic alterations in cultures human embryonic 

stem cells. Nature Genetics 37(10):1099-1103 

Manni, V., Lisi, A., Pozzi, D., Rieti, S., Serafino, A., Giuliani, L. E. and Grimaldi, S. (2002). 

Effects of Extremely Low Frequency (50 Hz) Magnetic Field on Morphological and 

Biochemical Properties of Human Keratinocytes. Bioelectromagnetics 23:298-305 

Manni, V., Lisi, A., Rieti, S., Serafino, A., Ledda, M., Giuliani, L., Sacco, D., D’Emilia, E. 

and Grimaldi, S. (2004). Low Electromagnetic Field (50 Hz) Induces Differentiation on 

Primary Human Oral Keratinocytes (HOK). Bioelectromagnetics 25:118-126 

McCance, D.J., Kopan, R., Fuchs, E. and Laimins, L.A (1988) Human papillomavirus type 16 

alters human epithelial cell differentiation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7169-7173 

39

Miller, S.J., Lavker, R.M. and Sun, T.T. (2005). Interpreting epithelial cancer biology in the 

context of stem cells: Tumor properties and therapeutic implications. Biochimica et 

Biophysica Acta 1756:25-52 

Moody, C.A., Fradet-Turcotte, A., Archambault, J. and Laimins, L.A. (2007). Human 

papillomaviruses activate caspases upon epithelial differentiation to induce viral genome 

amplification. PNAS 104 (49):19541-19546 

Mountford, J.C. (2008). Human embryonic stem cells: origins, characteristics and potential 

for regenerative therapy. Transfusion Medicine 18:1-12 

Nguyen, H., Rendl, M. and Fuchs, E. (2006). Tcf3 Governs Stem Cell Features and Represses 

Cell Fate Determination in Skin. Cell 127:171-183 

Nodder, S. and Martin, P. (1997). Wound healing in embryos: A review. Anat. Embryol. 

195:215-228 

Prochiantz, A, and Joliot, A. (2003). Can transcription factors function as cell-cell signalling 

molecules? Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4(10):814-819 

Ratajczak, M.Z., Zuba-Surma, E.K., Wysoczynski, M., Wan, W., Ratajczak, J., Wojakowski, 

W. and Kucia, M. (2008). Hunt for pluripotent stem cell – Regenerative medicine search for 

almighty cell. Journal of Autoimmunity 30:151-162 

Shirakata, Y., Komurasaki, T., Toyoda, H., Hanakawa, Y., Yamasaki, K., Tokumaru, S., 

Sayama, K. and Hashimoto, K. (2000). Epiregulin, a Novel Member of the Epidermal Growth 

Factor Family, Is an Autocrine Growth Factor in Normal Human Keratinocytes. The Journal 

of Biological Chemistry 275(8):5748-5753 

Stanley, M. (2006). Immune responses to human papillomavirus. Vaccine 24S1:S1/16-S1/22 

Stark, H.J., Szabowski, A., Fusenig, N.E. and Maas-Szabowski, N. (2004). Organotypic 

cocultures as skin equivalents: A complex and sophisticated in vitro system. Biol. Proced. 

Online 6(1):55-60 

40

Sugihara, H., Toda, S., Yonemitsu, N. and Watanabe, K. (2001). Effects of fat cells on 

keratinocytes and fibroblasts in a reconstructed rat skin model using collagen gel matrix 

culture. British Journal of Dermatology 144:244-253 

Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, T. and Yamanaka, 

S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. 

Cell 131:861-872 

Tavakkol, A., Varani, J. and Elder, J.T. (1999). Maintenance of human skin in organ culture: 

role for insulin-like growth factor-1 receptor and epidermal growth factor receptor. Arch. 

Dermatol. Res. 291:643-651 

Ying, Q.L., Nichols, J., Evans, E.P. and Smith, A.G. (2002). Changing potency by 

spontaneous fusion. Nature 416:545-548 

Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie, 

J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I.I. and Thomson, J.A. (2007). Induced 

pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318:1917-1920 

Zhou, P., Byrne, C., Jacobs, J. and Fuchs, E. (1995). Lymphoid enhancer factor 1 directs hair 

follicle patterning and epithelial cell fate. Genes and Development 9:570-583 

41

KASUTATUD VEEBIAADRESSID 

http://www.pandasthumb.org/archives/2005/01/a-complex-regul.html 

42

Marit Orav

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?