Nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 (Synembryn) hiire postnataalses ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

ARENGUBIOLOOGIA ÕPPETOOL 

Katrin Ruisu 

Nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 (Synembryn) hiire 

postnataalses neurogeneesis 

Bakalaureusetöö 

Juhendajad: MSc Tambet Tõnissoo 

MSc Sirje Lulla 

TARTU 2009

SISUKORD 

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ..................................................................................... 5 

1.1. Neurogenees................................................................................................................ 5 

1.1.1. Neuraaltoru ja ventrikulaarne tsoon.................................................................... 5 

1.1.2. Migratsioon......................................................................................................... 5 

1.1.3. Neokorteksi areng ............................................................................................... 6 

1.1.4. Asümmeetriline rakujagunemine imetaja neuraalsetes eellasrakkudes .............. 7 

1.1.5. Postnataalne neurogenees ................................................................................... 9 

1.2. Nukleotiidivahetusfaktor Ric-8................................................................................... 9 

1.2.1. Biokeemiline funktsioon..................................................................................... 9 

1.2.2. Ric-8 funktsioon embrüogeneesis..................................................................... 10 

1.2.3. Ric-8 funktsioon närvisüsteemis....................................................................... 14 

1.3. SynapsinCre transgeenne hiireliin ............................................................................ 16 

2. EKSPERIMENTAALNE OSA ................................................................................ 19 

2.1. Eksperimentaalse töö eesmärgid............................................................................... 19 

2.2. Materjal ja metoodika ............................................................................................... 19 

2.2.1. Kasutatud hiireliinid.......................................................................................... 19 

2.2.2. Ristamine .......................................................................................................... 20 

2.2.3. Genotüpiseerimine ............................................................................................ 21 

2.2.4. SynICre;Ric-8 lacZ/lox hiireliini iseloomustamine ................................................ 22 

2.2.5. Külmlõikude valmistamine............................................................................... 22 

2.2.6. β-galaktosidaasi värvusreaktsioon koelõikudel ................................................ 23 

2.2.7 Pildistamine....................................................................................................... 23 

2.2. Tulemused................................................................................................................ 23 

2.2.1. Neurospetsiifilise SynICre;Ric-8 lacZ/lox hiireliini iseloomustamine................... 23 

2.2.2. SynapsinICre rekombinaasse aktiivsuse hindamine. ........................................ 25 

2.2.3. Ric-8 ja SynICre ekspressiooni võrdlus postnataalses (P1-P5) peaajus .......... 26 

2.3 Arutelu ..................................................................................................................... 31 

KOKKUVÕTE ................................................................................................................. 35 

2

Summary........................................................................................................................... 36 

Tänusõnad......................................................................................................................... 37 

KIRJANDUSE LOETELU............................................................................................... 38 

3

SISSEJUHATUS 

Tänapäeval on teadlased teinud suuri edusamme seoses neurospetsiifiliste 

haiguste tekke põhjuste ja võimaliku raviteraapia välja selgitamisel. Närvisüsteemi 

uurimiseks on välja töötatud üha täienevaid metoodikaid, mis võimaldavad selgust tuua 

neurogeneesi väga varajastesse etappidesse embrüogeneesis, neuronite 

diferentseerumisele, migratsioonile, sünaptogeneesile, neuronite apoptoosile, 

vananemisele, regeneratsioonile ja paljudesse muudesse olulistesse protsessidesse nii 

biokeemilisel kui bioloogilisel tasemel. Palju uut ja tänuväärset informatsiooni 

närvisüsteemis aset leidvate sündmuste interpreteerimisel on andnud erinevad 

loommudelid ja transgeenne tehnoloogia. Närvisüsteemi arengu ja mehhanismide 

uurimine toob esile pidevalt uusi olulisi komponente keerulises signalisatsiooni 

masinavärgis. Üheks silmapaistvaks rühmaks neuronite signalisatsioonil on 

heterotrimeersed G valgud ning nendega seotud aktivaatorid ja inhibiitorid, mis 

vahendavad signaali erinevatele efektormolekulidele, reguleerides sellega 

neurotransmitterite sekretsiooni ja sünaptilist ülekannet rakus. Väga oluliseks G valkude 

poolt vahendatud signalisatsiooni regulaatoriks on nukleotiidivahetusfaktor Ric-8. 

Katestes erinevate mudelorganismidega on näidatud, et Ric-8 funktsiooniks 

närvisüsteemis on retseptorist sõltumatu G valkude poolt vahendatud signaali 

võimendamine ja pikendamine rakus. Lisaks on näidatud, et Ric-8 mängib olulist rolli 

rakkude asümmeetrilises jagunemises neurogeneesis ja embrüogeneesis. Ric-8 

puudumine varajases embrüogeneesis on letaalne nii nematoodile, äädikakärbsele kui 

hiirele. 

Antud bakalaureusetöö teoreetilises osas antakse ülevaade imetaja 

kesknärvisüsteemi arengust ja nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 biokeemilisest ning 

bioloogilisest rollist erinevates mudelorganismides. Eraldi peatükis käsitletakse lähtuvalt 

praktilise töö spetsiifikast konditsionaalse hiireliini valmistamise metoodikat. 

Käesoleva uurimustöö praktilises osas iseloomustati neurospetsiifilist 

SynapsinICre;Ric-8 lacZ/lox konditsionaalset hiireliini. Lisaks kirjeldati Ric-8 ja 

SynapsinICre ekspressiooni vastsündinud (P1-P5) hiirepoegade peaajus. 

4

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

1.1. Neurogenees 

1.1.1. Neuraaltoru ja ventrikulaarne tsoon 

Selgroogsete närvisüsteemi arengu käigus paiknevad neuraalsed eellasrakud 

embrüos esilagu mediaalselt neuraalplaadina (ilmub hiire embrüos nähtavale u. E7.5). 

Rakkude kranio-kaudaalse pikenemise tulemusena toimub neuraalplaadi medio-lateraalne 

kitsenemine (Sadler, 2005). Neuraalplaat rullub neuraaltoruks, mille keskel paikneb 

õõnsus e. luumen, mis on tulevase aju ventrikulaarne süsteem ning seda vooderdavat 

rakukihti nimetatakse ventrikulaarseks tsooniks (VZ – ventricular zone). Enamus rakud 

arenevas imetaja kesknärvisüsteemis (KNS) toodetakse kahes lähestikku asuvas 

multipotentses tsoonis: ventikulaarses- ja subventrikulaarses tsoonis (SVZ – 

subventricular zone) (Jacobson ja Rao, 2005). VZ rakud jagunevad kiiresti tootes 

radiaalgliiat ja varajasi neuroblaste. Viimased delamineeruvad neuroepiteelist ja 

aktiveerivad mitmeid geene, mis on seotud neuraalse diferentseerumisega. Radiaalgliia 

on substraadiks valmivatele neuroblastidele migratsiooniks algsest VZ-st tekkivatesse 

neokorteksi kihtidesse. Kui neuroblastide moodustumine vaibub, hakkavad VZ-i 

neuroepiteeli rakud tootma glioblaste, mis migreeruvad kõrvalasuvasse SVZ-sse, kus nad 

prolifereeruvad ning moodustavad esmased astro- ja oligedendrotsüüdid (Clarke, 2003). 

Arvatakse, et täiskasvanud hiire ajus VZ kaob, kuid rakud, mis säilitavad tüvirakkude 

omadusi, säilivad külgmiste ajuvatsakeste seinas. Seega proliferatsioon ja neurogenees 

jätkuvad postnataalse ja täiskasvanud hiire ajus külgmise ajuvatsakese lateraalses seinas 

(Doetsch jt. 1999). 

1.1.2. Migratsioon 

Nii neuronid kui gliiarakud toodetakse oma lõplikust asupaigast erinevas kohas. 

Jõudmaks sihtkohta peavad närvirakkude kooslused liikuma kindlaid migratsiooni 

radasid mööda. KNS arengu ajal eristatakse kahte peamist migratsioonitüüpi: radiaalne 

5

migratsioon, mis paneb paika otsaju üldise põhiplaani, ning tangentsiaalne migratsioon, 

mille teel toimub erinevate neuronitüüpide ränne ja otsaju keerukamaks muutumine. 

Radiaalne migratsioon toimub migreeruvate neuronite vahetu kontakti kaudu 

radiaalgliiaga, mis toimib tugisambana prolifereeruva VZ ja pehmekesta (pia mater) 

vahel (Ghashghaei jt. 2007). Kortikaalsete neuronite radiaalsel migratsioonil on eristatud 

kahte põhilist tüüpi: soma (rakukeha) ümberpaigutumine ning lokomotsioon e. 

edasiliikumine (Nadarajah jt. 2001; Nadarajah jt. 2002; Nadarajah ja Parnavelas, 2002). 

Soma ümberpaigutumise ajal tekib neuronitele pikk basaaljätke ulatudes VZ-st 

pehmekestani, millele järgneb jätke lühenemine ning seeläbi rakkude ühtlane liikumine aju 

välispinna poole. Vastupidiselt lokomotsioonile sõltuvad soma ümberpaigutumise teel 

migreeruvad rakud vähem radiaalgliiast ning migreerutakse peamiselt varajase kortikaalse 

arengu käigus. Lokomotsiooni teel migreeruvad neuronid omavad vaba juhtivat jätket 

kasutades seda gliiakiududel liikumiseks. Lühikesed kiired edasiliikumised vahelduvad 

suhteliselt pikkade seisakutega (Nadarajah jt. 2001). Rakud, millest lõpuks saavad 

püramidaalsed või glutamaatergilised kortikaalsed neuronid migreeruvad pigem radiaalselt, 

kuid GABA-t (gamma aminobutyric acid – γ aminovõihape) sisaldavad interneuronid 

migreeruvad tangensiaalselt. Tangensiaalne migratsioon on mitte-radiaalne ümberpaiknemise 

vorm, kus ei sõltuta gliiakiududest (Ghashghaei jt. 2007). Kortikaalsetes ja väikeaju 

granulaarsetes interneuronites on näidatud, et neuronid suudavad lülituda tangensiaalsest 

migratsioonist radiaalseks ja vastupidi (Komuro ja Rakic, 1995; Polleux jt. 2002). 

1.1.3. Neokorteksi areng 

Hiire embrüonaalses vanuses E11 on VZ-st migreerunud pehmekesta juurde 

postmitootiliste neuronite laine, mis moodustab eelplaadi. E13 arengustaadiumiks on 

teine postmitootiliste neuronite laine migreerunud läbi vahetsooni ja eelplaat jaguneb 

ülemiseks marginaaltsooniks ja alumiseks alusplaadiks, mille vahele tekib kortikaalplaat. 

E14-E18 vanuses laiendavad ajukoorde migreeruvad neuronid kortikaalplaati nii, et iga 

uus neuronite laine möödub oma eelkäijatest paigutudes marginaaltsooni alla (Gupta jt. 

2002) (joonis 1). Kokku loetakse neokorteksis asuvat kuus kihti: I Molekulaarne 

(pehmekude); II Välimine granulaarne; III Välimine püramidaalne; IV Sisemine 

6

granulaarne; V Sisemine püramidaalne; VI Polümorfne (erinevad rakutüübid, aksonid 

ulatuvad taalamuseni) (Sanes jt. 2000). Kõige varem sündinud neuronid paiknevad kõige 

sisemistes kihtides (V ja VI) ja hilisemad neuronid kihtides II-V. Esimesed kortikaalsed 

neuronid tekivad hiire lootel tiinuse keskel, viimased (kihid II/III) vahetult enne ja pärast 

sündi. Vastupidiselt näiteks seljaajule, kus on neurogenees lõppenud juba enne sündi. 

Mida varasem on kortikaalse neurogeneesi staadium, seda multipotentsemad on 

eellasrakud. Hilisema neurogeneesi staadiumi eellasrakud suudavad moodustada vaid 

ülemisi ajukoore kihte (Campbell, 2005). 

Joonis 1. Neokorteksi kihtide moodustumine hiire embrüogeneesis. Embüonaalses vanuses E11 on moodustunud 

preplaat (PP) postmitootiliste neuronite laine kohale jõudmisega ventrikulaarsest tsoonist (VZ) pehmekesta (PS). E13 

vanuseks on teine postmitootiliste neuronite laine migreegrunud läbi vahemise tsooni (IZ) ning lahutanud preplaadi 

marginaalseks tsooniks (MZ) ja alusplaadiks (SP). Nende vahele moodustub koritkaalplaat (CP) Vahemikus E14-E18 

laiendavad järjestikused neuronite lained kortikaalplaati nii, et hiljem moodustunud kihid rändavad teistest mööda 

marginaaltsooni alla. Lõpuks moodustub kuuekihiline neokorteks (Gupta jt., 2002). 

1.1.4. Asümmeetriline rakujagunemine imetaja neuraalsetes eellasrakkudes 

Organismi arengu käigus panevad neuraalsed tüvirakud alguse kogu imetaja 

KNS-ile ning selle juurde kuuluvatele makrogliia rakkudele: astro- ja 

oligodendrotsüütidele. Närvisüsteemi arengu käigus jagunevad multipotentsed 

neuroepiteeli rakud esimest korda sümmeetriliselt – mitoosikääv paikneb 

neuraalepiteeliga paralleelselt, seega tütarrakud on võrdse suurusega ja potentsusega. 

7

Sellele järgneb mitu asümmeetrilist iseuuenduslikku jagunemist, kus mitoosikääv 

paikneb neuroepiteeli suhtes perpentikulaarselt - tekib üks tüvirakk ja üks väiksema 

potentsusega rakk. Osad väiksema potentsusega rakud läbivad veel sümmeetrilise 

jagunemise, mille tulemusena tütarrakud diferentseeruvad lõplikult (Gotz ja Huttner, 

2005). Imetaja aju eellasrakkude asümmeetrilise jagunemise täpsed mehhanismid on 

teadmata, kuid paljudes teadustöödes on näidatud, et sarnaselt teiste 

mudelorganismidega, on oluline mitoosikäävi orientatsioon. Kindlaks on tehtud palju 

valke, mis on olulised mitoosikäävi orientatsiooni regulatsioonis. Raku jagunemistasandit 

määravad põhilised valgud on Par-3 (partitioning defective protein, ka bazooka; 

selgroogsetes ASIP), Par-6 ja ebatüüpiline PKC (aPKC – atypical proteine kinase C; 

selgroogsetes PKCζ ja PKCλ), Inscuteable, Pins (selgroogsetes AGS-3, LGN), G 

valgukompleks ja Mud (mushroom body defect; selgroogsetes NuMA [nuclear mitotic 

apparatus]) (Buchman and Tsai, 2007; Knoblich, 2008). Uurimustest imetajatega on 

selgunud, et valgu Pins homoloogid imetajates (AGS-3, LGN) võivad tugevalt mõjutada 

neurogeneesi ja käävi orientatsiooni (Sanada ja Tsai, 2005), valgu Inscuteable homoloog 

mInsc käitub lõiketasandi nurga regulaatorina neurogeneesis, omab vahekorda LGN-iga 

ja on eellasrakkudes apikaalse paigutusega (Zigman jt. 2005). Need tulemused on 

vastavuses teiste mudelorganismidega, seega oletatakse, et käävi regulatsiooni 

mehhanismid on konserveerunud (Buchman ja Tsai, 2007). Tüüpmudeli järgi paikneb 

Inscuteable apikaalselt seondudes Par-3-le ja kaasab apikaalsesse kompleksi ka Pins 

valgu. Pins-i C-terminaalne pool sisaldab kolme GoLoco domeeni, kuhu omakorda 

seonduvad heterotrimeerse G-valgu α i subühikud. Esimese GoLoco domeeni külge 

seondumisega tuuakse Pins valgud plasmamembraanle. Gα i seondumisega teisele ja 

kolmandale GoLoco domeenile muutub Pins valgu konformatsioon: lisaks GoLocole 

saab nüüd N-terminaalsesse poolde seonduda ka Mut/NuMA valk, mis seob 

mikrotuubuleid ja düneiini. Arvatakse, et NuMA on astraalsete mikrotuubulite otstele 

seondumiskoht, mis kallutab käävi soovitud suunas (Buchman ja Tsai, 2007; Knoblich, 

2008). 

8

1.1.5. Postnataalne neurogenees 

Enamiku imetajate hammaskääru (gyrus dentatus) hiiluse prolifereeruvas tsoonis 

toodetakse neuroneid ja gliiat kogu elu jooksul. Hammaskääru prolifereeruv populatsioon 

kasvab välja külgmise ajuvatsakese keskseina VZ-st ning migreerub hammaskääru 

hiilusesse. Seal püsib see kogu hiire eluaeg, kuid enamik rakke toodetakse siiski 

vahemikus sünnist kuni 20nda arengupäevani (P20) (Jacobson ja Rao, 2005). On 

tõendatud, et ka vanemates loomades jätkub hammaskäärus rakkude jagunemine, millest 

osad migreeruvad granulaarrakkude kihti, moodustavad ühendusi ning saavad püsivalt 

selle rakukihi osaks. Täpsemalt on näidatud, et täiskasvanud ajus granulaarrakkude arv 

suureneb, uued rakud vahetavad vanad välja ning nad kasvatavad aksonid CA3 

molekulaarsesse rakukihti (Bayer, 1982; Crespo jt. 1986; Stanfield ja Trice, 1988). 

Postnataalse arengu käigus sõltub väikeaju morfogenees välimises granulaarses 

rakukihis paiknevate granulaarsete neuronite eelrakkude proliferatsioonist ja 

migratsioonist. Välimine granulaarne rakukiht väikeajus on unikaalne prolifereeruv 

populatsioon kesknärvisüsteemis, sest külgneb pehmekestaga (pial surface) mitte 

ventrikulaarse pinnaga. Välimise granulaarse rakukihi rakud pärinevad rombaju huulest 

(rhombic lip) ning migreeruvad üle kogu väikeaju pinna (Jacobson ja Rao, 2005). 

1.2. Nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 

1.2.1. Biokeemiline funktsioon 

RIC-8 (resistant to inhibitors of cholinesterase) identifitseeriti esmakordselt 

nematoodi Chaenorhabtidis elegans mutantide geneetilisel sõeluuringul, kus testiti 

letaalsust koliinesteraasi inhibiitoritele (Miller jt. 1996). Ric-8 geen on loomariigis 

konserveerunud ning sellelt kodeeritav 63kD suurune tsütoplasmaatiline valk Ric-8 

toimib nukleotiidivahetusfaktorina (GEF-na) erinevates organismides: Chaenorhabditis 

elegans, Drosophila melanogaster ja imetajates (Miller jt. 2000; Tall jt. 2003; Afshar jt. 

2004; Afshar jt. 2005; David jt. 2005; Wang jt. 2005). 

9

Ric-8 biokeemiline funktsioon on seotud G valkude poolt vahendatud 

signalisatsioonisüsteemiga, toimides nukleotiidivahetusfaktorina G q α, G o α, G i α valkudele 

(Tall jt. 2003). Ric-8 interaktsiooni on näidatud nii G q α, G o α, G i α kui G 13 α subühikutega 

(Miller jt. 2000; Miller ja Rand, 2000; Klattenhoff jt. 2003; Tall jt. 2003). 

Heterotrimeersed G valgud osalevad signaaliülekande vahendamisel ja nende 

aktiveerimine võimaldab spetsiifilise signaali viimist rakku (Gao jt. 1987). Inaktiivne Gα- 

GDP (guanosiindifosfaat) on seotud Gβγ dimeeri ja seitse korda membraani läbiva G 

valkudega seotud retseptoriga (GPCR). Peale ligandi seondumist käitub 

transmembraanne retseptor kui nukleotiidivahetusfaktor (GEF), soodustades Gα 

subühikult GDP vahetamist GTP (guanosiintrifosfaat) vastu. GTP seostumisel toimub 

heteromeerse G valgu dissotsieerumine Gα-GTP ja Gβγ dimeeriks ning mõlemad 

kompleksid võivad aktiveerida vastavaid efektormolekule (Bornancin jt. 1989; Green jt. 

1996). Gα subühiku GTPaasne aktiivsus aitab kaasa G valkude inaktivatsioonile, mille 

käigus α subühik hüdrolüüsib γ fosfaadi GTPs ning taastub inaktiivne Gα-GDP 

kompleks. Ebastabiilne Gα-GDP kompleks reassotseerub Gβγ dimeeriga ja moodustub 

uuesti inaktiivses olekus heterotrimeerne kompleks (Bastiani ja Mendel, 2006). Hiljutised 

biokeemilised ekperimendid G valkude nukleotiidivahetusfaktor (GEF) Ric-8-ga 

(Synembryn) on näidanud, et Ric-8 seondub monomeerse Gα-GDP kompleksiga, 

stimuleerides GDP vabanemist ning stabiliseerides nukleotiidivaba α-subühikut, 

soodustades sellega GTP seondumist. GTP seondumine Gα-ga põhjustab kompleksi 

dissotsieerumise, Ric-8 vabaneb kompleksist ja Gα on uuesti aktiivses vormis. Niimoodi 

saab võimendada G valgu vahendatud signaali ja pikendada selle toimeaega (Tall jt. 

2003; Tall ja Gilman, 2004). 

1.2.2. Ric-8 funktsioon embrüogeneesis 

Asümmeetriline jagunemine mängib olulist rolli rakkude mitmekesisuse 

kujunemisel. Varajases embrüogeneesis annavad asümmeetrilised jagunemised alguse 

tütarrakkudele, mis erinevad lisaks oma tulevaselt funktsioonilt ka suuruses (Horvitz ja 

Herskowitz, 1992). Heaks mudeliks asümmeetrilise jagunemise ja käävi 

positsioneerumise kujunemise uurimisel on C.elegansì lõigustuv embrüo (Schneider ja 

10

Bowerman, 2003). C. elegansì ühe-raku staadiumis oleva jaguneva sügoodi anafaasis 

paigutub mitoosikääv vastavalt anterioposterioorsete polaarsuse signaalidele 

posterioorsemaks, mille tulemusena tekib asümmeetriline jagunemine: anterioorne 

suurem ja posterioorne väiksem blastomeer (joonis 2A) (Grill jt. 2001). Oluline roll 

asümmeetrilise jagunemise kujunemisel C. elegansí varjajases embrüogeneesis on G 

valkudel (Gonczy, 2002; Knoblich, 2008). Mitmed autorid on näidanud, et ka G valkude 

nukelotiidivahetsufaktor (GEF) Ric-8 on oluline faktor varajase asümmeetrilise 

jagunemise kujunemisel, tsentrosoomide rotatsioonil, käävi positsiooni formeerumisel, 

tuumade migreerumisel ja teiste tsentrosoomi vahendatud sündmuste juures nematoodil 

C. elegans (joonis 3A) (Miller ja Rand, 2000; Afshar jt. 2004; Couwenbergs jt. 2004; 

Wilkie ja Kinch, 2005) ja äädikakärbses D.melanogaster (David jt. 2005; Hampoelz jt. 

2005; Wang jt. 2005). Mitoosikäävi moodustumise ajal C.elegansi varajases 

embrüogeneesis liigub posterioorne tsentrosoom edasi-tagasi, läbides embrüo keskkohta 

4-6 korda. Selle tulemusena liigub mitoosikääv embrüo posterioorse otsa suunas ning 

pärast esimest lõigustumist jaguneb P 0 sügoot suuremaks AB ja väiksemaks P 1 rakuks 

(Hyman ja White, 1987). Mutantseid ric-8 -/- genotüübiga C. elegans-i embrüoid uurides 

leiti, et tsentrosoomi edasi-tagasi liikumine rakus oli nõrk või puudus täielikult, 

mitoosikäävi lõplik positsioon oli ric-8 mutantidel statistiliselt oluliselt vähem 

posterioorne võrreldes normaalse (wt) embrüoga ja seetõttu oli AB blastomeer sama suur 

või veidi suurem P 1 blastomeerist (Miller ja Rand, 2000). Lisaks on näidatud, et Ric-8 on 

oluline komponent asümmeetrilisel jagunemisel astraalsete mikrotuubulite poolt 

vahendatud tõmbejõu tekkimisel (Afshar jt. 2004; Afshar jt. 2005). 

11

Joonis 2. Asümmeetriline rakujagunemine C. elegansìs ja Drosophila`s. Kolm mudelsüsteemi – A C 

elegans-i üherakuline embrüo, B Drosophila neuroblast ja C Drosophila sensoorse organi eellasrakk (SOP) 

– sisaldavad komponente, mis on olulised asümmeetrilist rakujagunemist reguleerivate signaalradade juures 

(Par3-Par6-aPKC kompleks ja retseptorist sõltumatu G-valgu signaliseerimine). Kuigi sõltuvalt jagunevast 

rakust varieerub Par-kompleksi ja Gα-GDI kompleksi asukoha suhe, kontrollib Par-kompleks raku 

polaarsust. G-valu signaliseerimine määrab käävi orientatsiooni ja positsiooni raku telje suhtes, et 

kindlustada tütarrakkude asümmeetrilisust ning õiget paiknemist (Matsuzaki, 2005). 

Mudelorganismi Drosophila embrüotega läbiviidud uurimused näitasid, et RIC-8 

osaleb neuroblastide ja sensoorsete eellasrakkude asümmeetrilises jagunemises ja käävi 

orientatsiooni formeerumisel ning tütarrakkude suuruse erinevuse säilitamisel (joonis 2B- 

C) (David jt. 2005; Hampoelz jt. 2005; Wang jt. 2005). Kui metsiktüüpi embrüote 

neuroblastide jagunemine toimus telje tasapinnal, siis pooltes ric-8 mutantsetes 

neuroblastides oli mitoosikääv nihkunud rohkem kui 20 o . See põhjustab sümmeetrilist 

rakujagunemist. Lisaks leiti, et RIC-8 paikneb peamiselt neuroblastide tsütoplasmas ning 

plasmamembraanis (David jt. 2005; Hampoelz jt. 2005; Wang jt. 2005). Ric-8 

puudumine ja asümmeetrilise jagunemise häired on nii mutantsetel nematoodidel (Miller 

ja Rand, 2000) kui ka äädikakärbestel (Hampoelz jt. 2005; Wang jt. 2005) 

embrüonaalselt letaalsed. Drosophila ric-8 mutantsetel embrüotel, kellel puudub 

emapoolne ric-8, tekivad mitmed arenguhäired gastrulatsioonis, nagu näiteks kesksoole 

12

defektne invaginatsioon ja iseloomulik väändunud fenotüüp (Hampoelz jt. 2005; Wang jt. 

2005). 

Ric-8 funktsiooni imetajate varajases asümmeetrilises jagunemises ja 

embrüogeneesis on vähe uuritud. Katsed Ric-8 knockout loomadega on näidanud, et ric- 

8 -/- genotüüp on hiire embrüotele letaalne juba väga varajases arengus (E6.5–E8.5) 

(Lulla, 2008; Tõnissoo jt. 2009). Heterosügootsed ric-8 +/- embrüod on elujõulised ja 

eristamatud normaalsetest pesakonnakaaslastest. Homosügootsed ric-8 -/- embrüod on 

võimelised emakaseina külge implanteeruma ning käivitama gastrulatsiooni, kuid on 

oluliselt väiksemad kui metsiktüüpi pesakonnakaaslased ning neil esineb tugevaid 

kõrvalekaldeid gastrulatsioonis ja organogeneesi algfaasis (ebanormaalne lootelehtede 

kujunemine, ebakorrektsed rakkude morfogeneetilised liikumised, rakkude adhesiooni 

probleemid, defektne amnioni ja allantoisi formeerumine jpm.) (Tõnissoo jt. 2009). 

Lisaks põhjustab Ric-8 puudus blastotsüstide kasvatamisel in vitro tingimustel mitmeid 

kõrvalekaldeid normaalsest arengust (zona pellucidast koorumise probleemid, 

embrüoidkeha ebanormaalne lamendunud morfoloogia) (Tõnissoo jt. 2009). 

Ekspressiooniuuringutest selgus, et E5.5-E6.5 vanustes embrüotes on Ric-8 

ekspresseerunud emapoolset päritolu detsiiduas ning trofoblasti gigantrakkudes. E7.5- 

E8.5 vanuses oli ekspressioon täheldatav üle kogu areneva embrüo nii ekstra- kui intraembrüonaalsetes 

kudedes, kuid emapoolsetes kudedes viiakse Ric-8 ekspressiooni tase 

alla (Lulla, 2008; Tõnissoo jt. 2009). 

13

Joonis 3.. Ric-8 funktsioon mudelorganismis Chaenorhabditis elegans. A Ric-8 asümmeetrilises rakujagunemises. 

Ric-8, Gα, RGS-7 ning teised G-valgu masinavärgi komponendid on hajali üle terve C. elegansi sügoodi. Joonisel on 

need on sügoodi tagumisse otsa kokku joonistatud, et rõhutada nende interaktsioonide tulemusena tekkivat 

mitoosikäävi posteriooset asetust ning asümmetrilist jagunemist. Punase ja sinise poolringiga on tähistatud PAR 

valgud. Mitoosikäävi mikrotuubulid paiknevad kromosoomide ja tsentrosoomide (punased täpid) vahel; astraalsete 

mikrotuubulite (sinised kiud, MT) otstes ulatuvad pluss (+) otsad rakumembraanini ning miinus (-) otsad 

tsentrosoomini. Düneiin/dünaktiin on mikrotuubulite tõmbejõu tekitaja, mida stimuleerib RIC-8. RIC-8/G kompleksi 

komponendid on ka mikrotuubulite stabiilsuse reguleerijad. B G valkude nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 mängib olulist 

rolli G valkudega seotud signalisastiooni süsteemis neurotransmitterite sekrtesioonil ja sünaptilises närviülekandes 

(Wilkie ja Kinch, 2005). 

1.2.3. Ric-8 funktsioon närvisüsteemis 

Geneetilised uuringud C. elegansìga osutavad sellele, et Ric-8 on 

võtmekomponendiks G q α-G o α signaalivõrgustikus, reguleerides neurotransmitterite 

sekretsiooni C. elegansì närvisüsteemis (Nurrish jt. 1999; Miller jt. 2000). Ric-8 

14

nukleotiidivahetus-aktiivsust on näidatud nii Gα q , Gα o/i kui Gα s subühikute juures 

(Klattenhoff jt. 2003; Tall jt. 2003; Couwenbergs jt. 2004; Reynolds jt. 2005; Schade jt. 

2005), mis koos moodustavad sünaptilise signaliseerimisvõrgustiku – integreeritud 

molekulaarse ringluse, mis on tõenäoliselt aluseks õppimisele, mälule ja käitumise 

modifitseerimisele (joonis 3B) (Reynolds jt. 2005; Schade jt. 2005). Ric-8 on võimeline 

säilitama G-valgu poolt vahendatud stiimulit määramatu aja vältel, pärast retseptorilt 

saadud signaali lõppemist (Tall jt. 2003). Ric-8 mutantsete nematoodide fenotüüp 

sarnanes nematoodidega, kellel puudusid funktsionaalsed Gα q ja Gα s subühikud. Seega 

Ric-8 vahendatud G-valkude aktivatsioon neuronites on eluliselt tähtis ning retseptori 

vahendatud Gα subühikute aktivatsioon üksinda ei ole funktsionaalsuse säilimiseks piisav 

(Reynolds jt. 2005). C. elegans-il, kellel Ric-8 on blokeeritud, ilmnes tugev neuronaalne 

fenotüüp. Neil vähenes liikumine, munemine ja kehapainutusvõime. Samuti kaasnes neil 

nematoodidel resistentsus koliinesteraasi inhibiitoritele (Miller jt. 2000). 

Immuunofluorestsentsanalüüsil on näidatud, et RIC-8 on ekspresseeritud nii juveniilsete 

kui täiskasvanud nematoodide närvisüsteemis. Juveniilsetes, aga mitte täiskasvanutes, on 

täheldatud immuunoreaktiivsust mõnedes mitteneuronaalsetes rakkudes, näiteks 

idurakkudes (Miller jt. 2000). RIC-8 on enamasti tugevamalt kontsentreerunud närviraku 

kehas, vähemal määral on märgata värvumist närvijätketes, dendriitides, mõnedes 

koliinergilistes kõhtmise närviketi sünapsides ning närvi rõnga aksonites (Miller jt. 

2000). Hiire varajases embrüogeneesis E9.5-E12.5 on Ric-8 ekspressioon 

neurospetsiifiline, olles ekspresseerunud kraniaalganglionides, neuraaltorus, 

sümpaatilises tüves, spinaalganglionides, vomeronasaalorganis (Jacobsoni organis) ning 

endolümfaatilises juhas (Tõnissoo jt. 2003). Täiskasvanud hiire peaajus on Ric-8 

ekspressioon täheldatav mitmetes käitumuslikult tähtsates ajupiirkondades: neokorteksis, 

vöökäärus (gyrus cingulatus), putamen-is, corpus striatum-is, hipokampuses, väikeajus ja 

käbikehas (Tõnissoo jt. 2003). Ric-8 defitsiit põhjustab heterosügootsetel ric-8 +/- hiirtel 

võimendunud ärevuskäitumist ning kehvemat sooritust õppimise ja ruumilise mäluga 

seotud ülesannete täitmisel (Tõnissoo jt. 2006). 

15

1.3. SynapsinCre transgeenne hiireliin 

Cre/Lox süsteem on laialt kasutatav koespetsiifiline meetod selliste knockout 

hiireliinide uurimiseks mida ei saa uurida diferentseerunud kudedes kuna 

konventsionaalne knockout liin on embrüonaalselt letaalne (Sauer ja Henderson, 1988; 

Zhu jt. 2001; Lambert-Langlais jt. 2009). Rajewsky grupp Kölnist (Gu jt. 1994), kasutas 

esimest korda Cre ekpresseerivat hiireliini inaktiveerimaks endogeenset hiire geeni. Cre 

(causes recombination) kohtspetsiifiline rekombinaas juhib rekombinatsiooni 

bakteriofaagi P1 loxP (locus of crossover (x) in P1) järjestuste vahel. LoxP järjestused on 

34 aluspaari pikkused, sisaldades 13 bp pikkuseid palindroomseid järjestusi. 

Rekombinaasid katalüüsivad DNA ahela vahetust kahe rekombinatsiooni koha vahel, 

mille tulemuseks on järjestuste deletsioon, duplikatsioon, integratsioon, inversioon või 

translokatsioon, sõltuvalt rekombinatsiooni saitide orientatsioonist (Nagy, 2000). 

Konditsionaalseks geeni välja lülitamiseks on vajalik kahe erineva hiireliini olemasolu: 

transgeenne koe/rakutüübi spetsiifiliselt Cre-rekombinaasi ekspresseeriv hiireliin ja 

hiireliin, mis sisaldab kahe suunatud rekombinaasi ära tundva loxP järjestuse vahel 

paiknevat märklaudgeeni (joonis 4A-B). LoxP järjestused ei sega märklaudgeeni 

ekspressiooni ega funktsiooni, tagades looma normaalse arengu. Kui toimub Crerekombinaasi 

koespetsiifiline ekspressioon, siis LoxP saitide vahelise märklaudgeeni 

DNA lõigatakse välja ning geen inaktiveeritakse (Sauer ja Henderson, 1988; Gu jt. 1994). 

Kasutades rakutüübi spetsiifilisi promootoreid Cre ekspressiooni lokaliseerumiseks 

transgeensetes hiirtes on tekitatud mitmeid neurospetsiifilisi mutantseid hiireliine (Barski 

jt. 2000; Niwa-Kawakita jt. 2000; Hirasawa jt. 2001; Zhu jt. 2001; Gelman jt. 2003; 

Korets-Smith jt. 2004; Lindeberg jt. 2004; Zhang jt. 2004). Paljudes laboratooriumides 

on kasutusele võetud SynICre transgeensed hiired (Synapsin I promootor), kelle abil on 

võimalik neurospetsiifiliste geenide välja lülitamine diferentseerunud neuronites (Zhu jt. 

2001; May jt. 2004; Hasue jt. 2005). Sünapsiinid on kolm alternatiivse splaissingu 

produkti (Synapsin I, II, III), moodustades 10% imetajate sünaptiliste vesiikulite 

valkudest (Hosaka ja Sudhof, 1998; Kao jt. 1998). Synapsin I ekspresseeritakse pea 

kõigis närvirakkudes, teistes rakutüüpides pole ekspressiooni täheldatud (Greengard jt. 

1993). Sünapsiinid on ankurproteiinid, mis seovad sünaptilised vesiikulid üksteisega ja 

16

tsütoskeleti võrgustikuga presünaptlistes terminalides (Ceccaldi jt. 1995; Pieribone jt. 

1995). Mitmed katsed Synapsin I mutantsete hiirtega on kinnitanud, et Synapsin I 

puudumine ei põhjusta hiirtel märgatavaid morfoloogilisi defekte peaajus ega üldises 

käitumisfüsioloogias (Rosahl jt. 1993; Li jt. 1995; Rosahl jt. 1995; Takei jt. 1995), samas 

on näidatud, et Synapsin I puudumine võib hiirtel põhjustada epilepsiat (Terada jt. 1999). 

SynICre hiireliinis on Cre ekspressioon kontrollitud roti Synapsin I promootori poolt, mis 

juhib transgeeni ekspressiooni spetsiifiliselt neuraalsetes rakkudes (Hoesche jt. 1993). 

Ajalis-ruumilist SynICre ekspressiooni on kirjeldatud hiirtel alates E12.5 arenevas 

peaajus, seljaajus ja DRG (dorsal root ganglia - spinaalganglionid). Täiskasvanud 

loomadel täheldati SynICre ekpressiooni ainult peaajus ja seljaajus, teistes organites 

(südames, maksas, kopsus, neerus) ekspressiooni ei täheldatud (Zhu jt. 2001). 

Histoloogilised uuringud näitasid, et SynICre on aktiivne peamiselt diferentseerunud 

neuronites, väljaspool pea ja seljaaju ventrikulaarregiooni (Zhu jt. 2001). Mõned autorid 

on näidanud, et Synapsin I promootor võib lisaks diferentseerunud neuronitele juhtida 

Cre ekspressiooni ka testistes (Hoesche jt. 1993; Street jt. 2005). 

17

Joonis 4 Cre/Lox süsteem. A LoxP konstrukti viimine hiirtesse. Hiire embrüonaalsetes tüvirakkudes ümbritsetakse 

märklaudgeen homoloogilise rekombinatsiooni teel LoxP järjestustega, mille tunneb ära Cre rekombinaas. B LoxP 

järhestusi sisaldav hiir ristatakse koespetsiifiliselt Cre rekombinaasi ekspresseeriva transgeense hiireliiniga. Nende 

hiirte järglastes toimub koespetsiifiline märklaudgeeni deletsioon (Strachen ja Read, 1999). 

18

2. EKSPERIMENTAALNE OSA 

2.1. Eksperimentaalse töö eesmärgid 

1. Kirjeldada SynapsinICre transgeeni neurospetsiifilist ekspressiooni hiire 

postnataalses arengus (P1-P5). 

2. Kirjeldada nukelotiidivahetusfaktor Ric-8 ekspressiooni hiire 

postnataalses arengus (P1-P5). 

3. Neurospetsiifilise SynICre;Ric-8 lacZ/lox konditsionaalse hiireliini 

tekitamine ja iseloomustamine. 

2.2. Materjal ja metoodika 

2.2.1. Kasutatud hiireliinid 

Neurospetsiifilise SynapsinICre;Ric-8 lacZ/lox konditsionaalse hiireliini tekitamiseks 

kasutati järgmisi hiireliine: 

1. SynICre (transgeenne hiireliin, kus neurospetsiifiline Cre-rekombinaasi 

ekspressioon on kontrollitud roti Synapsin I promootori poolt). 

2. Ric-8 lox/lox (märklaudgeenis ric-8 LoxP järjestusi sisaldav transgeenne hiireliin). 

3. Ric-8 lacZ/+ (lacZ knock-in hiireliin, kus ric-8 lookusesse on viidud reportergeen 

lacZ, millelt sünteesitava β-galaktosidaasi ekspressioon jäljendab ric-8 

ekspressiooni). 

Ric-8 ekspressiooni uurimiseks hiire varajases postnataalses perioodis (P1-P5) 

kasutati ric-8 lacZ/+ hiireliini. Neurospetsiifilise SynapsinICre hiireliini Cre-rekombinaasi 

aktiivsuse iseloomustamiseks postnataalsel (P1-P5) perioodil kasutati reporterliinina 

B6.129S7-Gtrosa26 (ROSA) hiireliini, mis sisaldab ROSA26 lookuses paiknevat loxP- 

STOP-loxP-lacZ konstrukti. Kui ristata uuritavat Cre-liini ROSA hiirtega, siis Crerekombinaasi 

ekspresseerudes lõigatakse loxP järjestuste vaheline lõik Cre-spetsiifiliselt 

välja võimaldades ROSA26 promootoril käivitada lacZ ekpressiooni (Zambrowicz jt. 

1997; Soriano, 1999). Kõikide ristamiste puhul kasutati taustliinina C57Bl6/J hiiri (nn. 

wild type hiirliin). 

Postnataalsete hiirepoegade vanus (P0-P6) määrati sünnikuupäeva järgi: P0- päev, 

millal toimus poegimine; P1- vastavalt esimene postnataalne päev jne. 

19

Kõiki ekperimentides kasutatud katseloomi hoiti standartsetes tingimustes. Neile 

oli võimaldatud ööpaevaringne puhas söök ja jook. Katseloomad ohverdati vastavalt 

Euroopa Liidus kehtsetatud eeskirjadele. 

2.2.2. Ristamine 

Neurospetsiifilise SynICre;Ric-8 lacZ/lox konditsionaalse hiireliini tekitamiseks 

kasutati järgmist ristamisskeemi: 

1. SynICre hiireliini paljundus: 

SynICre +/- x C57Bl6/J (wt) 

½ SynCre +/- 

½ SynCre -/- 

2. Homosügootsete ric-8 lox/lox hiirte tekitamine: 

ric-8 lox/+ x ric-8 lox/+ 

¼ ric-8 lox/lox 

½ ric-8 lox/+ 

¼ ric-8 +/+ (wt) 

3. Heterosügootsete ric-8 lacZ/+ hiirte paljundamine: 

ric-8 +/lacZ 

x C57Bl6/J (wt) 

½ ric-8 +/lacZ 

½ ric-8 +/+ (wt) 

4. SynICre +/- ;Ric-8 lacZ/+ hiirte tekitamine: 

SynICre +/- x ric-8 +/lacZ 

¼ SynCre +/- ;ric-8 +/lacZ 

¼ SynCre +/- ;ric-8 +/+ 

¼ SynCre -/- ;ric-8 +/lacZ 

¼ SynCre -/- ;ric-8 +/+ (wt) 

5. Neurospetsiifilise SynapsinICre;Ric-8 lacZ/lox konditsionaalse hiireliini tekitamine: 

SynCre +/- ric-8 +/lacZ x SynCre -/- ric-8 lox/lox 

¼ SynCre +/- ric-8 lacZ/lox (mutant) 

¼ SynCre +/- ric-8 +/lox 

¼ SynCre -/- ric-8 +/lox 

¼ SynCre -/- ric-8 lacZ/lox 20

2.2.3. Genotüpiseerimine 

Hiirepoegade genotüpiseerimiseks kasutati saba otsast eraldatud koematerjali. 

Koematerjal lüüsiti 100μl lahuses (187 ng/μl proteinaas K; lüüsipuhver: 180 mM Tris- 

HCl (pH 9.0); 20 mM (NH4)2SO4; 0.02% Tween 20) üleöö 55 o C juures. Seejärel 

inaktiveeriti lüüsilahused 20 minutit 98 o C juures ning tsentrifuugiti täispööretel 16060 g 

10 min. Saadud genoomset DNA-d analüüsiti polümeraasi ahelreaktsioonil (PCR). PCR-i 

teostamiseks kasutati järgnevaid alleelspetsiifilisi praimereid: 

ric-8 lacZ/+ 

synIcre +/- 

LacZ300 5´ - CGCATCGTAACCGTGCATCT - 3´ 

RicptggenoF 5´- CTCTCCCAGCATCCCTCAC – 3´ 

Ptg(ric-8)in1rev 5´ - CACACCCCAGCCGAGTTG - 3´ 

Synprom2 5´ - GTCCAGACCCTACGGACAAG - 3´ 

Nestincre2 5´ - CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG - 3´ 

riccregenoF 5´ - GGTAGGGCTCAATGTTGG - 3´ 

ric-8 lox/lox riccregenoR 5´- GCCAAACAATCTCTCGAACC - 3´ 

´ 

PCR-i reaktsioonisegu koosnes: 1x(NH 4 ) 2 SO 4 puhver (Fermentas), 1.5 mM 

MgCl 2 (Fermentas), 0.2 mM dNTP, praimereid 0,25μM, Taq polümeraas 0.02U/μl, 1 μl 

DNA ja ddH2O. Reaktsiooni kogumaht oli 10 μl. 

Kasutatud PCR-i programmi parameetrid: 

95°C 5 minutit 

95°C 30 sekundit, 

58°C 40 sekundit 32 tsüklit 

72°C 1-2 minutit (vastavalt DNA fragmendi pikkusele) 

72°C 10 minutit. 

SynICre rekombinaasse aktiivsuse kontrollimiseks konditsionaalsete SynICre;Ric- 

8 lacZ/lox mutantide erinevates ajupiirkondades ja organites kasutati järgenvaid praimereid: 

ric5floxgeno 5´ - CTTTTCCACGGGTGTTCTTC - 3´ 

21

iccregenoR 5´- GCCAAACAATCTCTCGAACC - 3´ 

PCR-i produkte analüüsiti 1% või 1.5%-lises TAE (Tris-atsetaat-EDTA) 

agaroosgeelelektoforeesil, DNA pikkusmarkerina kasutati 1kb või 100bp DNA Ladder’it 

(Fermentas). 

2.2.4. SynICre;Ric-8 lacZ/lox hiireliini iseloomustamine 

SynICre;Ric-8 lacZ/+ ja Ric-8 lox/lox hiirte ristamisel saadud tiinuse käiku jälgiti ja 

fikseeriti sündimise päev. Hiirepojad kaaluti järjestikustel päevadel, kasutades analüütilist 

kaalu Scaltec. Fikseeriti hiirepoegade kõrvalekalded normaalsest fenotüübist. Osadel 

pesakondadel mõõdeti lisaks kogupikkus, tüvepikkus, esi-ja tagajalgade pikkus, ristluude 

laius. Hinnati ka hiirepoegade toitumust ja käitumist. Hiirepoegi fotografeeriti ja filmiti 

kaameraga Olympus SP570 UZ. Ohverdatud loomadel fikseeriti analüütilise kaaluga 

erinevate organite (peaaju, süda, kops, maks, põrn, neer, magu) mass. 

2.2.5. Külmlõikude valmistamine 

Postnataalsete P1-P5 hiirte peaajud ja teised organid (süda, neer) eraldati 

eelnevalt ohverdatud loomalt ning fikseeriti 2 tundi 4% paraformaaladehüüdi 

fosfaatpuhverdatud soolalahuses (4% PFA/PBS-is) temperatuuril 4 o C. Seejärel pesti 3 x 5 

min. 1x PBS-is ning sisestati 30% sahharoosi lahusesse 1xPBSis, ning jäeti 4 o C juurde 

seisma 24 tunniks (organid säilitati pärast filterpaberiga kuivatamist -20 o C juures). 

Järgnevalt teostati organitele krüolõikus. Külmlõigud lõigati masinal SLEE Cryostat Mnt. 

Krüodissektori kambri temperatuuriks oli lõikamisel peaaju puhul –10-(-15) o C, neeru ja 

südame puhul -20 o C. Lõigati 40 μm paksused koelõigud, mis kanti Menzel Gläzer 

SuperFrost Plus ® alusklaasidele. 

22

2.2.6. β-galaktosidaasi värvusreaktsioon koelõikudel 

Värvusreaktsiooni esilekutsumiseks pesti koelõikudega alusklaase 2 x 5 min 

pesupuhvriga (100mM PBS (pH 7.3), 72mM Na 2 HPO 4 , 28mM NaH 2 PO 4 , 2mM MgCl 2 ). 

Seejärel asetati koelõikudega alusklaasid pimendatud niisutuskambrisse ning inkubeeriti 

värvilahusega (1 x pesupuhver, 5mM kaaliumferritsüaniid, 5mM kaaliumferrotsüaniid, 1 

mg/ml X-Gal (20 mg/ml dimetüülformamiidis) üleöö. Värvilahuse eemaldamiseks pesti 

koelõike 2 x 5 min 1x PBS-is ning järelfikseeriti PFA/PBS 4% lahusega 10 minutit. 

Fiksaator pesti maha 1x PBS-iga 2 x 5 min ning koelõigud sulundati glütseriiniga. 

Katteklaasi servad liimiti kuivamise vältimiseks kinni küünelakiga Dior. 

2.2.7 Pildistamine 

Kõiki antud bakalaureuse töös kasutatud histoloogilisi preparaate vaadeldi ja 

pildistati binokulaariga Olympus SZX12 ning kujutiste saamiseks kasutati Olympus 

XC50 kaamerat koos lisatarvikutega (Olympus U-RFL-T, U-ULH). Piltide 

järeltöötlemiseks kasutati arvutiprogrammi Adobe Photoshop 7.0. 

2.2. Tulemused 

2.2.1. Neurospetsiifilise SynICre;Ric-8 lacZ/lox hiireliini iseloomustamine 

SynICre;Ric-8 lacZ/+ ja Ric-8 lox/lox hiirte ristamisel saadud järglaste genotüübiline 

varieeruvus oli vastavuses Mendeli lahknevusseadusega (1/4 oli SynICre;Ric-8 lacZ/lox 

konditsionaalseid knockout loomi), mis tõestab, et Ric-8 puudumine diferentseerunud 

neuronites ei ole embrüogeneesis letaalne. SynICre;Ric-8 lacZ/lox konditsionaalsed järglased 

olid küll võimelised sündima, kuid nad olid kehamassilt väiksemad kui normaalsed 

pesakonnakaaslased (joonis 5B). Kaalumisel selgus, et sündides on ric-8 

konditsionaalsete nullmutantide keskmine kaal (1,357 g) vaid veidi väiksem normaalsete 

loomade omast (1,575 g). Päev-päevalt ric-8 nullmutantide massi-iibe mahajäävus 

võrreldes pesakonnakaaslastega süveneb. Normaalsetele loomadele on omane lineaarne 

23

kehamassi kasv. Ric-8 knockout mutantidel on küll täheldatav kehamassi juurdekasv, 

kuid see toimub vähemal määral ning P5 vanuses nende keskmine kehamass langeb (P4 – 

2,222 g; P5 – 2,038 g) (joonis 5B). Lisaks mõõdeti osadel järglastel pesakonniti 

tüvepikkus, jalgade pikkus, ristluude laius. Mõõtmistulemustest selgus, et ric-8 

nullmutantsed hiirepojad olid natuke lühemad. Jalgade pikkuses olulist erinevust ei olnud 

märgata. Ristluude laius oli ric-8 mutantsetel loomadel märgatavalt kitsam. See kajastus 

ka hiirepoegade eksterjööris. Konditsionaalsed ric-8 mutantsed loomad olid 

deformeerunud kehaasendiga (kängus) ja ebaproportsionaalse kehaehitusega (suhteliselt 

kitsas tagakeha) (joonis 5A). Lisaks avaldus ric-8 mutantsetel hiirtel tugev neuraalne 

fenotüüp. Nad ei olnud võimelised jalgadel seisma, lamasid külili ja püüdsid esijalgadega 

balansseerides saavutada tasakaalu, lisaks oli neil täheldatav kerge lihasvärin e. tremor 

(joonis 5A). Sabast riputamise katses hoiavad ric-8 knockout hiired tagakäppi keha 

lähedal ning laiutavad esikäppi ja või rippuvad passiivselt. Nende normaalsetele 

pesakonnakaaslastele on omane just tagumiste käppade harki ajamine (ilmselt tasakaalu 

hoidmiseks) ning esimeste käppadega haaramispinna otsimine. Lisaks on aktiivsed keha 

painutama kõikides suundades (Joonis 5A). Samas valutundlikkus on ric-8 mutantidel 

säilinud. Rinnapiima imemisrefleksid on neil ka olemas, mida kinnitab kalgendunud 

piima olemasolu maos kuni vanuseni P4. Väärib märkimist, et ric-8 nullmutantsete hiirte 

mao keskmine mass on juba P3 vanuses umbes kaks korda väiksem normaalsete 

pesakonnakaaslaste omast (mutant – 40,73 mg; normaalne – 84,5 mg). P5 vanuseks on 

mao masside vahe kasvanud umbes üheksa kordseks (mutant – 23,56 mg; normaalne – 

205,5 mg). Dissekteerimisel selgus, et P5 mutantse hiire maos emapiima pole, sest pojad 

enam P4 vanuses ei toitu ja P4-P5 nad surevad või emahiir likvideerib nõrgenenud pojad. 

Postnataalsetele hiirepogadele tehtud mõõtmistest on diagrammina välja toodud ric-8 

knockout loomade peaaju mass vanuses P3-P5, mis on küll väiksem normaalsete 

pesakonnakaaslaste massist, kuid ei oma statistiliselt nii olulist erinevust kui 

konditsionaalse mutandi ja normaalse hiire üldmass (joonis 5C). Keskmiste leidmiseks 

kasutatud andmete verieeruvus oli suur, sest suuremates pesakondades on rohkem loomi 

ja vastupidi. 

24

A 

B 

5 

4,5 

Massi-iive 

Wt 

Mutant 

C 

Peaajude mass 

4 

3,5 

3 

mass g 

3 

2,5 

2 

1,5 

1 

mass g 

2 

1 

0,5 

0 

P0 P1 P2 P3 P4 P5 

postnataalne päev 

0 

P3 P4 P5 

postnataalne vanus 

Joonis 5 A Fotod konditsionaalsetest SynICre;Ric-8 lacZ/lox mutantidest (MUT) ja nende normaalsetest 

pesakonnakaaslastest (* - ei oma wt genotüüpi, kuid transgeensed konstruktid nende rakkudes ei häiri nende arengut). 

Paremal ja keskel on näha, kuidas normaalsed hiirepojad lükkavad tagumised käpad laiali ning hakkavad esimestega 

haaramispinda otsima, mutandid hoiavad tagumisi käppi koos ja ajavad esimesed laiali. Parempoolsel pildil on näha, et 

normaalne pesakonnakaaslane toetub neljale käpale, kuid mutandid lebavad külili. Samuti on nad oma normaalsetest 

pesakonnakaaslastest väiksemad. B Ric-8 konditsionaalse knockout-i ja normaalsete pesakonnakaaslaste massi-iibe 

võrdlus postnataalsel perioodil (P0-P5). C Peaajude mass vanuses P3-P5. 

2.2.2. SynapsinICre rekombinaasse aktiivsuse hindamine. 

SynapsinICre rekombinaasse aktiivsuse hindamiseks konditsionaalses SynCreI;Ric- 

8 lacZ/lox (P5) mutandis valiti välja peaaju piirkonnad, kus eeldati Ric-8 ekspressiooni ning 

25

kontrolliks valiti mõned mitteneuraalsed piirkonnad. Kasutades praimereid ric5floxgeno 

ja riccregenoR amplifitseeriti PCR-il Ric-8 fragmente, mis illustreerivad Cre 

rekombinaasi aktiivsust valitud piirkonnas – alumine band 300 bp tähistab lõigatud ric-8 

järjestust, ülemine band– 2500 bp lõikamata ric-8 järjestust (joonis 6). Jooniselt on näha, 

et kõikides närvisüsteemi spetsiifilistes piirkondades (Ce- väikeaju, Hi- hipokampus, Coneokorteks, 

Pu- putamen, Mb- keskaju, Sp- seljaaju, Mo- piklikaju) on Cre rekombinaas 

aktiivne, kuid mitteneuraalsetes kudedes (Mu- skeletilihas, Lu- kops, He- süda, Ki- neer) 

Cre aktiivsus puudub. Seega Cre rekombinaas töötab neurospetsiifiliselt, välja arvatud 

testistes, kus SynICre on aktiivne. 

Joonis 6 SynapsinICre rekombinaasne aktiivsus postnataalse SynCreI;Ric-8 lacZ/lox (P5) hiire ajus. 

Lühendid: Ce – cerebellum e. väikeaju, Hi – hipokampus, Co – korteks, Pu – putamen, Mb – keskaju, Mu – 

lihas, Sp - seljaaju, Lu – kops, He – süda, Ki – neer, Te – testis, Mo – piklikaju. Markerina on kasutatud 1 

Kb markerit (Fermentas). 

2.2.3. Ric-8 ja SynICre ekspressiooni võrdlus postnataalses (P1-P5) peaajus 

Ric-8 ja SynICre ekspressiooni uurimiseks hiire varajases postnataalses (P1-P5) 

arengus kasutati erinevatest hiireliinidest (SynCre; Ric-8 lacZ/+ ; SynICre;Ric-8 lacZ/lox ) 

pärinevat koematerjali kolmes vanuses: P1, P3 ja P5. Kõik ajulõigud on valitud samadest 

piirkondadest (joonised 7-9). SynICre avaldub vaadeldud perioodil praktiliselt kõigis 

differentseerunud neuronites erinevates ajupiirkondades (joonis 7-9A,D,G,J,M). 

Nõrgemalt on SynCre ekspresseerunud väikeajus P1 ja P3 vanuses (joonis 7-8M), 

suurenedes vanuseks P5 (joonis 9M). SynCre ekpressioon ei ole täheldatav ajuvatsakeste 

ependümaalses kihis (joonis 7-9A,D,G,J,M). 

26

Neurospetsiifilise ric-8 konditsionaalse nullmutandi ja ric-8 lacz/+ hiireliini 

võrdlemisel selgus, et Ric-8 ekspresseerub valdavalt samades piirkondades, ehkki 

ekspressiooni intensiivsus on ric-8 lacZ/+ loomadel mõnevõrra tugevam (joonis 7-9 II ja III 

veerg). Vanuses P1 on haistesibulates detekteeritav nõrk ekspressioon piriform korteksi 

2. kihis, kus asuvad püramidaalsed rakud (joonis 7B,C). See ekspressioonipiirkond 

laieneb ka haistesagaratesse. Veel võib täheldada P1 vanuses tekkivat ekspressiooni 

neokorteksi 2(välimine granulaarne)/3 (välimine püramidaalne) kihis. Hipokampuses on 

Ric-8 ekspressioon CA1, CA2 ja CA3 regioonis, kuid hammaskäärus on värvunud vaid 

külgmine laba (lateral blade). Lisaks on värvunud induseum griseum (joonis 7E, F, H, I, 

K, L). Ajusillas on ric-8 lacZ/+ heterosügoodil tugevamini, konditsionaalsel knokcout-il 

nõrgemini värvunud ka nucleus ambiguus (joonis 7N,O). P3 ja P5 vanuste hiirte ajudes 

on haistesagaralale lisaks Ric-8 tugevnevat ekspressiooni näha neokorteksi 2/3 kihis, mis 

jääb haistesibulate kohale (joonis 8-9B,C). P3 vanuses ilmub ric-8 lacZ/+ heterosügoodil 

nähtavale ekspressioon fasciola cinerea-s, mis on paarisstruktuur corpus callosum-i 

keskel (joonis 8I) ning hipokampuse kõige sisesemises moodustises subiculum, mis 

koosneb püramidaalkihi neuronitest (joonis 8L). Lisaks on Ric-8 ekspressioon märgatav 

kolmanda ajuvatsakese seinas, kus paiknevad ependümaalsed rakud (joonis 8K,L). 

Ülejäänud P3 aju piirkondades võrreldes P1-ga Ric-8 ekspressioon suureneb, välja 

arvatud nucleus ambiguus, mille ekspressioon nõrgeneb, kuni kaob P5 ajudes üldse 

(joonis 8-9N,O). P5 vanustel hiirtel on Ric-8 ekspressioon vaadeldav ka hammaskääru 

mediaalses labas (medial lobe) (joonis 9H,I). P5 ajudes on ekspressioon vaadeldav veel 

külgmiste vatsakeste seintes ning viiendas neokorteksi kihis (joonis 9E,F,H,I). 

Postnataalses vanuses P5 ilmub nähtavale ka õrn ekspressioon väikeaju granulaarses kihis 

ning neljandas ajuvatsakeses (joonis 9N,O). 

SynICre hiired omavad ekspressiooni kõikides konditsionaalse knockout mutandi 

ric-8 ekspressioonipiirkondades. 

27

Joonis 7 P1 hiirte ekspressioonimustrid peaaju lõikudel. Vasakus tulbas on näidatud SynICre ekspressiooni, 

keskmises tulbas Ric-8 ekspressiooni cre +/- ric-8 lacZ/lox hiires ning paremas tulbas Ric-8 ekspressiooni ric lacZ/+ hiires. 

Lühendid: Pir – piriform korteksi püramiidrakkude kiht, 2/3 Crtx – neokorteksi 2/3 kiht, IG - induseum griseum, CA-1, 

CA-3 – hipokampuse CA-1 ja CA-3 väljad, DGlb – hammaskääru lateraalne laba, Amb - nucleus ambiguus. 

28

Joonis 8 P3 hiirte ekspressioonimustrid peaaju lõikudel. Vasakus tulbas on näidatud SynICre ekspressiooni, 



CA-3 – hipokampuse CA-1 ja CA-3 väljad, FC - fasciola cinere, DGlb – hammaskääru lateraalne laba, Sub – 

subiculum, V3 – kolmas vatsake, Amb - nucleus ambiguus. 

29

Joonis 9 P5 hiirte ekspressioonimustrid peaaju lõikudes Vasakus tulbas on näidatud SynICre ekspressiooni, 



CA-3 – hipokampuse CA-1 ja CA-3 väljad, FC - fasciola cinere, DGlb – hammaskääru lateraalne laba, DGmb – 

hammaskääru mediaalne laba Sub – subiculum, Lv – külgmine vatsake, V3 – kolmas vatsake, V4 – neljas vatsake, Ceg 

– väikeaju granulaarrakkude kiht. 

30

2.3 Arutelu 

G valkude nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 on loomariigis evolutsiooniliselt 

konserveerunud valk. Senised baasteadmised Ric-8 bioloogilise funktsiooni kohta 

pärinevad töödest erinevate C. elegansì ja Drosophila mutantidega. Mitmed autorid on 

näidanud, et Ric-8 on oluline embrüogeneesis asümmeetrilise rakujagunemise juures 

tsentrosoomide rotatsioonil, käävi positsiooni formeerumisel, tuumade migreerumisel ja 

teiste tsentrosoomi vahendatud sündmuste juures C. elegans-is (Miller ja Rand, 2000; 

Afshar jt. 2004; Couwenbergs jt. 2004; Wilkie ja Kinch, 2005) ja Drosophila-s (David jt., 

2005; Hampoelz jt., 2005; Wang jt., 2005). Teiseks oluliseks Ric-8 funktsiooniks on 

osalemine G valkude poolt vahendatud sünaptilises närviülekandes (Miller jt., 2000). 

Ric-8 nukleotiidivahetus aktiivsust on näidatud mitmete Gα subühikute juures 

(Klattenhoff jt. 2003; Tall jt. 2003; Couwenbergs jt. 2004; Reynolds jt. 2005; Schade jt. 

2005), moodustades sünaptilise signaliseerimisvõrgustiku – mis on aluseks õppimisele, 

mälule ja käitumise modifitseerimisele (Reynolds jt. 2005; Schade jt. 2005). Ric-8 

funktsiooni imetajate närvisüsteemis on vähe uuritud. Hiire embrüogeneesis E9.5-E12.5 

on Ric-8 ajalis-ruumiline ekspressiooni muster neurospetsiifiline (Tõnissoo et al.,2003). 

Täiskasvanud hiire kesknärvisüsteemis on Ric-8 ekspresseerunud mitmetes 

käitumuslikult tähtsates piirkondades. Ric-8 defitsiit neis ajupiirkondades põhjustab 

hiirtel muutusi emotsionaalse käitumise füsioloogias ja probleeme õppimise ning 

ruumilise mäluga (Tõnissoo jt., 2006). Homosügootsed ric-8 -/- loomad ei ole elujõulised 

ja surevad varajases embrüogeneesis E6.5-E7.5 (Tõnissoo jt., 2009), mistõttu ei saa neid 

loomi analüüsida täiskasvanud närvisüsteemis. Alternatiivseks meetodiks selliste 

mutantide puhul on Cre-Lox süsteemi (Sauer jt., 1988) kasutades tekitada koespetsiifiline 

konditsionaalne hiireliin. Antud bakalaureusetöös kasutati Ric-8 funktsiooni uurimiseks 

närvisüsteemis SynICre transgeenset hiireliini, kelle ristamisel Ric-8 lox/lox loomadega on 

võimalik Ric-8 välja lülitada diferentseerunud neuronites. Varasemalt on näidatud, et 

SynICre transgeen hakkab ekspresseeruma alates E12.5 peaajus, seljaajus ja 

spinaalganglionides, saavutades maksimumi 3 arengu nädalal (Zhu et al.,2001; Xia jt., 

2003). Täiskasvanud loomadel on täheldatud SynICre ekpressiooni ainult peaajus ja 

seljaajus, teistes organites (südames, maksas, kopsus, neerus) mitte (Zhu jt. 2001). Antud 

31

uurimustöös leiti, et SynICre on aktiivne erinevates peaaju piirkondades 5 postnataalsel 

päeval (lülitades Ric-8 välja nt. neokorteksist, väikeajust, piklikajust, keskajust, 

hipokampusest). Lisaks näidati, et SynICre on sarnaselt kirjanduses varem näidatuga 

(Zhu jt. 2001) aktiivne ka testistes. SynICre ekpressiooni kirjeldamisel ROSA26 

reporterliiniga selgus, et postnataalsel perioodil on SynICre laialdaselt avaldunud peaaju 

erinevates regioonides. Tuginedes neile andmetele ja lisaks kirjanduses avaldatule võib 

julgelt väita, et Ric-8 on konditsionaalsetel nullmutantidel praktiliselt kõigist Ric-8 

neuraalsetest ekprsessiooni piirkondadest välja lülitatud (lisaks kesknärvisüsteemile ka 

perifeersest närvisüsteemist). 

E12.5 (vanus kui SynCre ekpressioon üles tuleb) on hiirel peaaju arengus välja 

kujunenud viis sekundaarset vesiikulit (telencephalon, diencephalon, mesensephalon, 

metencephalon ja myencephalon) ning võib eristada hüpotaalamust ja preplaati, mis 

paneb alguse neokorteksile (Gilbert, 2003). Sellel ajal toimub ka neuronite tekkimine läbi 

radiaalgliia asümmeetrilise jagunemise. Kuna asümmeetrilise jagunemise mehhanismid 

on loomariigis konserveerunud (Tramontin jt., 2003), võib oletada, et Ric-8 puudumine 

mõjutab ka hiire arengus neuronite asümmeetrilist jagunemist. Esimesed sellised 

jagunemised toimuvad E10 vanuses, kuid neurogeneesi kõrgpunkt on vahemikus E14- 

E15. Asümmeetriline jagunemine, mille läbi enamus neuroneid toodetakse, toimub VZ 

kõige apikaalsemas otsas (Knoblich, 2008). Samas histoloogilised uuringud on näidanud, 

et SynICre on aktiivne peamiselt diferentseerunud neuronites, väljaspool pea ja seljaaju 

ventrikulaarregiooni (Zhu jt. 2001), mistõttu saab välistada ric-8 konditsionaalsetel 

mutantidel defektse asümmeetrilise jagunemise VZ. Seda kinnitab ka fakt, et ric-8 

nullmutantse hiire peaaju mass ei ole normaalse pesakonnakaaslase omast silmnähtavalt 

maha jäänud ja ajustruktuurid on võrreldavad normaalsete pesakonnakaaslastega. Kui 

asümmeetrilises jagunemises ja radiaalses migratsioonis oleksid defektid, siis võiks 

eeldada „sileda aju” e. lissentsephalonì teket (Yingling jt., 2008). Ajude massi 

mõningane erinevus on ilmselt tingitud ric-8 mutantse hiire väiksematest mõõtmetest. 

SynCre;Ric-8 lacZ/lox loomad on võimelised sündima, millest järeldub, et Ric-8 välja 

lülitamine diferentseerunud neuronitest ei ole embrüonaalselt letaalne. Täpsemalt saaks 

kinnituse kas erinevad neuronite kihid ajukoores on tekkinud ja paigutunud õieti, kui 

kasutada kindlaid neuraalseid markereid. Ventrikulaartsoonis on Ric-8 ekpsressioon 

32

postnataalselt detekteeritav P3-P5 ajuvatsakestes. Täiskasvanud hiire ajus VZ kaob, kuid 

sarnaste omadustega rakud säilivad külgmiste vatsakeste seinas SVZ-s (Tramontin jt., 

2003). Sealset ekspressiooni on eelnevalt näidatud täiskasvanud Ric-8 LacZ/+ hiires 

(Tõnissoo jt., 2003). VZ rakud toodavad E14-E16 enamuse ependümaalseid rakke, mis 

jäävad ajuvatsakesi vooderdama, kuid jätked moodustuvad neil alles esimese postnataalse 

nädala jooksul. Täiskasvanutel on radiaalgliia jätked täiesti kadunud ja asendunud 

ependümaalsete jätketega (Tramontin jt., 2003; Spassky jt., 2005). Osa radaalgliiast 

muutub SVZ astrotsüütideks, mis funktsioneerivad neuraalsete tüvirakkudena (Clarke jt., 

2003). Antud töös esitatud andmetes on ric-8 ekspressiooni näha ka kolmanda vatsakese 

seintes, kus paiknevad tanütsüüdid – ependümaalsed, gliia päritoluga rakud, mille jätked 

ulatuvad sügavale hüpotaalamusse. Arvatakse, et nende funktsiooniks võib olla signaali 

ülekanne tserebrospinaalsest vedelikust kesknärvisüsteemi (Leichan ja Fekete, 2007). 

Ning P5 vanuses on Ric-8 ekspressioon vaadeldav ka neljandas vatsakeses, mis paikneb 

ajusilla ja väikeaju vahel. Mitmed autorid on pakkunud, et ependümaalsed rakud võivad 

käituda neuraalsete tüvirakkudena (Johansson jt., 1999). Nende andmete põhjal võiks 

spekuleerida, et Ric-8 ei ekspresseeru postnataalses arengus jagunevates radiaalgliia 

rakkudes, kuid on vajalik vatsakesi vooderdavais ependümaalsetes rakkudes ja/või SVZ 

rakkudes. Kindlaid tõendeid pakuks täpsem uurimus, kus Ric-8 ekspressiooni näidataks 

raku tasandil. 

Peale SVZ toodetakse täiskasvanud kesknärvisüsteemis uusi rakke veel 

hammaskäärus ja väikeaju välimises granulaarses kihis (Jacobson ja Rao, 2005). Antud 

töös saadud tulemustes on Ric-8 ekspressioon hammaskäärus vaadeldav (Tõnissoo jt., 

2006). Välimine granulaarne rakukiht on vaid 6-8 raku diameetrit paks, seega käesolevas 

töös ei saa kindlalt väita, et Ric-8 on seal ekspresseerunud. Seda piirkonda peaks 

usaldusväärsete tulemuste saamiseks täpsemalt iseloomustama. 

Ric-8 ekspressioon on detekteeritav nii postnataalselt P1-P5 kui täiskasvanud 

hiire ajus (Tõnissoo jt. 2003) ka hipokampuse CA1, CA2, CA3 piirkondades, kus 

paiknevad püramidaalsed rakud. Hipokampust peetakse vastutavaks pikaajalise mälu ja 

ruumilise navigatsiooni eest (Echenbaum jt., 1999). Käitumiskatsetes on näidatud, et Ric- 

8 defitsiidi korral nendes valdkondades võimekus väheneb (Tõnissoo jt. 2006). Ric-8 

ekspressioon on postnataalsel ning täiskasvanud hiirel (Tõnissoo jt., 2003) vaadeldav veel 

33

ajukoores 2/3 kihis. Seal paiknevad väikesed ja keskmise suurusega püramidaalsed rakud. 

3. kihi kortikaalsed neuronid saadavad eferentseid signaale välja subkortikaalsetesse 

struktuuridesse nagu haistesagarad, basaalganglionid ja taalamus. Korteksisse tulevad 

neist struktuuridest signaalid mööda aferentseid 1.-3. kihi neuroneid. Lisaks on 

haistesagarate apikaalsel poolel Ric-8 ekspressioon alates P3 vanusest detekteeritav. 

Püramiidrakud on kortikospinaaltrakti põhi koostisosa. Püramidaalrakkude aksonitele 

mõjuvad erinevad kasvufaktorid, et moodustuks õiged sünaptilised ühendused (Salimi jt., 

2008). Kuna prefrontaalne korteks võtab vastu informatsiooni aju piirkondadest, mis 

saavad erutusi kõikidest keha sensoorsetest allikatest, peavad püramidaalsed rakud 

töötlema erinevat informatsiooni (Elston, 2003). Rotil on näidatud, et püramiidrakud 

läbivad mitmeid järske muutusi varases postnataalses arengus. P3-P21 suureneb 

püramiidrakkude soma kaks korda, apikaalne dendriit pikeneb viiekordselt ning basaalne 

dendriit 13 korda. Selle arenguperioodi jooksul väheneb ka membraani puhkepotentsiaal, 

väheneb membraani vastupidavus ja suurenevad aktsioonipotentsiaalide tippväärtused 

(Zang, 2004). Biokeemilistest uuringutest on teada, et Ric-8 on võimeline säilitama G- 

valgu poolt vahendatud stiimulit määramatu aja vältel, pärast retseptorilt saadud signaali 

lõppemist (Tall jt. 2003). Seega võib oletada, et G valkude vahendatud signalisatsioon on 

püramidaalrakkudes aktiivne ning Ric-8 toimib signaali pikendajana. 

Lähtuvalt diferentseerunud neuronite spetsiifilise ric-8 konditsionaalse knockout 

loomade fenotüübi kirjeldusest, võib väita, et Ric-8 puudus diferentseerunud neuronitest 

on letaalne postnataalselt P4-P5. Mutantsetel hiirtel esineb tugev neuroloogiline 

fenotüüp, mis viitab probleemidele G valkudega seotud sünaptilises siganalisatsiooni 

masinavärgis. Katsed ric-8 mutantsete nematoodidega on näidanud, et Ric-8 puudus 

põhjustab neil tugevaid neuroloogilisi häireid, nagu refleksid nagu rinnapiima 

imemisvõime ja valutundlikkus on ric-8 keha painutamise võime vähenemine, munemise 

vähenemine, ataksia (Miller jt., 2001). Teatavad refleksid nagu näiteks valutundlikkus ja 

imemisrefleks, on konditsionaalsetel ric-8 mutantidel säilinud. Soole motoorika tundub 

normaalne. Samas esineb lihastremor, tugevad tasakaaluhäired, tõmblused, mille põhjuste 

täpne biokeemiline analüüs ja surma põhjuste välja selgitamine vajaks kindlasti 

täiendavaid uuringuid. 

34

KOKKUVÕTE 

Käesoleva bakalureusetöö eesmärkideks oli kirjeldada nukleotiidivahetusfaktor 

Ric-8 ja SynapsinICre transgeeni neurospetsiifilist ekspressiooni hiire varajases 

postnataalses arengus ning iseloomustada SynICre;ric-8 lacZ/lox genotüübiga Ric-8 

konditsionaalset knockout hiirt. Konditsionaalsete mutantide kirjeldamiseks mõõdeti ja 

kaaluti P0-P5 vanuseid SynICre;ric-8 lacZ/lox genotüübiga hiirepoegi ning nende 

pesakonnakaaslasi. Neil dissekteeriti peaajud, ning tehti külmlõigud, millel teostati β- 

galaktosidaasi värvusreaktsioon. Samal viisil käituti SynapsinICre transgeensete ja 

heterosügootsete ric-8 lacZ/+ hiirtega. 

Töö kokkuvõtteks tehti järgmised järeldused: 

• Neurospetsiifiline SynICre;ric-8 lacZ/lox konditsionaalne hiired on võimelised 

sündima, kuid surevad P4-P5 postnataalsel arengupäeval. Konditsionaalsed ric-8 

knockout hiired on väiksemad, ebaproportsionaalse kehaehitusega omades tugevat 

neuraalset fenotüüpi. 

• SynICre rekombinaasne aktiivsus on SynICre;ric-8 lacZ/lox genotüübiga hiirtes 

neurospetsiifiline. 

• SynapsinICre ja Ric-8 ekspressiooni mustrid kattuvad postnataalses (P1-P5) hiire 

peaajus suures ulatuses. 

• Postnataalses SynICre;ric-8 lacZ/lox hiire ajus ei olnud morfoloogiliselt olulist 

erinevust võrreldes ric-8 lacZ/+ heterosügootse hiireliiniga. 

35

Nucleotide exhange factor Ric-8 (Synembryn) in mouse postnatal neurogenesis 

Katrin Ruisu 

Summary 

Current study is dedicated to researching the function of Ric-8 in early postnatal 

development of newborn mice. Nucleotide exhange factor Ric-8 has been proven to play 

important role in G-protein mediated synaptic transmission and asymmetric cell division 

in embryogenesis and neurogenesis. It has been demonstrated that absence of Ric-8 is 

lethal in early embryogenesis to C. elegans, Drosophila and mouse. To assess the role of 

Ric-8 in later stages of development, ric-8 conditional knockout model was constructed, 

using Cre/LoxP system where Cre is under Synapsin I promotor. These conditional 

mutants were able to go trough birth, but they died by postnatal day P4-P5. In present 

study it is shown that they were lighter than their littermates and they displayed little 

increase in body mass. They developed a deformed body shape. They also could not 

stand on their feet but rather lied on their sides. A light tremor was also observed. Since 

Ric-8 conditional mutants displayed a neuronal phenotype, P1, P3, P5 brains were 

collected and made into cryosections. For comparison the P1, P3, P5 brains of ric-8 lacZ/+ 

and SynapsinICre +/- mice were also collected and sectioned. Sections were stained with 

X-gal. This was the first time anyone has described an expression in those three 

genotypes this early in the postnatal brain. It was shown that SynapsinICre and Ric-8 

expression patterns match in great amplitudes in postnatal (P1-P5) brain. Postnatal 

SynICre;ric-8 lacZ/lox and ric-8 lacZ/+ heterosygous did not differ morphologically 

36

Tänusõnad 

Tänan professor Alar Karist, professor Margus Poogat, juhendajaid Sirje Lullat ja Tambet 

Tõnissood, Riho Meierit ja kõiki teisi abivalmis kolleege, kes aitasid kaasa uurimustöö 

valmimisele. 

37

KIRJANDUSE LOETELU 

Afshar, K., Willard, F. S., Colombo, K., Johnston, C. A., McCudden, C. R., Siderovski, 

D. P., and Gonczy, P. (2004). RIC-8 is required for GPR-1/2-dependent Galpha 

function during asymmetric division of C. elegans embryos. Cell 119, 219-230. 

Afshar, K., Willard, F. S., Colombo, K., Siderovski, D. P., and Gonczy, P. (2005). 

Cortical localization of the Galpha protein GPA-16 requires RIC-8 function 

during C. elegans asymmetric cell division. Development 132, 4449-4459. 

Barski, J. J., Dethleffsen, K., and Meyer, M. (2000). Cre recombinase expression in 

cerebellar Purkinje cells. Genesis 28, 93-98. 

Bastiani, C., and Mendel, J. (2006). Heterotrimeric G proteins in C. elegans. WormBook, 

1-25. 

Bayer, S. A. (1982). Changes in the total number of dentate granule cells in juvenile and 

adult rats: a correlated volumetric and 3H-thymidine autoradiographic study. Exp 

Brain Res 46, 315-323. 

Bornancin, F., Pfister, C., and Chabre, M. (1989). The transitory complex between 

photoexcited rhodopsin and transducin. Reciprocal interaction between the retinal 

site in rhodopsin and the nucleotide site in transducin. Eur J Biochem 184, 687- 

698. 

Buchman, J. J., and Tsai, L. H. (2007). Spindle regulation in neural precursors of flies 

and mammals. Nat Rev Neurosci 8, 89-100. 

Campbell, K. (2005). Cortical neuron specification: it has its time and place. Neuron 46, 

373-376. 

Ceccaldi, P. E., Grohovaz, F., Benfenati, F., Chieregatti, E., Greengard, P., and Valtorta, 

F. (1995). Dephosphorylated synapsin I anchors synaptic vesicles to actin 

cytoskeleton: an analysis by videomicroscopy. J Cell Biol 128, 905-912. 

Clarke, D. L. (2003). Neural stem cells. Bone Marrow Transplant 32 Suppl 1, S13-17. 

Couwenbergs, C., Spilker, A. C., and Gotta, M. (2004). Control of embryonic spindle 

positioning and Galpha activity by C. elegans RIC-8. Curr Biol 14, 1871-1876. 

38

Crespo, D., Stanfield, B. B., and Cowan, W. M. (1986). Evidence that late-generated 

granule cells do not simply replace earlier formed neurons in the rat dentate gyrus. 

Exp Brain Res 62, 541-548. 

David, N. B., Martin, C. A., Segalen, M., Rosenfeld, F., Schweisguth, F., and Bellaiche, 

Y. (2005). Drosophila Ric-8 regulates Galphai cortical localization to promote 

Galphai-dependent planar orientation of the mitotic spindle during asymmetric 

cell division. Nat Cell Biol 7, 1083-1090. 

Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., and Alvarez-Buylla, A. (1999). 

Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. 

Cell 97, 703-716. 

Elston, G. N., (2003). Cortex, cognition and the cell: new insights into the pyramidal 

neuron and prefrontal function. Cereb. Cortex 13 (11): 1124–38. 

Gage, F. H., Kempermann, G., Palmer, T. D., Peterson, D. A., Ray, J., (1998) Multipotent 

Progenitor Cells in the Adult Dentate Gyrus. J. Neurobiol. 36(2):249-66. 

Gao, B., Mumby, S., and Gilman, A. G. (1987). The G protein beta 2 complementary 

DNA encodes the beta 35 subunit. J Biol Chem 262, 17254-17257. 

Gelman, D. M., Noain, D., Avale, M. E., Otero, V., Low, M. J., and Rubinstein, M. 

(2003). Transgenic mice engineered to target Cre/loxP-mediated DNA 

recombination into catecholaminergic neurons. Genesis 36, 196-202. 

Ghashghaei, H. T., Lai, C., and Anton, E. S. (2007). Neuronal migration in the adult 

brain: are we there yet? Nat Rev Neurosci 8, 141-151. 

Gilbert, S., (2003) Developmental biology 7th ed., Sinauer Associates, Inc. Sunderland, 

Massachusetts. 

Gonczy, P. (2002). Mechanisms of spindle positioning: focus on flies and worms. Trends 

Cell Biol 12, 332-339. 

Gotz, M., and Huttner, W. B. (2005). The cell biology of neurogenesis. Nat Rev Mol Cell 

Biol 6, 777-788. 

Green, S. A., Spasoff, A. P., Coleman, R. A., Johnson, M., and Liggett, S. B. (1996). 

Sustained activation of a G protein-coupled receptor via "anchored" agonist 

binding. Molecular localization of the salmeterol exosite within the 2-adrenergic 

receptor. J Biol Chem 271, 24029-24035. 

39

Greengard, P., Valtorta, F., Czernik, A. J., and Benfenati, F. (1993). Synaptic vesicle 

phosphoproteins and regulation of synaptic function. Science 259, 780-785. 

Grill, S. W., Gonczy, P., Stelzer, E. H., and Hyman, A. A. (2001). Polarity controls forces 

governing asymmetric spindle positioning in the Caenorhabditis elegans embryo. 

Nature 409, 630-633. 

Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., and Rajewsky, K. (1994). Deletion of 

a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene 

targeting. Science 265, 103-106. 

Gupta, A., Tsai, L. H., and Wynshaw-Boris, A. (2002). Life is a journey: a genetic look at 

neocortical development. Nat Rev Genet 3, 342-355. 

Hampoelz, B., Hoeller, O., Bowman, S. K., Dunican, D., and Knoblich, J. A. (2005). 

Drosophila Ric-8 is essential for plasma-membrane localization of heterotrimeric 

G proteins. Nat Cell Biol 7, 1099-1105. 

Hasue, F., Kuwaki, T., Kisanuki, Y. Y., Yanagisawa, M., Moriya, H., Fukuda, Y., and 

Shimoyama, M. (2005). Increased sensitivity to acute and persistent pain in 

neuron-specific endothelin-1 knockout mice. Neuroscience 130, 349-358. 

Hirasawa, M., Cho, A., Sreenath, T., Sauer, B., Julien, J. P., and Kulkarni, A. B. (2001). 

Neuron-specific expression of Cre recombinase during the late phase of brain 

development. Neurosci Res 40, 125-132. 

Hoesche, C., Sauerwald, A., Veh, R. W., Krippl, B., and Kilimann, M. W. (1993). The 5'- 

flanking region of the rat synapsin I gene directs neuron-specific and 

developmentally regulated reporter gene expression in transgenic mice. J Biol 

Chem 268, 26494-26502. 

Horvitz, H. R., and Herskowitz, I. (1992). Mechanisms of asymmetric cell division: two 

Bs or not two Bs, that is the question. Cell 68, 237-255. 

Hosaka, M., and Sudhof, T. C. (1998). Synapsin III, a novel synapsin with an unusual 

regulation by Ca2+. J Biol Chem 273, 13371-13374. 

Hyman, A. A., and White, J. G. (1987). Determination of cell division axes in the early 

embryogenesis of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol 105, 2123-2135. 

Jacobson, M., and Rao, M. S. (2005). Developmental neurobiology. Kluwer 

Academic/Plenum, New York. 

40

Johansson, C. B., Momma S., Clarke, D. L., Risling, M., Lendahl, U., Frisen, J., (1999) 

Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous 

system. Cell 96: 25-34 

Kao, H. T., Porton, B., Czernik, A. J., Feng, J., Yiu, G., Haring, M., Benfenati, F., and 

Greengard, P. (1998). A third member of the synapsin gene family. Proc Natl 

Acad Sci U S A 95, 4667-4672. 

Klattenhoff, C., Montecino, M., Soto, X., Guzman, L., Romo, X., Garcia, M. A., 

Mellstrom, B., Naranjo, J. R., Hinrichs, M. V., and Olate, J. (2003). Human brain 

synembryn interacts with Gsalpha and Gqalpha and is translocated to the plasma 

membrane in response to isoproterenol and carbachol. J Cell Physiol 195, 151- 

157. 

Knoblich, J. A. (2008). Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell 132, 583-597. 

Komuro, H., and Rakic, P. (1995). Dynamics of granule cell migration: a confocal 

microscopic study in acute cerebellar slice preparations. J Neurosci 15, 1110- 

1120. 

Korets-Smith, E., Lindemann, L., Tucker, K. L., Jiang, C., Kabacs, N., Belteki, G., 

Haigh, J., Gertsenstein, M., and Nagy, A. (2004). Cre recombinase specificity 

defined by the tau locus. Genesis 40, 131-138. 

Lambert-Langlais, S., Val, P., Guyot, S., Ragazzon, B., Sahut-Barnola, I., De Haze, A., 

Lefrancois-Martinez, A. M., and Martinez, A. (2009). A transgenic mouse line 

with specific Cre recombinase expression in the adrenal cortex. Mol Cell 

Endocrinol 300, 197-204. 

Lechan, R. M., Fekete, C. (2007) Infundibular tanycytes as modulators of neuroendocrine 

function: hypothetical role in the regulation of the thyroid and gonadal axis Acta 

Biomed 2007; 78; Suppl 1: 84-98 

Li, X., Rosahl, T. W., Sudhof, T. C., and Francke, U. (1995). Mapping of synapsin II 

(SYN2) genes to human chromosome 3p and mouse chromosome 6 band F. 

Cytogenet Cell Genet 71, 301-305. 

Lindeberg, J., Usoskin, D., Bengtsson, H., Gustafsson, A., Kylberg, A., Soderstrom, S., 

and Ebendal, T. (2004). Transgenic expression of Cre recombinase from the 

tyrosine hydroxylase locus. Genesis 40, 67-73. 

41

Lulla, S., (2008) Nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 hiire varajases embrüogeneesis (E5,5- 

8,5). Magistritöö 

Matsuzaki, F. (2005). Drosophila G-protein signalling: intricate roles for Ric-8? Nat Cell 

Biol 7, 1047-1049. 

May, P., Rohlmann, A., Bock, H. H., Zurhove, K., Marth, J. D., Schomburg, E. D., 

Noebels, J. L., Beffert, U., Sweatt, J. D., Weeber, E. J., and Herz, J. (2004). 

Neuronal LRP1 functionally associates with postsynaptic proteins and is required 

for normal motor function in mice. Mol Cell Biol 24, 8872-8883. 

Miller, K. G., Alfonso, A., Nguyen, M., Crowell, J. A., Johnson, C. D., and Rand, J. B. 

(1996). A genetic selection for Caenorhabditis elegans synaptic transmission 

mutants. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 12593-12598. 

Miller, K. G., Emerson, M. D., McManus, J. R., and Rand, J. B. (2000). RIC-8 

(Synembryn): a novel conserved protein that is required for G(q)alpha signaling 

in the C. elegans nervous system. Neuron 27, 289-299. 

Miller, K. G., and Rand, J. B. (2000). A role for RIC-8 (Synembryn) and GOA-1 

(G(o)alpha) in regulating a subset of centrosome movements during early 

embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics 156, 1649-1660. 

Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O., and Parnavelas, J. G. (2002). Ventricledirected 

migration in the developing cerebral cortex. Nat Neurosci 5, 218-224. 

Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., and Pearlman, A. L. 

(2001). Two modes of radial migration in early development of the cerebral 

cortex. Nat Neurosci 4, 143-150. 

Nadarajah, B., and Parnavelas, J. G. (2002). Modes of neuronal migration in the 

developing cerebral cortex. Nat Rev Neurosci 3, 423-432. 

Nagy, A. (2000). Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis 

26, 99-109. 

Niwa-Kawakita, M., Abramowski, V., Kalamarides, M., Thomas, G., and Giovannini, M. 

(2000). Targeted expression of Cre recombinase to myelinating cells of the central 

nervous system in transgenic mice. Genesis 26, 127-129. 

42

Nurrish, S., Segalat, L., and Kaplan, J. M. (1999). Serotonin inhibition of synaptic 

transmission: Galpha(0) decreases the abundance of UNC-13 at release sites. 

Neuron 24, 231-242. 

Pieribone, V. A., Shupliakov, O., Brodin, L., Hilfiker-Rothenfluh, S., Czernik, A. J., and 

Greengard, P. (1995). Distinct pools of synaptic vesicles in neurotransmitter 

release. Nature 375, 493-497. 

Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., and Ghosh, A. (2002). Control 

of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. 

Development 129, 3147-3160. 

Rempe, D., Vangeison, G., Hamilton, J., Li, Y., Jepson, M., and Federoff, H. J. (2006). 

Synapsin I Cre transgene expression in male mice produces germline 

recombination in progeny. Genesis 44, 44-49. 

Reynolds, N. K., Schade, M. A., and Miller, K. G. (2005). Convergent, RIC-8-dependent 

Galpha signaling pathways in the Caenorhabditis elegans synaptic signaling 

network. Genetics 169, 651-670. 

Rosahl, T. W., Geppert, M., Spillane, D., Herz, J., Hammer, R. E., Malenka, R. C., and 

Sudhof, T. C. (1993). Short-term synaptic plasticity is altered in mice lacking 

synapsin I. Cell 75, 661-670. 

Rosahl, T. W., Spillane, D., Missler, M., Herz, J., Selig, D. K., Wolff, J. R., Hammer, R. 

E., Malenka, R. C., and Sudhof, T. C. (1995). Essential functions of synapsins I 

and II in synaptic vesicle regulation. Nature 375, 488-493. 

Sadler, T. W. (2005). Embryology of neural tube development. Am J Med Genet C Semin 

Med Genet 135C, 2-8. 

Salimi, I., Friel, K. M., Martin, J. H., (2008). Pyramidal tract stimulation restores normal 

corticospinal tract connections and visuomotor skill after early postnatal motor 

cortex activity blockade. J. Neurosci. 28 (29): 7426–34. 

Sanada, K., and Tsai, L. H. (2005). G protein betagamma subunits and AGS3 control 

spindle orientation and asymmetric cell fate of cerebral cortical progenitors. Cell 

122, 119-131. 

Sanes, D. H., Reh, T. A., and Harris, W. A. (2000). Development of the nervous system. 

Academic Press, San Diego, Calif. 

43

Sauer, B., and Henderson, N. (1988). Site-specific DNA recombination in mammalian 

cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 

5166-5170. 

Schade, M. A., Reynolds, N. K., Dollins, C. M., and Miller, K. G. (2005). Mutations that 

rescue the paralysis of Caenorhabditis elegans ric-8 (synembryn) mutants activate 

the G alpha(s) pathway and define a third major branch of the synaptic signaling 

network. Genetics 169, 631-649. 

Schneider, S. Q., and Bowerman, B. (2003). Cell polarity and the cytoskeleton in the 

Caenorhabditis elegans zygote. Annu Rev Genet 37, 221-249. 

Soriano, P. (1999). Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. 

Nat Genet 21, 70-71. 

Spassky, N., Merkle, F.T., Flames, N., Tramontin, A.D., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez- 

Buylla, A., (2005) Adult ependymal cells are postmitotic and are derived from 

radial glial cells during embryogenesis, J. Neurosci. 25: 10–18. 

Stanfield, B. B., and Trice, J. E. (1988). Evidence that granule cells generated in the 

dentate gyrus of adult rats extend axonal projections. Exp Brain Res 72, 399-406. 

Street, K. A., Xu, G., Hall, K. L., Intano, G. W., McCarrey, J. R., Herbert, D. C., 

Kilimann, M. W., and Walter, C. A. (2005). Rat synapsin 1 promoter mediated 

transgene expression in testicular cell types. DNA Cell Biol 24, 133-140. 

Zambrowicz, B. P., Imamoto, A., Fiering, S., Herzenberg, L. A., Kerr, W. G., and 

Soriano, P. (1997). Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 

gene trap strain leads to widespread expression of beta-galactosidase in mouse 

embryos and hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 3789-3794. 

Zhang, Z. W., (2004) Maturation of layer V pyramidal neurons in the rat prefrontal 

cortex: intrinsic properties and synaptic function. J. Neurophysiol. 91 (3): 1171– 

82 

Zhang, X. M., Ng, A. H., Tanner, J. A., Wu, W. T., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., and 

Huang, J. D. (2004). Highly restricted expression of Cre recombinase in 

cerebellar Purkinje cells. Genesis 40, 45-51. 

Zhu, Y., Romero, M. I., Ghosh, P., Ye, Z., Charnay, P., Rushing, E. J., Marth, J. D., and 

Parada, L. F. (2001). Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal 

44

development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev 15, 

859-876. 

Zigman, M., Cayouette, M., Charalambous, C., Schleiffer, A., Hoeller, O., Dunican, D., 

McCudden, C. R., Firnberg, N., Barres, B. A., Siderovski, D. P., and Knoblich, J. 

A. (2005). Mammalian inscuteable regulates spindle orientation and cell fate in 

the developing retina. Neuron 48, 539-545. 

Takei, Y., Harada, A., Takeda, S., Kobayashi, K., Terada, S., Noda, T., Takahashi, T., 

and Hirokawa, N. (1995). Synapsin I deficiency results in the structural change in 

the presynaptic terminals in the murine nervous system. J Cell Biol 131, 1789- 

1800. 

Tall, G. G., and Gilman, A. G. (2004). Purification and functional analysis of Ric-8A: a 

guanine nucleotide exchange factor for G-protein alpha subunits. Methods 

Enzymol 390, 377-388. 

Tall, G. G., Krumins, A. M., and Gilman, A. G. (2003). Mammalian Ric-8A (synembryn) 

is a heterotrimeric Galpha protein guanine nucleotide exchange factor. J Biol 

Chem 278, 8356-8362. 

Terada, S., Tsujimoto, T., Takei, Y., Takahashi, T., and Hirokawa, N. (1999). Impairment 

of inhibitory synaptic transmission in mice lacking synapsin I. J Cell Biol 145, 

1039-1048. 

Tõnissoo, T., Koks, S., Meier, R., Raud, S., Plaas, M., Vasar, E., and Karis, A. (2006). 

Heterozygous mice with Ric-8 mutation exhibit impaired spatial memory and 

decreased anxiety. Behav Brain Res 167, 42-48. 

Tonissoo, T., Lulla, S., Meier, R., Pooga, M., Karis., A (2009) Nucleotide exchange 

factor Ric-8 is indispensable in mammalian early development Mol. Cell 

Biol.Submitted 

Tõnissoo, T., Meier, R., Talts, K., Plaas, M., and Karis, A. (2003). Expression of ric-8 

(synembryn) gene in the nervous system of developing and adult mouse. Gene 

Expr Patterns 3, 591-594. 

Wang, H., Ng, K. H., Qian, H., Siderovski, D. P., Chia, W., and Yu, F. (2005). Ric-8 

controls Drosophila neural progenitor asymmetric division by regulating 

heterotrimeric G proteins. Nat Cell Biol 7, 1091-1098. 

45

Wilkie, T. M., and Kinch, L. (2005). New roles for Galpha and RGS proteins: 

communication continues despite pulling sisters apart. Curr Biol 15, R843-854. 

Xia, C.H., Roberts, E.A., Her, L.S., Liu, X., Williams, D.S., Cleveland, D.W. & 

Goldstein, L.S. (2003) Abnormal neurofilament transport caused by targeted 

disruption of neuronal kinesin heavy chain KIF5A. J. Cell Biol., 161, 55–66. 

Yingling, J., Youn, J. H., Darling, D., Toyo-oka,-K., Pramparo, T., Hirotsune, S., 

Wynshaw-Boris, A. (2008) Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 

for precise spindle orientation and symmetric division. Cell 132, 474–486, 

46

Nukleotiidivahetusfaktor Ric-8 (Synembryn) hiire postnataalses ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?