Pseudomonas syringae pv. tomato levaansukraasi Lsc3 struktuuri ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

GENEETIKA ÕPPETOOL 

Karin Mardo 

Pseudomonas syringae pv. tomato levaansukraasi Lsc3 struktuuri 

modelleerimine ja mutantide iseloomustamine 

Magistritöö 

Juhendajad: dots Tiina Alamäe, bioloogiakandidaat 

Triinu Visnapuu, magister 

TARTU 2011

SISUKORD 

SISUKORD .........................................................................................................................................2 

KASUTATUD LÜHENDID ...............................................................................................................3 

SISSEJUHATUS .................................................................................................................................4 

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE .....................................................................................................5 

1.1 Fruktosüüli transferaasid: levaansukraasid ja inulosukraasid ................................................5 

1.1.1 Levaansukraaside ja inulosukraaside reaktsioonimehhanism ........................................7 

1.1.2 Levaansukraaside omadused ja sünteesitavate produktide spekter ................................8 

1.1.3 Fruktosüüli transferaaside struktuur, katalüütilised aminohapped ja alapiirkonnad ......9 

1.1.4 Levaansukraaside mutatsioonanalüüs...........................................................................13 

2. EKSPERIMENTAALOSA ......................................................................................................16 

2.1 Töö eesmärgid ......................................................................................................................16 

2.2 Materjal ja metoodika ..........................................................................................................17 

2.2.1 Kasutatud bakteritüved ja plasmiidid ...........................................................................17 

2.2.2 Söötmed ja bakterirakkude kasvatamine ......................................................................18 

2.2.3 Levaansukraasi geeni mutantide raamatukogu koostamine ja muteeritud rakkude 

elumuse määramine ......................................................................................................19 

2.2.4 Mutantide selektsioon ...................................................................................................20 

2.2.5 DNA eraldamine, PCR, restriktsioon, ligeerimine ja transformatsioon .......................20 

2.2.6 DNA sekveneerimine ....................................................................................................22 

2.2.7 Levaansukraasi geeni koht-suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 vektorisse22 

2.2.8 Rakuekstraktide tegemine.............................................................................................24 

2.2.9 Valkude puhastamine ....................................................................................................25 

2.2.10 Valkude denatureeriv ja natiivne polüakrüülamiidgeelelektroforees ...........................25 

2.2.11 Levaansukraasi aktiivsuste määramine ........................................................................26 

2.2.12 Õhukese kihi kromatograafia........................................................................................28 

2.2.13 Kasutatud arvutiprogrammid ........................................................................................28 

2.3 Tulemused ja arutelu ............................................................................................................30 

2.3.1 Levaansukraasi geeni mutantide raamatukogu koostamine ja selektsioon 

Escherichia coli’s .........................................................................................................30 

2.3.2 Levaansukraaside järjestuste võrdlemine ning isoleeritud mutantide muteerunud 

positsioonide konserveerumise hindamine ...................................................................32 

2.3.3 Lsc3 valgu 3D struktuuri ennustamine .........................................................................33 

2.3.4 Mutantsete levaansukraaside ekspresseerimine ja esmane iseloomustamine...............34 

2.3.5 Valitud mutantsete levaansukraaside puhastamine ja substraadispetsiifika: võrdlus 

muteerimata Lsc3 valguga ............................................................................................36 

2.3.5.1 Sahharoos ja rafinoos mutantsete levaansukraaside substraatidena ......................36 

2.3.5.2 Levaan mutantsete levaansukraaside substraadina ...............................................38 

2.3.6 Mutantsete levaansukraaside polümeriseerivad omadused ..........................................38 

2.3.7 Mutantsete levaansukraaside termostabiilsus ...............................................................42 

2.3.8 Mutatsioonide paigutamine Lsc3 valgu mudelile ja mutantsete fenotüüpide analüüs .44 

KOKKUVÕTE JA JÄRELDUSED ................................................................................................49 

SUMMARY .......................................................................................................................................51 

KASUTATUD MATERJALID ........................................................................................................53 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID ..............................................................................................59 

LISA 1 

LISA 2 

LISA 3 

2

KASUTATUD LÜHENDID 

ah – aminohape 

ap – aluspaar 

DP – polümerisatsiooniaste (Degree of Polymerization) 

EMS – etüülmetaansulfonaat 

FOS – fruktooligosahhariidid 

FTF – fruktosüüli transferaas 

GH – glükosiidi hüdrolaas 

KA – konserveerumise aste 

k cat – katalüütiline konstant (1/min) 

K i – inhibitsioonikonstant (mM) 

K m – Michaelis’e konstant ehk afiinsus (mM) 

LevU – Zymomonas mobilis’e levaansukraas 

Lsc1, Lsc2 ja Lsc3 – Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasid 

LsdA – Gluconacetobacter diazotrophicus’e levaansukraas 

PAGE – polüakrüülamiidgeelelektroforees 

PDB – valkude andmebaas (Protein Data Bank) 

PEG – polüetüleenglükool 

SacB – Bacillus subtilis’e levaansukraas 

SacC – Zymomonas mobilis’e rakuväline invertaas 

TA – transfruktosüleeriv aktiivsus 

TLC – õhukese kihi kromatograafia 

V max – maksimaalne reaktsioonikiirus (U/mg) 

WT – metsiktüüpi (muteerimata) valk 

3

SISSEJUHATUS 

Levaansukraasid kuuluvad glükosiidi hüdrolaaside perekonda 68, nad lagundavad sahharoosi ja 

polümeriseerivad fruktoosijääke. Reaktsiooniproduktideks on nii polümeerne levaan 

(sidemetüübiga β-2,6) kui ka lühema ahelaga fruktooligosahhariidid. Levaanile ja 

fruktooligosahhariididele on leitud mitmeid biotehnoloogilisi kasutusvõimalusi. 

Levaansukraaside aktiivtsentri ehitust on iseloomustatud ning välja on pakutud ka ensüümi 

reaktsioonimehhanism. Kristallstruktuure on analüüsitud Bacillus subtilis’e, B. megaterium’i ja 

Gluconacetobacter diazotrophicus’e levaansukraasidel. Siiski ei ole seni teada, millised 

aminohapped osalevad sünteesitava sideme tüübi, fruktaanahela pikkuse, substraatide spektri 

ning erinevate fruktosüüli aktseptorite kasutamise määramisel. 

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasil Lsc3 on kõrge katalüütiline aktiivsus 

ning ta sünteesib sahharoosist levaani, fruktooligosahhariide ja heterooligofruktaane. Seega on 

Lsc3 valgul kindlasti biotehnoloogilist potentsiaali. 

Valgu muteerimine koht-spetsiifiliselt või juhuslikult annab võimaluse kirjeldada 

levaansukraaside struktuuri ja funktsiooni vahelisi seoseid ning otsida vastuseid seni veel 

lahendamata küsimustele. Oma magistritöös tekitasin, selekteerisin ja iseloomustasin P. syringae 

pv. tomato Lsc3 valgu juhuslikke mutante. 

Töö tehti Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudis Geneetika õppetoolis, ETF 

granti GLOMR 7528 raames. 

Minu töö eesmärke on kirjeldatud peatükis 2.1. 

Tänan oma juhendajaid Tiina Alamäed, kes aitas käesolevat tööd koostada, ning Triinu 

Visnapuud, kes oli abiks praktilise töö planeerimisel. Samuti soovin tänada teisi TÜMRI 

töötajaid, kes selle töö valmimisele kaasa aitasid. 

4

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

1.1 Fruktosüüli transferaasid: levaansukraasid ja inulosukraasid 

Suhkrutele toimivate valkude andmed on koondatud CAZy andmebaasi (Carbohydrate-Active 

enZYmes; http://www.cazy.org). Sinna kuuluvad ka glükosiidi hüdrolaasid (GH), mille hulka 

liigitatakse glükosiidsidet lagundavad ensüümid. GH klanni J kuuluvad ensüümide perekonnad 

32 ja 68. Perekond GH32 sisaldab tüüpilisi fruktaanide hüdrolaase, näiteks taimseid ja 

bakteriaalseid invertaase, inulinaase ja levanaase. Lisaks on sellesse rühma klassifitseeritud ka 

taimede fruktaanide biosünteesis osalevad fruktosüüli transferaasid (FTF-d), mida on leitud 

näiteks korvõielistest (sigur), kõrrelistest (karjamaa-raihein, oder) ning laugulistest (sibul). Et 

taimed saaksid sünteesida pikemaid fruktaane, on neil vaja vähemalt kahte FTF-i. Esimene neist 

sünteesib sahharoosist trisahhariid 1-kestoosi, mis on omakorda teisele ensüümile substraadiks 

ning moodustub pikemaahelaline inuliin. Taimsetes fruktaanides on fruktoosijääkide vahel 

enamasti β-2,1 side (Edelman ja Jefford, 1968; van den Ende ja van Laere, 1996). 

Perekonda GH68 kuuluvad bakteriaalsed levaansukraasid (EC 2.4.1.10), inulosukraasid (EC 

2.4.1.9) ja β-fruktofuranosidaasid ehk invertaasid (EC 3.2.1.26). Levaansukraasid sünteesivad 

sahharoosist levaani tüüpi β-2,6 sidemega fruktaane, inulosukraaside produktiks on β-2,1 

sidemetüübiga inuliin ning invertaasid hüdrolüüsivad sahharoosi ning fruktaane. Erinevalt 

taimedest piisab bakteritele ainult ühest ensüümist, et sünteesida erineva pikkusega fruktaane 

(http://www.cazy.org). 

Bakteriaalsed FTF-d (levaan- ja inulosukraasid) on rakuvälised või -pinnaga seotud ensüümid 

ning nende produktideks on eelkõige suure molekulmassiga (20 kDa kuni mitu MDa) levaani või 

inuliini polümeerid. Bakteriaalsed FTF-d katalüüsivad kahte erinevat reaktsiooni. Kui 

reaktsioonis on fruktosüüli aktseptoriks vesi, siis toimub substraadi hüdrolüüs. Kui 

aktseptorpiirkonda seondub näiteks sahharoos, 1-kestoos või mõni muu suhkrumolekul, siis 

seotakse fruktoosijääk aktseptoriga ning toimub transfruktosüleerimine (Ozimek et al., 2006). 

Sõltuvalt substraadi kontsentratsioonist on eelistatud kas hüdrolüüs või polümeriseerimine. 

Näiteks madalal substraadi kontsentratsioonil (

Fruktosüüli transferaasidest on enim uuritud levaansukraase. Grampositiivsetest bakteritest on 

levaansukraase leitud näiteks liikidel B. subtilis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, 

Streptococcus salivarius, S. mutants, Lactobacillus sanfranciscensis, Lb. reuteri, Lb. gasseri ja 

Leuconostoc mesenteroides (Chambert et al., 1974; Ebisu et al., 1975; Tieking et al.,2005; 

Morales-Arrieta et al., 2006; Ozimek et al., 2006; Homann et al., 2007; Anwar et al., 2010; 

Rairakhwada et al., 2010). Gramnegatiivstest bakteritest on levaansukraase kirjeldatud näiteks 

liikidel Zymomonas mobilis, Gluconacetobacter diazotrophicus, Pseudomonas syringae pv. 

tomato, P. syringae pv. glycinea, Eriwinia herbicola ja E. amylovora (Cote, 1988; Gunasekaran 

et al., 1995; Arrieta et al., 1996; Bereswill ja Geider, 1997; Li et al., 2006; Visnapuu et al., 2008). 

Vähem on teada bakteriaalseid inulosukraase. Neid on seni leitud ainult grampositiivsetest 

bakteritest: Bacillus sp., S. mutans, L. citreum, Lb. reuteri, Lb. johnsonii ja Lb. gasseri (Rosell ja 

Birkhed, 1974; Olivares-Illana et al., 2002; van Hijum et al., 2002; Wada et al., 2003; Schwab et 

al., 2007; Anwar et al., 2008; Anwar et al., 2010). Ühes bakteris võivad esineda ka mõlemad 

ensüümid. Näiteks piimhappebakteril Lb. reuteri 121 on olemas nii levaansukraas kui ka 

inulosukraas (van Hijum et al., 2002; van Hijum et al., 2004). 

Oligo- ja polüfruktaanide rolli bakteri jaoks on suhteliselt vähe uuritud, kuid arvatakse, et nad 

võivad olla seotud bakterirakkude vastupidavuse suurendamise, pindadele kinnitumise ja 

taimepatogeneesiga (Erwinia ja Pseudomonas’e liigid), aga ka sümbioosiga taime ja bakteri 

vahel (G. diazotrophicus) (Hernandez et al., 1995; Hettwer et al., 1995; Bereswill ja Geider, 

1997; Li et al., 2006). Mullabakter B. subtilis toodab aga polümeerset levaani vastuseks 

keskkonnastressile ja võib seda kasutada varuainena. Arvatakse, et levaan stabiliseerib bakteri 

membraane, aitab kinnituda mullaosakestele ning kaitseb rakke kuivamise eest. Lisaks võib 

levaanirikas kapsel siduda ka rakule toksilisi aineid (Aymerich, 1990; Ammar et al., 2002; van 

Hijum et al., 2006). Taimepatogeenil E. amylovora on levaansukraas virulentsusfaktoriks – 

vastavad katkestusmutandid ei suuda taimi efektiivselt nakatada (Geier ja Geider, 1993). P. 

syringae patovaride kohta on arvatud, et bakterirakkude võime levaani sünteesida on oluline 

eelkõige taime nakatamise algfaasis. Levaan võib aidata bakteril taime pinnal ellu jääda ning 

pinda koloniseerida, aga ka varjata bakterit taime kaitsemehhanismide eest (Hettwer et al., 1998; 

Li et al., 2006). Suhkruroo kudedes elav õhulämmastiku siduja G. diazotrophicus varustab taime 

lämmastikuga ning sünteesib sahharoosirikkast taimemahlast kestoosi, mida taim saab omakorda 

kasutada varufruktaanide sünteesil (Hernandez et al., 1995). 

6

1.1.1 Levaansukraaside ja inulosukraaside reaktsioonimehhanism 

Levaansukraaside süstemaatiline nimetus on sahharoos: 2,6-β-D-fruktaan 6-β-Dfruktosüültranferaas 

ja inulosukraasid on sahharoos: 2,1-β-D-fruktaan 1-β-Dfruktosüültranferaasid 

(http://www.cazy.org). Need ensüümid ning nende 

reaktsioonimehhanismid on väga sarnased, samas sünteesivad nad erinevat tüüpi glükosiidsidet. 

Nii levaansukraaside kui ka inulosukraaside substraadiks on peamiselt sahharoos, millest 

transfruktosüülimisreaktsiooni käigus moodustuvad kõrge molekulmassiga levaan või inuliin 

ning lühema ahelaga fruktooligosahhariidid (FOS). Fruktaanide süntees algab sahharoosi (GF) 

seostumisest ensüümi aktiivtsentrisse, järgneb glükosiidsideme lagundamine, fruktoosijääk jääb 

aktiivtsentriga kovalentselt seotuks ja glükoos vabaneb keskkonda. Seega eraldub iga ensüümiga 

reageeriva sahharoosi molekuli kohta üks molekul glükoosi ning seda mõõtes on võimalik 

hinnata levaansukraaside ja inulosukraaside koguaktiivsust. Kui ensüümi aktiivtsentri 

aktseptorpiirkonda seostub uus sahharoosi molekul, siis toimub transfruktosüülimine, kus 

esimese produktina moodustub kestoos (GF 2 ). Levaansukraaside puhul on põhiliseks 

sünteesitavaks produktiks 6-kestoos, inulosukraasidel 1-kestoos. Kestoosi võidakse järgevates 

transfruktosüülimisreaktsioonides pikendada. Nii levaansukraasid kui inulosukraasid 

katalüüsivad fruktoosijääkide ülekannet veele, sel juhul toimub substraadi hüdrolüüs. Kui 

aktseptorina toimib glükoos, siis toimub nn. vahetusreaktsioon ja produktina moodustub tagasi 

sahharoos (Meng ja Fütterer, 2003; Martinez-Fleites et al., 2005; Joonis 1). 

Levaansukraaside puhul sünteesitakse levaani fruktoosijääkide vahele β-2,6 side, hargnemised 

toimuvad läbi β-2,1 sidemete (Han, 1990; Anwar et al., 2010). Inuliini peaahel on β-2,1 

sidemetüübiga ja hargnemised on β-2,6 sidemete kaudu (Seymour et al., 1979; van Hijum et al., 

2002; 2004). 

7

On näidatud, et levaansukraasid saavad sahharoosi asemel kasutada mitmeid alternatiivseid 

aktseptormolekule ja sünteesida neist heterooligofruktaane. Näiteks B. subtilis’e levaansukraas 

võib kanda fruktoosijääke D-mannoosile, D-galaktoosile, L- ja D-fukoosile, L- ja D-ksüloosile, 

L-glükoosile, maltoosile, laktoosile, tsellobioosile ning melibioosile (Seibel et al., 2006). 

Sellistele heterooligosahhariididele ennustatakse uudseid bioloogilisi efekte. Näiteks ksüloosi ja 

fruktoosi sisaldavad heterooligofruktaanid võiksid ühendada ksülo- ja fruktooligosahhariidide 

prebiootilised omadused (Bello et al., 2001; Tateyama et al., 2005). 

Joonis 1. Levaansukraasi 

katalüüsitud reaktsioonid. Märgitud 

on vahetusreaktsioon, sahharoosi 

hüdrolüüs, fruktoosijäägi ülekanne 

sahharoosile ja polümeeri teke. 

Kasutatud on joonist artiklist 

Martinez-Fleites et al. (2005). 

1.1.2 Levaansukraaside omadused ja sünteesitavate produktide spekter 

Levaansukraaside eelistatuim substraat on sahharoos (α-D-Glcp-(1→2)β-D-Fruf; GF), aga 

mitmetele neist sobivad substraadiks ka rafinoos (α-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→2)β-D-Fruf; 

GalGF) ja stahhüoos (α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→2)-β-D-Fruf; 

GalGalGF). Kui rafinoosist pärinev fruktoosijääk kantakse üle aktseptormolekulile, siis vabaneb 

kõrvalproduktina melibioos (GalG) (Yanase et al., 2002; Andersone et al., 2004). Rafinoosi 

8

kasutamist substraadina on näidatud B. subtilis’e, G. diazotrophicus’e, Z. mobilis’e, Lb. reuteri ja 

P. syringae pv. tomato levaansukraasidel (Dedonder, 1966; Sangiliyandi et al., 1999; van Hijum 

et al., 2004, Trujillo et al., 2004; Visnapuu et al., 2008). P. syrinage pv. tomato levaansukraas 

Lsc3 eelistab substraatidest sahharoosi rafinoosile ja stahhüoosile, vastavad koguaktiivsuste 

suhted on 100:52:48 (sahharoos: rafinoos: stahhüoos) (Visnapuu et al., 2008; Visnapuu, 2007). 

Samas on Z. mobilis’e LevU valgule sobivaim substraat hoopis rafinoos, sest vastavad 

koguaktiivsuste suhted on 100:117:100 (sahharoos: rafinoos: stahhüoos) (Yanase et al., 2002). 

Inulosukraasidest kasutavad rafinoosi fruktosüüli doonorina bakterite L. citreum ja Lb. reuteri 

ensüümid (Olivares-Illana et al., 2003; Ozimek et al., 2006). Koos rafinoosiga kristalliseeritud 

levaansukraasi struktuuri alusel arvatakse, et rafinoosi ja stahhüoosi molekulide galaktoosi jäägid 

ei sega fruktoosi- ja glükoosijäägi seondumist, sest nad jäävad aktiivtsentrist kaugemale (Meng ja 

Fütterer, 2008). 

Paljude levaansukraaside puhul on näidatud, et moodustuvate produktide spektrit saab mõjutada 

reaktsioonitingimustega. Transfruktosüülimisreaktsiooni soodustab näiteks madal temperatuur. P. 

syringae pv. phaseolicola levaansukraas polümeriseerib kõige rohkem temperatuuril 18ºC, kuid 

substraadi hüdrolüüs toimub kiiremini temperatuuril 60ºC (Hettwer et al., 1995). 

Levaansukraasid sünteesivad kõrgemal sahharoosi kontsentratsioonil rohkem lühema ahelaga 

oligofruktaane. Näiteks P. syringae pv. tomato levaansukraas Lsc3 toodab lisaks levaanile ka 

FOS-e, kui substraadi kontsentratsioon on suurem kui 300 mM (Visnapuu et al., 2009). 

Samasugust seost on nähtud ka grampositiivsete bakterite Lb. sanfranciscensis TMW 1.392 ja B. 

subtilis’e levaansukraasidel (Euzenat et al., 1997; Tieking et al., 2005). 

Üldiselt on grampositiivsete bakterite fruktosüüli transferaasid umbes poole suurema 

molekulmassiga kui gramnegatiivsete bakterite vastavad valgud ja vajavad katalüütiliseks 

aktiivsuseks Ca 2+ -ioone. Arvatavasti seob kaltsiumi ioon valgu erinevaid osi ning stabiliseerib 

sellega tema struktuuri (Meng ja Fütterer, 2003; van Hijum et al., 2004; Ozimek et al., 2005). 

1.1.3 Fruktosüüli transferaaside struktuur, katalüütilised aminohapped ja 

alapiirkonnad 

Glükosiidi hüdrolaaside perekondade 32 ja 68 ensüümidele on omane 5-labalise β-propelleri 

struktuur. Iga laba koosneb neljast antiparalleelsest β-ahelast, mis ümbritsevad negatiivselt laetud 

tasku põhjas olevat aktiivtsentrit (Meng ja Fütterer, 2003; Joonis 2). GH32 perekonna ensüümidel 

9

on lisaks β-propellerile C-terminaalne lisadomään, mis koosneb kahest β-lehest. See struktuur 

võib olla oluline valgu stabiilsuse tagamiseks või ka substraadi tugevamaks sidumiseks 

(Altenbach et al., 2004; Chuankhayan et al., 2010). Praeguseks on kindlaks tehtud B. subtilis’e, 

B. megaterium’i ja G. diazotrophicus’e kristallstruktuurid (vt. Joonis 2; Meng ja Fütterer, 2003; 

Martinez-Fleites et al., 2005; Strube et al., 2011). Nendest kolmest valgust on batsillide 

levaansukraasid järjestuselt omavahel väga sarnased. B. subtilis’e SacB põhiliseks produktiks on 

suure molekulmassiga polümeerne levaan, aga G. diazotrophicus’e levaansukraas (LsdA) 

sünteesib peamiselt lühikesi FOS-e. Seni on teadmata, miks nende kahe valgu produktide 

spektrid on nii erinevad (Meng ja Fütterer, 2003; Martinez-Fleites et al., 2005). Ühegi 

inulosukraasi kohta ei ole veel kristallstruktuuri andmeid saadud. 

Kõikidel uuritud levaan- ja inulosukraasidel on kolm katalüüsis olulist happelist aminohapet, mis 

moodustavad aktiivtsentri katalüütilise kolmiku: kaks aspartaati on vastavalt nukleofiiliks ja 

vaheühendi stabiliseerijaks ning glutamaat on alus-hape katalüüsijaks (vt. Joonis 2B). G. 

diazotrophicus’e levaansukraasi kristallstruktuuri järgi paiknevad katalüütilise kolmiku 

aminohapped propelleri labade sisemistel β-ahelatel ning asuvad üksteisest 4.8-7.4 Å kaugusel 

(Martinez-Fleites et al., 2005). Kõik katatüütilise kolmiku aminohapped on fruktosüüli 

transferaaside ja ka invertaaside seas väga konserveerunud (vt. LISA 1; Martinez-Fleites et al., 

2005). Joonisel 2 on toodud SacB kristallstruktuur ja aktiivtsenter. 

Joonis 2. B. subtilis’e levaansukraas SacB (Protein Data Bank (PDB) ID: 1OYG). Näidatud on 

ensüümi struktuur (A) ja aktiivtsentri lähivaade (B). Paneelil B on roosaga märgitud katalüütilise 

kolmiku aminohapped (Asp86, Asp247 ja Glu342). Punase ovaaliga on tähistatud substraadi 

seondumise -1 alapiirkond, rohelisega +1 alapiirkond. Kasutatud on joonist artiklist Lammens et 

al. (2009). 

10

Substraadi seondumiseks olulisi alapiirkondi levaansukraasi aktiivtsentris on uuritud B. subtilis’e 

sahharoosi ja rafinoosiga kristalliseeritud SacB-l (Meng ja Fütterer, 2003; 2008). 

Struktuuranalüüsi alusel seob -1 alapiirkond suure afiinsusega ja spetsiifiliselt doonorsubstraadi 

fruktoosijääki. Aktiivtsentri +1 alapiirkond on väiksema spetsiifilisusega. Sinna võivad seostuda 

doonorina toimiva sahharoosi ja rafinoosi glükoosijääk ning ka aktseptorina kasutatava 

sahharoosi fruktoosijääk. SacB valgu -1 alapiirkonda kuuluvad Trp85, Asp86, Arg246, Asp247 ja 

Trp163 (vt. Jooniseid 2B ja 4) ning +1 alapiirkonna moodustavad aminohapped Arg246, Glu340, 

Glu342 ja Arg360 (Joonised 2B ja 4) (Meng ja Fütterer, 2008). 

SacB -1 alapiirkonnas moodustab konserveerunud RDP motiivi kuuluv Arg246 H-sidemed 

fruktoosijäägi 3C hüdroksüülgrupiga, RDP motiivi aspartaat (Asp247) moodustab 

vesiniksidemeid fruktoosijäägi 3C ja 4C OH rühmadega ning Trp85 moodustab H-sideme 

fruktoosijäägi 6C OH-grupiga. SacB +1 piirkonnas seotakse glükoosijääk Arg360 ja Glu340 3C 

ja 4C OH-gruppide kaudu (Joonis 3). SacB +2 alapiirkonnas moodustavad substraadiga kaudselt 

vesiniksidemeid Asn242 ja Ala116 ning Tyr237 ja Arg246 (Meng ja Fütterer, 2003; 2008). 

Joonisel 3 on näidatud B. subtilis’e levaansukraasi mutandi Glu342Ala seostumine sahharoosi 

(A) ja rafinoosiga (B). 

Joonis 3. B. subtilis’e levaansukraasi mutandi Glu342Ala aktiivtsenter kompleksis 

substraatidega: sahharoosiga (A) (PDB ID: 1PT2) ja rafinoosiga (B) (PDB ID: 3BYN). 

Aktiivtsentri aminohapped on tähistatud roosaga. Näidatud on substraadi seostumistasku -1, +1 ja 

+2 alapiirkonnad ning +1alapiirkonna kontaktid glükoosijäägiga. Kasutatud on joonist artiklist 

Lammens et al., 2009. 

11

B. subtilis’e SacB näitel on kirjeldatud ka levaansukraasi transfruktosüleerimisreaktsiooni etappe 

(vt. Joonis 4). Kõigepealt seotakse sahharoos H-sidemete abil ensüümi aktiivtsentri -1 ja +1 

alapiirkondadesse (Joonis 4A). Seejärel toimub glükosiidsideme hüdrolüüs, milles nukleofiil 

Asp86 atakeerib fruktoosijäägi anomeerset süsinikku. Tekib vaheühend, milles nukleofiil on 

kovalentselt seotud fruktoosijäägiga. Alus-hape katalüüsija Glu342 käitub happena, loovutades 

prootoni lahkuvale glükoosijäägile. Seejärel võtab Arg360 alternatiivse rotameerse asendi ja 

moodustab ioonse sideme Glu340-ga (Joonis 4B). Vabanevasse +1 alapiirkonda seostub 

aktseptormolekul ja lõpuks sünteesitakse glükosiidside ensüümiga seotud fruktosüüli ja 

aktseptormolekuli vahel (Joonis 4C). Viimase etapina toimub ühe fruktoosijäägi võrra pikenenud 

aktseptori vabanemine ning Arg360 võtab tagasi oma esialgse asendi (Joonis 4D) (Meng ja 

Fütterer, 2008). SacB Arg360 rolli täidab gramnegatiivsete bakterite levaansukraasides histidiini 

jääk (LsdA – His419, LevU – His296, Lsc3 – His321; vt. ka LISA 1) (Martinez-Fleites et al., 

2005; Yanase et al., 2002; Li et al., 2008). 

Joonis 4. Levaansukraasi polümerisatsioonimehhanismi skeem SacB näitel. Näidatud on 

reaktsiooni erinevad etapid: substraadi seondumine ensüümi aktiivtsentrisse (A), glükosiidsideme 

hüdrolüüs ja glükoosi vabanemine (B), aktseptorsubstraadi seondumine (C) ning ühe 

fruktoosijäägi võrra pikendatud aktseptori vabanemine (D). Joonisel on katkendliku joonega 

tähistatud H-sidemed ja paksus kirjas on tähistatud substraadi seondumispiirkonnad. Kasutatud 

on joonist artiklist Meng ja Fütterer (2008). 

12

G. diazotrophicus’e ja B. subtilis’e levaansukraasidele on transfruktosüleerimise reaktsiooni 

toimumiseks oluline positiivselt laetud ja elektrone hajutav keskkond, mida tekitavad 

aminohapped His419 ja Tyr484 (LsdA) ning Arg360 ja Tyr411 (SacB) (Joonised 2B ja 4). LsdA 

kristallstruktuuri kohaselt paikneb Tyr484 kõrvalahela aromaatne tuum paralleelselt valgu 

histidiini imidasoolrõngaga (Martinez-Fleites et al., 2005). Türosiin ise ei osale substraadi 

sidumises, vaid moodustab piiri aktiivtsentri -1 ja +1 alapiirkondade vahel (Ozimek et al., 2006). 

1.1.4 Levaansukraaside mutatsioonanalüüs 

Juba enne levaansukraaside kristallstruktuuride lahendamist alustati nende valkude 

mutatsioonanalüüsiga. On kasutatud nii juhuslikku kui ka koht-suunatud mutageneesi. Esmalt 

näitasid Chambert ja Petit-Glatron (1991), et B. subtilis’e levaansukraasi juhuslik mutant 

Arg360His ei suuda polümeriseerimisreaktsiooni läbi viia ja sünteesib peamise produktina 

kestoosi (GF 2 ). Juhusliku mutageneesi abil isoleeriti näiteks ka Z. mobilis’e LevU valgu alushape 

katalüüsija mutant (Glu278Asp). Nagu on näidatud Tabelis 1, kaasnes selle mutatsiooniga 

valgu katalüütlise efektiivsuse vähenemine sahharoosi suhtes ~30x, samas afiinsus sahharoosile 

oluliselt ei muutunud (Yanase et al., 2002). 

Juhuslike mutantide saamiseks saab kasutada keemilisi mutageene. Näiteks Z. mobilis’e 

levaansukraasi geene sisaldavaid Escherichia coli rakke on muteeritud N-metüül-N-nitro-Nnitrosoguanidiiniga 

(Alegre et al., 2005). B. subtilis’e ja P. syringae levaansukraaside 

muteerimiseks on kasutatud etüülmetaansulfonaati (EMS) (Lepasant et al.,1974; Mardo, 2009; 

Mardo et al., 2010). On kasutatud ka plasmiidse DNA in vitro muteerimist lämmastikushappega 

(Yanase et al., 2002) või hüdroksüülamiiniga (Sangiliyandi et al., 1999). Muteerimisele järgneb 

selektsioonietapp. Näiteks Z. mobilis’e levaansukraasi geeni muteerimisel töödeldi esmalt 

plasmiidset DNA-d lämmastikushappega, seejärel transformeeriti see E. coli rakkudesse ja jälgiti 

lima (levaani) teket sahharoosisöötmel kasvanud kolooniatel. Lima mittesünteesivatest ja 

vähelimastest transformantidest isoleeriti plasmiidne DNA ja mutatsiooni asukoht levaansukraasi 

geenis tuvastati sekveneerimisega (Yanase et al., 2002). 

Levaansukraaside koht-suunatud mutageneesiks on enamasti kasutatud erinevaid 

kommertsiaalseid süsteeme, näiteks QuikChange® (Stratagene, USA), milles mutatsioon viiakse 

sisse spetsiifilise muteeriva oligonukleotiidse praimeriga (Senthikumar et al., 2003; Meng ja 

13

Fütterer, 2008), kuid mõnes töös on kasutatud ka mittekommertsiaalset nn. 

„megapraimeri“ meetodit (Li et al., 2008; Tiirik, 2010). Suunatud mutageneesi on kasutatud 

näiteks B. subtilis’e, B. megaterium’i, Z. mobilis’e ja G. diazotrophicus’e levaansukraaside 

uurimisel (Batista et al., 1999; Yanase et al., 2002; Martinez-Fleites et al., 2005; Homann et al., 

2007; Ortiz-Soto et al., 2008). 

Koht-suunatud mutageneesi abil on tõestatud, et Asp135, Asp86 ja Asp95 on nukleofiilid 

vastavalt G. diazotrophicus’e, B. subtilis’e ja B. megaterium’i levaansukraasides – nende 

asendamine mõne muu aminohappega häirib tugevasti katalüüsi (vt. Tabel 1) (Martinez-Fleites et 

al., 2005; Meng ja Fütterer, 2003; Homann et al., 2007). 

Suunatud mutageneesiga on näidatud, et ka levaansukraasides konserveerunud RDP motiivi 

aspartaat on katalüüsis ülimalt oluline (Batista et al., 1999; Yanase et al., 2002; Meng ja Fütterer, 

2003). See aspartaat (näiteks Asp247 SacB valgus) kuulub aktiivtsentri katalüütilisse kolmikusse 

ja tema roll on vahekompleksi stabiliseerimine (vt. Joonis 4C). Sõltuvalt sellest, kas see Asp 

asendatakse asparagiiniga või alaniiniga, on mutantne valk väga madala katalüütilise aktiivsusega 

või täiesti inaktiivne (Tabel 1). 

Tabel 1. Levaansukraasidel aktiivtsentri katalüütiliste aminohapete kindlakstegemine 

mutatsioonanalüüsiga. Esitatud on kirjanduse andmed vastavate mutantsete levaansukraaside 

kohta: aminohappe asendused ja sellest tingitud muutused valgu kineetikas. Võrdlusena on 

näidatud metsiktüüpi (WT) levaansukraas. Ära on toodud on ka joonduste alusel leitud vastavate 

aminohapete positsioonid P. syringae pv. tomato Lsc3 valgus. 

Bakteriliik ja 

levaansukraas 

Gluconacetobacter 

diazotrophicus LsdA 

Bacillus subtilis 

SacB 

Zymomonas mobilis 

LevU 

Mutatsioon 

K m k cat /K m Katalüütilise Lsc3 vastav 

(mM) (1/M*min) kolmiku ah positsioon 

WT LsdA a 11.9 330x10 3 

Asp135Asn a 1.7 0.14x10 3 Nukleofiil Asp62 

Asp309Asn b 10.5 4.5x10 3 RDP motiiv Asp219 

WT SacB c 8.0 1218x10 3 

Asp86Ala d - - Nukleofiil Asp62 

Asp247Ala d - - RDP motiiv Asp219 

Glu342Ala d - - 

Alus-hape 

katalüüsija 

Glu303 

WT LevU e 125.0 13.6x10 3 

Asp194Asn e 364.0 0.002x10 3 RDP motiiv Glu219 

Glu278Asp e 166.0 0.36x10 3 Alus-hape 

Glu278His e 325.0 0.03x10 3 katalüüsija 

Glu303 

a Martinez-Fleitez et al., 2005; b Batista et al., 1999; c Ortiz-Soto et al., 2008; d Meng ja Fütterer, 

2003; e Yanase et al., 2002 

- vastav aktiivsus puudub 

14

Katalüütiliselt inaktiivseid mutante saab kasutada valkude kristalliseerimiseks koos substraadiga. 

Nii on näiteks B. subtilis’e Glu342Ala mutanti kristalliseeritud kompleksis nii sahharoosi kui ka 

rafinoosiga (Meng ja Fütterer, 2003; 2008). Kuna mutandis on Glu342 alus-hape katalüüsija 

muteeritud alaniiniks, ei saa ta lagundada glükosiidsidet substraadis, samas jääb substraat 

tugevalt seotuks ensüümi aktiivtsentrisse (Joonis 3). 

Suunatud mutageneesiga on tõestatud, et levaansukraaside polümeriseerimisvõimes on väga 

oluline kas üks konserveerunud histidiin (gramnegatiivsete bakterite valkudel) või arginiin 

(grampositiivsete bakterite valkudel). Nendeks on His296 (LevU), His419 (LsdA), Arg360 (SacB) 

ja Arg370 (B. megaterium’i levaansukraas) (LISA 1). Z. mobilis’e levaansukraasil mõjutas 

His296 muteerimine hüdrolüüsi- ja polümeriseerimisvõimet, aga ka substraadispetsiifikat 

(alandas ensüümi afiinsust sahharoosile ja suurendas ensüümi võimet reageerida rafinoosiga) 

(Yanase et al., 2002; Li et al., 2008). B. subtilis’e SacB valgu Arg360 muteerimisel alanes samuti 

valgu afiinsus sahharoosile ning polümeriseerimisvõime ja ensüüm sünteesis peamiselt FOS-e 

(Chambert ja Petit-Glatron, 1991; Ortiz-Soto et al., 2008). 

Grampositiivsete bakterite levaansukraaside stabiilsuse ja struktuuri tagamiseks on vaja Ca 2+ - 

ioone. Metalliiooni sidumise eest vastutavad kindlad aminohapped. B. subtilis’e levaansukraasis 

osaleb Ca 2+ sidumises konserveerunud D(E/Q)(T/I/V)E cat R motiivi Asp339. See motiiv sisaldab 

ka katalüütilise kolmiku alus-hape katalüüsijat Glu342. Arvatakse, et Ca 2+ kaudu hoitakse Glu342 

sisaldavat lingu sobivas asendis, et saaks toimuda katalüüs (Meng ja Fütterer, 2003). G. 

diazotrophicus’e LsdA valgus on disulfiidsild Cys339 ja Cys395 vahel, mis täidab samasugust 

struktuuri stabiliseerivat ülesannet. Muteerides LsdA tsüsteiini jäägid seriiniks, langes ensüümi 

katalüüsiefektiivsus ~70 korda (Martinez-Fleites et al., 2005). Samas ei ole vastavad Cys jääkide 

positsioonid gramnegatiivsete bakterite levaansukraasides konserveerunud (vt. LISA 1). 

15

2. EKSPERIMENTAALOSA 

2.1 Töö eesmärgid 

Antud magistritöö valmis Eesti Teadusfondi grantiprojekti GLOMR 7528 raames. Töös püstitati 

järgnevad eesmärgid: 

1. Alustada P. syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasi (Lsc3) katalüüsis oluliste 

aminohapete kindlakstegemisega; 

2. Koostada mutantsete lsc3 geenide raamatukogu plasmiidis pHIPMalprom-lsc3; 

3. Selekteerida raamatukogust plasmiidid selliste lsc3 geenidega, mis kodeerivad 

vähenenud polümerisatsioonivõimega levaansukraase; 

4. Ennustada Lsc3 valgu 3D struktuuri arvutipõhise modelleerimisega; 

5. Teha kindlaks mutatsioonide olemasolu ja asukohad raamatukogust väljasõelutud lsc3 

geenide sekveneerimisega ja ennustada muteerunud aminohapete asukoht valgus; 

6. Mitmikmutantide puhul valida välja mõned olulisemad mutatsioonid, viia need 

ühekaupa koht-suunatult lsc3 geeni ning kloneerida pURI3 ekspressioonivektorisse; 

7. Ekspresseerida mutantseid levaansukraase E. coli’s ja iseloomustada rakuekstrakti 

analüüsides ensüümide omadusi; 

8. Puhastada algsest Lsc3 valgust kõige enam erinevad mutantsed ensüümid Ni 2+ - 

afiinsuskromatograafiaga; 

9. Iseloomustada mutantsete valkude kineetilisi parameetreid, substraadispetsiifikat, 

transfruktosüleerivat aktiivsust, temperatuuritaluvust ja sünteesitud levaani kogust; 

10. Teha eksperimentide tulemuste alusel järeldusi katalüüsis oluliste aminohapete kohta 

Lsc3 valgus. 

16

2.2 Materjal ja metoodika 

2.2.1 Kasutatud bakteritüved ja plasmiidid 

Levaansukraasi geeni keemiliseks muteerimiseks kasutati plasmiidi pHIPMalprom-lsc3 (8256 ap; 

LISA 3A) (Visnapuu et al., 2008), mis oli viidud transformatsiooniga E. coli tüvesse DH5α 

(supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) recA1 endA1 hsdR17 thi-1 gyrA96 relA1) (Invitrogen, CA, 

USA; Miller, 1972). DH5α tüve kasutati kõigi kloneerimisetappide läbiviimisel ja ka plasmiidse 

DNA puhastamisel. Mutantsete ja metsiktüüpi levaansukraaside ekspressiooniks kasutati E. coli 

tüve BL21(DE3) [hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV5-T7 gene 1)] (Studier ja Moffatt, 

1986), mille genoomis on IPTG-ga (isopropüül β-D-1-tiogalaktopüranosiid) indutseeritav T7 

polümeraasi promootor. 

Mutantsete lsc3 geenide ekspresseerimiseks kasutati plasmiidi pURI3 (2737 ap), milles 

ekspresseeritava valgu N-terminusse liitub 6 histidiini jääki (de las Rivas et al., 2007). 

Metsiktüüpi lsc3 geeni sisaldava plasmiidi pURI3-lsc3 (3820 ap; LISA 3B) konstrueeris T. 

Visnapuu. Plasmiidis on lsc3 geeni ees bakteriofaagi T7 promootor, millelt alustab 

transkriptsiooni ekspressioonitüve T7 polümeraas. 

Töös kasutatud ja konstrueeritud plasmiidid on esitatud Tabelis 2. 

Tabel 2. Töös kasutatud plasmiidid. 

Plasmiid Plasmiidi kirjeldus Viide 

pHIPMalprom Ekspressioonivektor Visnapuu et al., 2008 

pHIPMalprom-lsc3 pHIPMalprom, mis sisaldab lsc3 geeni 

Visnapuu et al., 2008 

LISA 3A 

pHIPMalprom-lsc3MutA 

Muteeritud lsc3 geeniga plasmiid, kus Lsc3 

valgus on vastavad asendused: Ser123Pro; Käesolev töö 

Val329Ala; Leu406Pro 

pHIPMalprom-lsc3MutB 


valgus on toimunud asendus Gln269Arg 

Käesolev töö 

pHIPMalprom-lsc3MutD 


valgus on vastavad asendused: 


Pro222Leu; Phe344Leu; Ser411Leu 

pHIPMalprom-lsc3MutE 

Muteerutud lsc3 geeniga plasmiid, kus 

Lsc3 valgus on asendused His113Gln ja Käesolev töö 

Val195Ile 

pHIPMalprom-lsc3MutF 


valgus on vastavad asendused: Ala49Thr; 

Glu68Gly; Arg89His; Lys196Arg; 

Leu281Pro; Val329Ala 


17

Tabel 2. Töös kasutatud plasmiidid (järg). 

Plasmiid Plasmiidi kirjeldus Viide 

pHIPMalprom-lsc3MutG 


valgus on vastavad asendused: Asp31Asn; Käesolev töö 

Glu252Gly; Asp300Asn; Cys371Trp 

pHIPMalprom-lsc3MutH 


valgus on vastavad asendused: Val53Asp; Käesolev töö 

Gln95Arg; Glu209Val; Thr302Pro 

pHIPMalprom-lsc3T41I 

Muteeritud lsc3 geeniga plasmiid, kus Lsc3 Mardo, 2009; Mardo 

valgus on toimunud asendus Thr41Ile et al., 2010 

pURI3* 

Ekspressioonivektor 

de las Rivas et al., 

2007 

pURI3-lsc3 

pURI3 vektor, mis sisaldab lsc3 geeni 

T. Visnapuu, 

avaldamata andmed 

LISA 3B 

pURI3-lsc3D31N 


valgus on asendus Asp31Asn 


pURI3-lsc3T41I 


valgus on asendus Thr41Ile 


pURI3-lsc3H113Q 


valgus on asendus His113Gln 


pURI3-lsc3Q269R 


valgus on asendus Gln269Arg 


pURI3-lsc3L281P 


valgus on asendus Leu281Pro 


pURI3-lsc3D300N 


valgus on asendus Asp300Asn 


pURI3-lsc3T302M 


valgus on asendus Thr302Met 


pURI3-lsc3T302P 


valgus on asendus Thr302Pro 


pURI3-lsc3V329A 


valgus on asendus Val329Ala 


pURI3-lsc3C371W 


valgus on asendus Cys371Trp 


* kõigis pURI3 vektorisse tehtud konstruktides liitub ekspresseeritava Lsc3 valgu N-terminusse 

His 6 -järjestus. 

2.2.2 Söötmed ja bakterirakkude kasvatamine 

Algse või muteeritud lsc3 geeniga pHIPMalprom-lsc3 plasmiide sisaldavaid DH5α transformante 

kasvatati kanamütsiini (Km; lõppkontsentatsioon 0.1 mg/ml) sisaldavas Luria-Bertani (LB) tard- 

18

või vedelsöötmes. Ampitsilliiniga (Amp; lõppkontsentratsioon 0.15 mg/ml) LB söötmes kasvatati 

plasmiidiga pURI3-lsc3 või selle mutantsete variantidega transformeeritud DH5α või BL21(DE3) 

tüvesid. Vedelkultuure aereeriti loksutil temperatuuril 37°C ja tardsöötmetele külvatud E. coli 

rakke kasvatati üleöö termostaadis temperatuuril 37°C. 

Mutantide selektsiooniks ja kolooniate fenotüübi uurimiseks kasutati 10% sahharoosiga LB 

tardsöödet, millele lisati 1 mM IPTG-d ja kanamütsiini või ampitsilliini. Kõigepealt kasvatati 

kolooniaid ~20 h temperatuuril 37°C ja järgnevalt kuni nädal aega toatemperatuuril (~23°C), et 

vaadelda lima (levaani) moodustumist. 

Metsiktüüpi või muteeritud levaansukraaside üleekspressiooniks kasutati E. coli BL21(DE3) 

transformante, mis kasvatati 5 ml LB Amp söötmes ~20 h, külvati algtihedusega OD 600 0.05 30 

ml või 200 ml LB Amp vedelsöötmesse ning kasvatati temperatuuril 37°C loksutil kuni OD 600 

väärtuseni ~0.5. Seejärel indutseeriti Lsc3 süntees 0.5 mM IPTG lisamisega ning rakke kasvatati 

täiendavalt 20 h temperatuuril 22°C. 

2.2.3 Levaansukraasi geeni mutantide raamatukogu koostamine ja muteeritud 

rakkude elumuse määramine 

Raamatukogu koostamiseks muteeriti lsc3 geeni sisaldava pHIPMalprom-lsc3 plasmiidiga 

transformeeritud E. coli DH5α rakke etüülmetaansulfonaadiga (EMS) modifitseeritud Kamal et 

al. (2003) meetodil. Selleks kasvatati plasmiidi sisaldavad rakud üleöö tiheduseni OD 600 ~2.5-3, 

neid pesti steriilse K-fosfaat puhvriga (100 mM, pH 7.0) ning inkubeeriti temperatuuril 37°C 1% 

EMS sisaldavas puhvris. Reaktsioon peatati erinevatel ajapunktidel (60, 90 ja 120 min) Natiosulfaadi 

(lõppkontsentratsioon 7%) lisamisega. Rakke pesti kaks korda fosfaatpuhvriga ja neil 

määrati elumus (Mardo, 2009; Mardo et al., 2010). Muteeritud rakkude suspensioon jagati 

osadeks ning kasvatati üleöö 5 ml LB Km vedelsöötmes. Seejärel suspendeeriti rakud steriilses 

15% glütseroolilahuses ja säilitati temperatuuril -80°C. 

Elumuse määramiseks tehti erinevat aega mutageeniga töödeldud transformantide 

suspensioonidest lahjendused (10 -2 -10 -4 ), 100 μl lahjendust plaaditi LB Km tardsöötmetele ja 

kasvatati üleöö temperatuuril 37°C. Elumuse arvutamiseks loendati kolooniad ning arvutati 

muteerimisjärgselt ellu jäänud rakkude protsent. Elumus sõltus mutageeniga töötlemise ajast ja 

oli vastavalt 10% (60 min), 2% (90 min) ja 0.4% (120 min). 

19

2.2.4 Mutantide selektsioon 

Keemiliselt muteeritud ning glütseroolis säilitatud E. coli transformantidest tehti sobivad 

lahjendused steriilsesse 0.9% NaCl lahusesse ja külvati välja LB Km tassidele. Rakke kasvatati 

temperatuuril 37°C, moodustunud kolooniad pesti söötmelt maha steriilse destilleeritud veega 

ning rakususpensioonist isoleeriti totaalne plasmiidne DNA. Seda plasmiidset DNA-d kasutati 

matriitsina PCR-il (Polymerase Chain Reaction), et amplifitseerida võimalikke muteerunud lsc3 

geeni variante. Selleks kasutati päri- ja vastupraimereid MAL30 (5’- 

TATAAAGACCTTCCGCCTC-3’) ja AMORevSalI (5’-TTTCGCAGGTCGACGAGCTCG-3’) 

ning Taq polümeraasi (puhastatud prof. Sedmani laboris, Tartu Ülikool). Amplifitseeritud DNA 

lõik (1735 ap) sisaldab lsc3 geeni, sellest 5’ suunas asuvast väikest osa Hansenula polymorpha 

maltaasi geeni promootorist ning 3’ suunas ~350 ap mittekodeerivat ala. Saadud PCR produkti 

„lõigati“ restriktaasidega BamHI ja SalI (Fermentas, Leedu), väljalõikuv 1474 ap pikkune lõik 

puhastati 1% agaroosgeelist ning kloneeriti samade restriktaasidega avatud vektorisse 

pHIPMalprom (Visnapuu et al., 2008). Sellisel moel kõrvaldasime võimaluse, et selekteeritava 

fenotüübi võiksid põhjustada mutatsioonid mutageeniga töödeldud E. coli genoomses DNA-s, 

plasmiidi selgroos või maltaasi geeni promootoralas. 

Saadud ligaasisegud transformeeriti E. coli’sse, rakud plaaditi 10% sahharoosiga LB Km 

tardsöötmele ja vaadeldi kolooniatel lima teket. E. coli ei metaboliseeri sahharoosi ning ainult 

polümeriseerimisvõimelist levaansukraasi ekspresseerivad E. coli kolooniad muutuvad 

sahharoosiga söötmel limaseks (Visnapuu et al., 2008). Isoleeriti lima mittemoodustavad ja 

vähelimased kolooniad, neis kontrolliti PCR-iga lcs3 geeni olemasolu ja lsc3-positiivsetest 

kolooniatest isoleeriti plasmiidne DNA. Mutatsioonide kindlakstegemiseks lsc3 geen sekveneeriti 

(vt. pt. 2.2.6) ja raamatukogust isoleeritud mutantseid levaansukraase kodeerivad plasmiidid 

nimetati pHIPMalprom-lsc3mutA, pHIPMalprom-lsc3mutB, pHIPMalprom-lsc3mutD, 

pHIPMalprom-lsc3mutE, pHIPMalprom-lsc3mutF, pHIPMalprom-lsc3mutG ja pHIPMalpromlsc3mutH 

(vt. Tabelid 2 ja 4). 

2.2.5 DNA eraldamine, PCR, restriktsioon, ligeerimine ja transformatsioon 

Plasmiidse DNA eraldamiseks kasutati AxyPrep Plasmid Miniprep komplekti (Axygen 

Biosciences, USA) ja vastavat tootjapoolset protokolli. DNA lõikude puhastamiseks nii lahusest 

20

kui ka agaroosgeelist kasutati UltraClean®15 DNA puhastamise komplekti (Mo Bio, USA) ja 

tootja protokolli. 

Levaansukraasi geeni olemasolu pHIPMalprom-lsc3 transformantide kolooniates ja eraldatud 

plasmiidses DNA-s kontrolliti PCR-iga, kasutades praimereid MAL30 ja Lsc1ja3Rev1 (5’- 

GCGCTTCGGTTTGATAATAGG-3’), ning pURI3-lsc3 ja selle mutantseid variante sisaldavates 

kolooniates ning plasmiidses DNA-s kasutades praimereid T7 (vt. Tabel 3) ja Lsc1ja3Rev1. 

Produktide oodatavad pikkused olid vastavalt 718 ja 760 ap. PCR-i segu (20 μl) sisaldas 6.25 

mM MgCl 2 , 1x PCR-i puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP (võrdses koguses dATP, dGTP, dCTP, 

dTTP; Fermentas), kumbagi praimerit 0.5 pmol/μl ja Taq polümeraasi 0.05 U/μl. Levaansukraasi 

suunatud muteerimiseks ja geeni pURI3 vektorisse viimiseks kasutati Pfu DNA polümeraasi. 

Reaktsioonisegu (25 μl) sisaldas 4 mM MgSO 4 , 1x Pfu puhvrit, 0.2 mM dNTP, 0.5 pmol/μl 

kumbagi praimerit ja 0.025 U/μl Pfu polümeraasi. Kõik komponendid olid firmast Fermentas. 

Praimerid telliti firmast Microsynth (http://www.microsynth.ch; Šveits). 

PCR-il, restriktsioonil ja DNA puhastamisel saadud DNA lõikude olemasolu ja pikkust kontrolliti 

etiidiumbromiidiga (0.35 μg/ml) 1% agaroosgeelil, mis oli valmistatud 0.5x TAE puhvris (40 mM 

Tris-atsetaat, 1 mM EDTA; pH 8.2). Produktide suuruse määramiseks kasutati GeneRuler 1 kb 

DNA markerit (Fermentas). Geelile kantavatele segudele lisati glütserooli sisaldavat geelivärvi 

(1x Orange DNA Loading Dye, Fermentas) ning geelelektroforees toimus 0.5x TAE puhvris 

pingel 10 V/cm. DNA visualiseeriti ultraviolettvalguses UV Transilluminator-iga (UVP, USA). 

DNA restrikteerimiseks kasutati firma Fermentas restriktaase BamHI, SalI, DpnI, NotI ja 

tootjapoolset protokolli. Fragmentide ligeerimiseks kasutati T4 DNA ligaasi (0.025 U/μl) vastvalt 

tootjapoolsetele soovitustele. 

pHIPMalprom-lsc3 ning selle mutantsed variandid viidi transformatsiooniga DH5α tüvesse 

kasutades Inoue et al. (1990) meetodit. E. coli tüve DH5α rakke kasvatati Super Optimal Broth 

(SOB) vedelsöötmes temperatuuril 18°C, tiheduseni OD 600 0.6 ning muudeti 

transformatsioonikompetentseteks, töödeldes rakke TB puhvri (10 mM Hepes, 15 mM CaCl 2 , 

250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 : pH 6.7) ja dimetüülsulfoksiidiga (lõppkonts. 7%) ning säilitati 

temperatuuril -80°C. 

pURI3-lsc3 plasmiidi transformeerimiseks E. coli DH5α või BL21(DE3) tüvesse kasutati 

elektroporatsiooni (Sharma ja Schimke, 1996). Bakterirakke kasvatati LB vedelsöötmes kuni 

21

OD 600 ~0.4, pesti kolm korda 15% steriilse glütserooliga, suspendeeriti 50 µl samas lahuses, lisati 

plasmiidne DNA (~10 ng) ning elektroporeeriti BIO-RAD E. coli Pulser-iga (USA) pingel 2.5 kV. 

2.2.6 DNA sekveneerimine 

Nii juhuslikult kui ka koht-suunatult muteeritud lsc3 geenid sekveneeriti, et teha kindlaks 

juhuslikke mutatsioone ja kinnitada mutatsioonide asukohti. Selleks kasutati BigDye® 

Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit-i (Applied Biosystems, Kanada). Plasmiidis 

pHIPMalprom-lsc3 sisalduvate geenide puhul sekveneeriti PCR-i produktide, mis saadi kasutades 

praimereid MAL30 ja Lsc1ja3Rev1 (amplifitseerub 718 ap lõik lsc3 geeni N-terminaalsest osast) 

ning Lsc1ja3Fw1 (5’-GCGATCGCCAAAGTACG-3’) ja AMORevSalI (amplifitseerub 1136 ap 

lõik lsc3 C-terminaalsest osast; vt. LISA 3A). lsc3 geenide puhul plasmiidis pURI3-lsc3 kasutati 

lsc3 geeni sekveneerimiseks vastavalt praimeripaare T7 ja Lsc1ja3Rev1 (amplifitseerub 760 ap 

pikkune lõik) ning Lsc1ja3Fw1 ja Ampsaba (vt. Tabel 3) (amplifitseerub 938 ap pikkune lõik). 

Sekveneerimispraimerite seondumiskohad on alla joonitud LISA-s 3. 

PCR-i produkte töödeldi aluselise fosfataasiga (SAP; Shrimp Acid Phosphatase – 0.14 U/μl) ja 

eksonukleaasiga ExoI (0.36 U/μl) (mõlemad firmalt Fermentas). Seejärel valmistati proovid 

sekveneerimiseks vastavalt tootjapoolsetele soovitustele ja DNA sadestati etanooliga. 

Sekveneeriti ABI 3130xl Cenetic Analyzer või ABI 3730xl DNA Analyzer sekvenaatoriga 

(Applied Biosystems, Kanada). Saadud järjestusi võrreldi metsiktüüpi lsc3 geeni järjestusega, 

kasutades BioEdit (Hall, 1999) programmi. 

2.2.7 Levaansukraasi geeni koht-suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 

vektorisse 

Kuna lsc3 geeni juhuslikul keemilisel muteerimisel saadi mitmikmutante (pt. 2.2.4; Tabel 4), siis 

iga konkreetse mutatsiooni mõju hindamiseks viidi mõned väljavalitud mutatsioonid ühekaupa 

koht-spetsiifiliselt lsc3 geeni. Selleks kasutati PCR-i põhist megapraimeri meetodit (Wei et al., 

2004; Tiirik, 2010). Mutatsiooni sisaldav megapraimer sünteesiti Pfu polümeraasiga (Fermentas), 

mida kasutati kõigis muteerimise etappides. 

PCR-il kasutatud päri- ja vastupraimerite järjestused on ära toodud Tabelis 3 ja LISA-s 3 (B). 

Sõltuvalt sellest, kas mutatsioon asus geeni alguse- või lõpuosas, oli päripraimeriks vastavalt kas 

22

T7 või vastava mutatsiooniga Fw praimer ja vastupraimeriks kas vastava mutatsiooniga Rev või 

Ampsaba praimer. 

Tabel 3. lsc3 geeni suunatud mutageneesil kasutatud praimerid. Näidatud on praimeri tähistused, 

järjestused ja seondumise positsioonid lsc3 geeni ATG koodoni suhtes. Tumeda kirjaga on 

tähistatud vahetatavad nukleotiidid ja alla on joonitud muutunud aminohappe koodon. Lisaks on 

ära toodud suunatud mutageneesi esimese etapina sünteesitud megapraimeri pikkused. 

Praimeri 

nimetus 

Praimeri järjestus 

Praimeri 

seondumispositsioonid 

lsc3 geeni ATG 

koodoni suhtes 

Megapraimeri 

pikkus (ap) 

T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ -108 → -88 

D31NRev 5’-ACCTTCAGCGCATTGGCG-3’ 69 → 87 232 

H113QRev 5’-GCGTGCGCGGCCTTGTCG-3’ 316 → 334 479 

Ampsaba 5’-CTGAGATAGGTGCCTCAC-3’ 1434 → 1416 

L281PFw 5’-GGCGGTTGCAAAAGATCCCAGTGG-3’ 848 → 872 627 

D300NFw 5’-TGAATAATCAGACCGAGCGCC-3’ 913 → 934 560 

T302MFw 5’AATGATCAGATGGAGCGCCC 3’ 914 → 934 557 

T302PFw 5’-AATGATCAGCCCGAGCGCCCG-3’ 915 → 936 557 

V329AFw 5’-TATGCCGATGGTGCTACAGGG-3’ 993 → 1014 479 

C371WFw 5’-TTCGCACTGGGTCATGCC-3’ 1121 → 1139 348 

Sünteesitud megapraimer puhastati 1% agaroosgeelist ning seda pikendati vastavalt Wei et al. 

(2004) poolt väljatöötatud metoodikale. Kõigepealt tehti PCR-i reaktsioon ühe pika praimeriga 

(megapraimer, Tabel 3) ja 2.5 U (lõppkonts. 0.05 U/µl) Pfu DNA polümeraasiga, kus matriitsiks 

kasutati plasmiidi pURI3-lsc3 (sisaldab metsiktüüpi lsc3 geeni, vt. Tabel 2). Segu töödeldi 

restriktaasiga DpnI, mis „lõikab“ ainult metüleeritud DNA-d. Nii vabanetakse reaktsioonisegusse 

alles jäänud matriitsina kasutatud DNA-st. Pikendatud produkti kasutati matriitsina uues PCR-i 

reaktsioonis praimeritega T7 ja Ampsaba, et paljundada mutatsiooni sisaldavat 1579 aluspaari 

pikkust levaansukraasi lõiku (Tiirik, 2010). Sellelt DNA-lt tehti omakorda PCR praimeritega 

Lsc3pURI3Fw (5’- 

CATCATGGTGACGATGACGATAAGATGTACAATAGCAACTCTGCTGTAA- 3’) ja 

Lsc3pURI3Rev (5’- 

AAGCTTAGTTAGCTATTATGCGTAGTTCTTCAGGTATGGGAACGGCGTG -3’). Kaldkirjas on 

näidatud praimeri nukleotiidid, mis paarduvad pURI3 vektoriga ning tumedamalt on tähistatud 

levaansukraasi geeni stardikoodon. Õige pikkusega produkt (1369 ap) lõigati välja 

23

agaroosgeelist, puhastati ning viidi pURI3 vektorsisse, mis liidab valgu N-terminaalsesse otsa 6 

His jääki (Geiser et al., 2001; de las Rivas et al., 2007). 

lsc3 geeni viimiseks pURI3 plasmiidi amplifitseeriti geen praimeritega Lsc3pURI3Fw ja 

Lsc3pURI3Rev. Kasutati kas pHIPMalprom-lsc3 vektorilt lsc3 geeni või suunatud mutageneesi 

käigus sünteesitud produkti. Saadud DNA fragment puhastati ja viidi läbi ekstensiooni PCR Pfu 

polümeraasi (lõppkonts. 0.05 U/µl) ning pURI3 plasmiidiga. Kõigepealt DNA denatureeriti 95°C, 

siis toimus fragmendi komplementaarsete otste seondumine plasmiidile (55°C) ning seejärel 

DNA süntees (72°C). Tsüklit korrati 18 korda. Saadud segu töödeldi restriktaaside DpnI ja NotIga 

(Fermentas) (de las Rivas et al., 2007). Need restriktaasid „lõikavad“ segusse allesjäänud 

pURI3 vektorit: DpnI restrikteerib metüleeritud DNA-d ja NotI „lõikab“ ilma inserdita vektorit. 

Restriktsioonisegu sadestati etanooliga ja poreeriti E. coli DH5α rakkudesse (vt. 2.2.5). 

Levaansukraasi geeni olemasolu kontrolliti PCR-il spetsiifiliste praimeritega. Mutatsioonide 

olemasolu ja asukoha õigsus kinnitati sekveneerimisega (pt. 2.2.6). Saadud mutantsed plasmiidid 

puhastati (Tabel 2). 

2.2.8 Rakuekstraktide tegemine 

Rakuekstraktide tegemiseks kasvatati ja indutseeriti muteeritud või metsiktüüpi levaansukraasi 

ekspresseerivaid E. coli tüve BL21(DE3) transformante, nagu on näidatud peatükis 2.2.2. 

Ensüümiaktiivsuse mõõtmise jaoks rakuekstraktis kasvatati E. coli BL21(DE3) transformante 30 

ml LB Amp söötmes. Levaansukraasi ekspressioon indutseeriti 0.5 mM IPTG lisamisega, 

millejärgselt kasvatati rakke loksutil madalal temperatuuril (22°C) ~20 h. Rakke pesti 2x 50 mM 

K-fosfaatpuhvriga (pH 7.0) ning suspendeeriti 1 ml McIlvaine-i puhvris (0.04 M sidrunhape; 

0.13M Na 2 HPO 4 ; pH 6.0) (McIlvaine, 1921). Rakud purustati ultraheliga töödeldes (Ultrasonic 

Homogenizer 4710, Cole-Parmer Instrument Co., USA), saadud suspensiooni tsentrifuugiti 20 

min 13400 g (4ºC) ning supernatanti kasutati rakuekstraktina. 

Valkude puhastamiseks kasvatati E. coli BL21(DE3) levaansukraasi geene ekspresseerivaid 

transformante 200 ml LB Amp vedelsöötmes. Teised rakkude kasvatuse ja levaansukraasi 

sünteesi indutseerimise etapid olid samasugused nagu eespool kirjeldatud (vt. 2.2.2). 

Bakterikultuuri tsentrifuugiti 10 min 3600 g (4°C), pesti kaks korda 25 ml K-fosfaatpuhvriga (50 

mM; pH 7.0) ning rakud suspendeeriti 10 ml sonikeerimispuhvris (10 mM imidasool, 10% 

glütserool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl; pH 6.0). Seejärel rakud külmutati 3x vedelas 

24

lämmastikus, sulatati veevannil ja purustati sonikeerimisega. Sonikeeritud rakkude 

tsentrifuugimisel (20 min, 2400 g, 4°C) saadud supernatandist puhastati levaansukraasi valk. 

2.2.9 Valkude puhastamine 

Rakuekstraktis mõõdeti levaansukraasi koguaktiivsus 100 mM sahharoosiga ja määrati üldvalgu 

kontsentratsioon Lowry meetodil (pt. 2.2.11). Valkude puhastamisel lähtuti E. Kallase kasutatud 

metoodikast, mida kohandati Lsc3 valgule (Kallas, 2010). 10 ml rakulüsaadile lisati 400 μl Ni 2+ - 

NTA agaroosi (Hispanagar, Hispaania), inkubeeriti 2 h 4°C end-over-end segajal (Bio RS-24, 

BIOSAN, Läti). Toimus His 6 -järjestusega Lsc3 valgu seondumine Ni 2+ -NTA agaroosiga. Seejärel 

tsentrifuugiti segu 1 min 380 g (4°C), et eraldada supernatant. Ni 2+ maatriksit pesti seejärel 3x 5 

ml sonikeerimispuhvriga (vt. pt. 2.2.8) ja suspendeeriti 2 ml samas puhvris. Segu jagati kolmele 

membraanita RNA eraldamise minikolonnile ning tsentrifuugiti 1 min 380 g (4°C). Kolonnid 

tõsteti uude eppendorfi tuubi, lisati elueerimispuhvrit (500 mM imidasool, 20% glütserool, 50 

mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl; pH 6.0), inkubeeriti 3 min toatemperatuuril ning tsentrifuugiti 

seejärel 1 min (380 g, 4°C). Valku elueeriti kolonnidelt 3 korda, vastavalt 500, 200 ja 200 μl 

elueerimispuhvriga. Kõigist pesu- ja elueerimisetappidest võeti proovid (10 μl) SDS-PAGE jaoks, 

et kontrollida levaansukraasi olemasolu ja kogust (pt. 2.2.10). 

Levaansukraasi sisaldavad eluaadid koguti ja dialüüsiti temperatuuril 4°C McIlvaine-i puhvris 

(pH 6.0 + 0.02% Na-asiidi), kasutades firma Spectra/Por3 (Spectrum Laboratories, USA) 

dialüüsimembraane (Mw cutoff: 3500 Da). Dialüüsipuhvrit vahetati kolm korda ja dialüüsi kestus 

oli ~24 h. 

Dialüüsitud valgulahuse kontsentreerimiseks kasutati PEG8000 (polüetüleenglükool, M w 8000 

Da, SIGMA, USA). Valku sisaldav dialüüsimembraan asetati PEG8000 kristallidele ning hoiti 

temperatuuril 4°C, kuni lahuse maht oli vähenenud umbes kaks korda (Rotblat et al., 1985). 

Saadud kontsentreeritud valgulahust kasutati levaansukraasi puhta preparaadina. 

2.2.10 Valkude denatureeriv ja natiivne polüakrüülamiidgeelelektroforees 

Rakulüsaatides sisalduva Lsc3 hulga ja valkude puhastamise etappide jälgimiseks kasutati SDSpolüakrüülamiidgeelelektroforeesi 

(SDS-PAGE). 10% tritsiin-SDS-geeli valmistamisel lähtuti 

Schäggeri (2006) protokollist. Rakuekstraktide puhul kanti geelile 10 μg valku ja puhastatud 

25

valkude puhul 1 μg valku. Valkude puhastamise etappidest kanti SDS-geelile 1 või 5 μl valku 

sisaldavat lahust. Denatureeritud valgud lahutati elektriväljas Mini-PROTEAN® Tetra Cell 

süsteemiga (BIO-RAD, USA) pingel 14 V/cm. Geel värviti Coomassie Brilliant Blue G250-ga 

ning levaansukraaside asukohta geelil hinnati valkude suurusmarkeri PageRuler TM SM0671 

(Fermentas) alusel. 

Valkude aktiivsuse kontrollimiseks lahutati puhastatud valgud natiivses 7.5% 

polüakrüülamiidgeelis (PAGE) standardprotokolli järgi (Sambrook et al., 1989). Geelile kanti 1.5 μg 

valgupreparaate, koos 10 μl 1x DNA Orange Loading Dye-ga (Fermentas), lõppmahus 20 μl. 

Proovid lahutati elektriväljas Hoefer-i süsteemiga pingel 9 V/cm, temperatuuril 4°C. 

Voolutuspuhvrina kasutati TBE puhvrit (45 mM TrisHCl, 45 mM boorhape, 0.9 mM EDTA; pH 8.0). 

Elektroforeesil kasutati kahte geeli, millest üks värviti valkude tuvastamiseks Coomassie Brilliant 

Blue G250-ga ja teist kasutati levaansukraasse aktiivsuse tuvastamiseks geelis. Selleks hoiti geeli 

pärast elektroforeesi 10% sahharoosi sisaldavas McIlvaine-i puhvris (pH 6.0). 

2.2.11 Levaansukraasi aktiivsuste määramine 

Koguaktiivsuse määramine glükoosi eraldumise järgi sahharoosist 

Levaansukraasi koguaktiivsuse määramiseks mõõdeti sahharoosi lagundamisel vabanenud 

glükoosi hulka. Selleks kasutati GLUCOSE Liquicolor-i reaktiivi (Human GmbH, Saksamaa) ja 

eelnevalt väljatöötatud metoodikat (Visnapuu et al., 2008). Reaktsioon viidi läbi temperatuuril 

37°C erinevate sahharoosi kontsentratsioonidega McIlvaine-i puhvris (pH 6.0). Eralduv glükoosi 

hulk määrati vastavalt tootjafirma protokollile. Levaansukraasi koguaktiivsus väljendati 

sahharoosist vabanenud glükoosi kogusena mikromoolides minutis ühe mg valgu kohta 

(μmol/min*mg ehk U/mg). Mutantsete ja metsiktüüpi levaansukraaside kineetiliste parameetrite 

– afiinsuse (K m ), maksimaalse reaktsioonikiiruse (V max ) ja inhibitsioonikonstandi (K i ) leidmiseks 

varieeriti sahharoosi kontsentratsioone. Metsiktüüpi valgu puhul kasutati reaktsioonisegudes 15- 

200 mM ja mutantidel 15-600 mM sahharoosi. Et arvutada K i väärtused rafinoosile, lisati 

reaktsioonisegusse sahharoosile lisaks 100 mM rafinoosi. Tulemusi analüüsiti vastavalt 

Michaelis-Menteni võrrandile, kasutades programmi SigmaPlot 2001 (SYSTAT, USA) 

ensüümikineetika moodulit (Enzyme Kinetics Module 1.1). Katalüütilise konstandi k cat (1/min) 

arvutamisel võeti arvesse vastava valgu V max väärtus ja ensüümi arvutuslik molekulmass (49.8 

kDa). Katalüüsi efektiivsus k cat /K m (1/M*min) saadi vastavate väärtuste jagatisena. 

26

Levaansukraasi koguaktiivsuse mõõtmist kasutati ka mutantsete levaansukraaside 

temperatuuristabiilsuse hindamiseks. Selleks inkubeeriti valke McIlvaine-i puhvris 30 min 

jooksul erinevatel temperatuuridel (20°C, 37°C, 45°C, 50°C, 60°C ja 70°C), jahutati jääl ning 

seejärel mõõdeti ensüümi jääkaktiivsus 100 mM sahharoosiga temperatuuril 37°C. Tulemuste 

väljendamisel võrdsustati 100%-ga kõige madalamal temperatuuril (20°C) inkubeeritud valkude 

jääkaktiivsused. 

Levaansukraasi aktiivsuse määramine redutseerivate suhkrute tekke järgi 

Et hinnata erinevate substraatide (sahharoos ja levaan) kasutamist Lsc3 valgul ja tema mutantidel, 

mõõdeti nende substraatide hüdrolüüsil vabanevate redutseerivate suhkrute teket 3,5- 

dinitrosalitsüülhappe (DNSA) reaktiiviga (Miller, 1959). Sahharoosi kontsentratsioon 

reaktsioonisegus oli 400 mM, levaani lisati 0.01g 1 ml reaktsioonisegu kohta. Ensüümiaktiivsus 

väljendati sahharoosist või levaanist 1 min jooksul moodustunud redutseerivate suhkrute 

kogusena mikromoolides 1 mg valgu kohta (μmol/min*mg ehk U/mg). Saadud väärtusi võrreldi 

ja väljendati protsendina 400 mM sahharoosiga määratud aktiivsuse suhtes. 

Transfruktosüleeriva aktiivsuse määramine 

Transfruktosüleeriva aktiivsuse (TA) ehk polümeriseeriva aktiivsuse määramiseks inkubeeriti 

levaansukraase sisaldavaid rakuekstrakte või puhastatud valke 1200 mM sahharoosiga 

McIlvaine-i puhvris 37°C 20 h. Puhastatud valku või rakulüsaati lisati reaktsioonisegusse 

arvestusega 2.7 koguaktiivsuse ühikut (U) 1 ml kohta. Proove kuumutati temperatuuril 96°C 5 

min ja määrati reaktsioonisegusse moodustunud glükoosi ja fruktoosi sisaldus, kasutades 

ensümaatilist meetodit (van Hijum et al., 2001; Yanase et al., 2002; Toomemaa, 2007). Glükoosi 

ja fruktoosi koguste vahe näitab kui suur osa levaansukraasiga reageerinud sahharoosist 

pärinevast fruktoosist polümeriseeriti. Polümeriseeriv aktiivsus arvutati valemiga ([Glc]- 

[Fru v ])/[Glc])*100, kus [Glc] näitab glükoosi ja [Fru v ] vaba ehk mittepolümeriseeritud fruktoosi 

sisaldust reaktsioonisegus. TA väljendati protsendina ja see näitab, kui suur osa reageerinud 

sahharoosis sisalduvast fruktoosist polümeriseeriti. 

Levaani sünteesi jälgimine 

Levaani sünteesi vaadeldi mikrotiiterplaadil (CELLSTAR®, Greiner Bio-One GmbH, 

Saksamaa). Reaktsioon viidi läbi 200 μl McIlvaine-i puhvris, mis sisaldas 150 mM sahharoosi 

või rafinoosi. Reaktsioon algatati 50 μg rakuekstrakti või 10 μg puhastatud valgu lisamisega ning 

levaani teket jälgiti 600 min jooksul. Mikroplaate inkubeeriti temperatuuril 23°C plaadiloksutil. 

27

Lainepikkusel 400 nm mõõdeti erinevatel ajapunktidel hägu (levaani) teket Tecan Sunrise TM 

mikroplaadilugejaga (Tecan Group Ltd., Šveits) ja andmed koguti programmiga Magellan TM 

(Tecan Group Ltd.). Tekkinud levaani hulk (mg/ml) arvutati Lsc3 poolt sünteesitud puhastatud 

levaani kaliiberkõvera järgi (T. Visnapuu, avaldamata andmed). 

Valgu kontsentratsiooni määramine 

Valkude kontsentratsioonid (mg/ml) määrati Folini reaktiiviga Lowry meetodil (Lowry et al., 

1951). 

2.2.12 Õhukese kihi kromatograafia 

Õhukese kihi kromatograafia (Thin Layer Chromatography – TLC) analüüsideks tehti 

reaktsioonid samamoodi nagu transfruktosüleeriva aktiivsuse määramiseks (vt. 2.2.11). 0.5 μl 4 

korda destilleeritud vees lahjendatud proovi kanti kontsentreeriva tsooniga TLC plaadi 

stardijoonele (Silica Gel 60 F254, Merck, Saksamaa). Suurusmarkeritena kasutati 0.5 μl 2% 

levaani, 25 mM 1-kestoosi polümerisatsiooniastmega (DP) 3 ja nüstoosi (DP 4), 100 mM 

fruktoosi- ja sahharoosilahust (DP2). Reaktsiooniproduktid ja markerid lahutati TLC plaatidel, 

voolutades neid kaks korda seguga kloroform-metanool-vesi (90:65:15) (Tajima et al., 2000) ning 

fruktoosi sisaldavad produktid visualiseeriti kastes plaate uureat sisaldavasse reaktiivi (3% uurea; 

1 M fosforhape veega küllastunud butanoolis) ning kuumutades neid 120°C (St. John et al., 1996; 

Visnapuu et al., 2009). 

2.2.13 Kasutatud arvutiprogrammid 

Kloneerimisel ja plasmiidide visualiseerimisel oli abiks programm pDRAW32 ver. 1.1.107 

(http://www.acaclone.com/). Mutatsioonide leidmiseks muteeritud lsc3 geenidest kasutati 

nukleotiidsete järjestuste võrdlemist metsiktüüpi lsc3 geeniga programmi BioEdit 7.0.5 abil 

(Hall, 1999; http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). 

Levaansukraaside modelleerimiseks kasutati programmi ModBase (Pieper et al., 2009), mis 

ennustas Lsc3 valgu struktuuri kristalliseeritud G. diazotrophicus’e (PDB ID: 1W18) ja B. 

subtilis’e (PDB ID: 1OYG) levaansukraaside kristallstruktuuri alusel. Mudelite 

visualiseerimiseks kasutati programmi PyMOL versiooni 1.3 (DeLano, 2002). 

28

Aminohapete positsioonide konserveerumise hindamiseks levaansukraasides võeti 

levaansukraaside aminohappelised järjestused CAZy andmebaasist (http://www.cazy.org). Valiti 

välja 24 levaansukraasi valku ja nende järjestused joondati veebipõhise programmiga MUSCLE – 

Multiple Sequence Alignment, versioon 3.8.31 (Edgar, 2004; 

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). 

Levaansukraasi Lsc3 konserveerumise mudel koostati veebipõhise programmi ConSurf ver. 3 abil 

(Glaser et al., 2003; Landau et al., 2005; http://consurf.tau.ac.il/). Mudeli koostamisel kasutati 

sisenditena MUSCLE programmiga koostatud 24 levaansukraasi (sh. Lsc3 valk) joondust ja 

ModBase programmiga G. diazotrophicus’e LsdA baasil ennustatud Lsc3 mudelit. 24 

levaansukraasi joondus koos positsioonide konserveerumise astme (KA) väärtusega on 

kättesaadav veebileheküljelt: https://sites.google.com/site/12karin28/joondus. 

Valkude molekulmassid arvutati ExPASy Proteoomika Serveris (Gasteiger et al., 2005; 

http://expasy.org/tools/pi_tool.html). 

Programmi SigmaPlot 2001 (SYSTAT, USA) ensüümikineetika moodulit 1.1. kasutati ensüümi 

kineetiliste parameetrite arvutamiseks. 

29

2.3 Tulemused ja arutelu 

Levaansukraas on bakteriaalne eksoensüüm, mis lagundab sahharoosi molekulis glükosiidsidet. 

Selle tulemusena vabaneb glükoos ning fruktoosijääk liidetakse teisele sahharoosi molekulile, 

fruktaanahelale või veele. Tavaliselt on bakterites üks levaansukraasi geen, aga P. syringae pv. 

tomato DC3000 genoomis on neid kokku kolm – lsc1, lsc2 ja lsc3, millest üks (lsc3) asub 

plasmiidil. Nende geenide järjestused on omavahel väga sarnased (identsus 95%) ning ei ole 

teada, miks lsc geene on sellel bakteril ning ka teistel P. syringae patovaridel mitu (Visnapuu et 

al., 2008; http://www.cazy.org). Meie uurimisgrupis on põhjalikumalt uuritud levaansukraasi 

Lsc3. 

Biokeemiliste omaduste uurimine näitas, et Lsc3 afiinsus sahharoosile (K m 21 mM) on umbes 

kaks korda suurem kui trisahhariid rafinoosile (K i 48 mM) (Visnapuu et al., 2008). Kõrgel 

substraadi kontsentratsioonil sünteesib Lsc3 lisaks polüsahhariidsele levaanile ka lühemaid FOSe, 

millele ennustatakse prebiootilist toimet (Visnapuu et al., 2009). Lisaks „tavalistele“ 

fruktosüüli aktseptoritele suudab Lsc3 transfruktosüülimisel kasutada ka „ebatavalisi“ 

aktseptoreid, näiteks ksüloosi, ksülobioosi, fukoosi ja galakturoonhapet, sünteesides uudseid 

heterooligofruktaane (T. Visnapuu, avaldamisel), mis avardab valgu biotehnoloogilist kasutamist. 

Et teha algust Lsc3 valgu struktuur-funktsioon analüüsiga, alustasime lsc3 geeni juhuslike 

mutantide saamise, nende E. coli’s ekspresseerimise ning analüüsiga. 

2.3.1 Levaansukraasi geeni mutantide raamatukogu koostamine ja selektsioon 

Escherichia coli’s 

Plasmiidil pHIPMalprom lsc3 geeni kandvate E. coli transformantide muteerimine ja elumuse 

määramine on kirjeldatud peatükis 2.2.3 ja töödes Mardo (2009) ning Mardo et al. (2010). 

Mutageenina kasutasime etüülmetaansulfonaati (EMS), mis tekitab DNA-s asendusmutatsioone. 

Muteeritud rakkudest eraldati plasmiidid, levaansukraasi kodeerivad piirkonnad amplifitseeriti 

ning kloneeriti uuesti vektorisse pHIPMalprom. Saadud plasmiidse raamatukoguga 

transformeeriti E. coli tüve DH5α ning rakud plaaditi sahharoosi sisaldavale tardsöötmele 

ekspresseeritava levaansukraasi omaduste hindamiseks. 

Kuna E. coli ei suuda kasutada sahharoosi, siis muutuvad sahharoosisöötmel limaseks ainult need 

E. coli transformandid, mis sünteesivad aktiivset polümerisatsioonivõimelist levaansukraasi – 

30

koloonia pinnale moodustub limajas levaanikiht. 500 sahharoosiga söötmel kasvavast kolooniast 

valisime välja 7 mittelimast ja vähelimast kolooniat, mis PCR-i analüüsi kohaselt sisaldasid lsc3 

geeni. Neist transformantidest eraldati plasmiidid ning nende lsc3 geen sekveneeriti 

mutatsioonide tuvastamiseks. Järjestuste analüüsil selgus, et juhusliku mutageneesiga oli 

levaansukraasi geeni enamasti tekkinud rohkem kui üks valgus aminohapet vahetav mutatsioon. 

Vastavad raamatukogust selekteeritud plasmiidid on kirjas Tabelis 2 ning tuvastatud mutatsioonid 

on toodud Tabelis 4. Mutantseid lsc3 geene kandvad plasmiidid tähistati tähtedega A-H. Hiljem 

suunatud mutageneesiga tekitatud Lsc3 mutandid on kirjas tabeli viimases tulbas. 

Tabel 4. Levaansukraasi keemilisel muteerimisel isoleeritud mutandid, mutageeniga töötlemise 

aeg, tuvastatud mutatsioonid ning koht-suunatud mutageneesiks väljavalitud variandid. 

EMS-ga 

Suunatud 

Lsc3 

Koodoni muutus Aminohappe 

töötlemise 

mutageneesiga 

mutant 

geenis asendus valgus 

aeg 

tehtud Lsc3 mutant 

TCG → CCG Ser123 → Pro 

MutA 90 min GTT → GCT Val329 → Ala V329A 

CTG → CCG Leu406 → Pro 

MutB 90 min CAG → CGG Gln269 →Arg Q269R 

CCG → CTG Pro222 → Leu 

MutD 60 min TTC → CTC Phe344 → Leu 

TCG → TTG Ser411 → Leu S411L 

MutE 90 min 

CAT → CAA His113 → Gln H113Q 

GTC → ATC Val195 → Ile 

GCG → ACG Ala49 → Thr 

GAG → GGG Glu68 → Gly 

MutF 120 min 

CGC → CAC Arg89 → His 

AAA → AGA Lys196 → Arg 

CTC → CCC Leu281 → Pro L281P 

GTT → GCT Val329 →Ala V329A 

GAT → AAT Asp31 → Asn D31N 

MutG 120 min 

GAA → GGA Glu252 → Gly 

GAT → AAT Asp300 → Asn D300N 

TGC → TGG Cys371 → Trp C371W 

GTC → GAC Val53 → Asp 

MutH 90 min 

CAG → CGG Gln95 → Arg 

GAA → GTA Glu209 → Val 

ACC → CCC Thr302 → Pro T302P 

60 min ACC → ATC Thr41 → Ile T41I 

ACC → ATG Thr302 → Met T302M* 

* Mutatsioon tekitati koht-suunatult, et imiteerida Z. mobilis’e invertaasi vastavat piirkonda. 

31

2.3.2 Levaansukraaside järjestuste võrdlemine ning isoleeritud mutantide 

muteerunud positsioonide konserveerumise hindamine 

Kuna me ei teadnud, milliste aminohapete asendused võisid mitmikmutantides olla levaani 

sünteesi puudumise põhjuseks, otsustasime võrrelda levaansukraaside valgujärjestusi ning 

hinnata muteerunud positsioonide konserveerumist ja asukohta Lsc3 mudelil. Ennustuste alusel 

valisime nende hulgast välja huvipakkuvad mutatsioonid, mis seejärel ühekaupa koht-suunatult 

lsc3 geeni sisse viia. 

CAZy andmebaasist valisime välja 24 levaansukraasi valgujärjestust, mille joondamiseks 

kasutasime MUSCLE programmi (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). LISA-s 1 on näitena 

toodud väljavõte nelja levaansukraasiga tehtud joondusest. Lsc3 valgu aminohappeline järjestus 

on kõrvutatud G. diazotrophicus’e LsdA, Z. mobilis’e LevU ja B. subtilis’e SacB valkude 

järjestustega. Võrdlusest teiste levaansukraasidega ennustame, et Lsc3 aktiivtsentri katalüütilise 

kolmiku moodustavad Asp62 (D62), Asp219 (D219) ja Glu303 (E303). Suunatud mutageneesi 

abil oleme eksperimentaalselt kinnitanud nende aminohapete võtmerolli katalüüsis. Lsc3 valgu 

mutandid Asp62Ala, Asp219Ala ja Glu303Ala on katalüütiliselt inaktiivsed (Elmi, 2011). 

Vastavad aminohapped on punaselt tähistatud joondusel LISA-s 1 ja ka töös esitatud Lsc3 valgu 

mudelitel. 

Muteerunud positsioonide konserveerumise hindamiseks Lsc3 mutantides kasutasime programmi 

ConSurf (http://consurf.tau.ac.il/), mis ennustab valgu iga aminohappe konserveerumise astet 

(KA) arvulisel skaalal 1-9, milles 1 tähistab konserveerumise puudumist ning 9 täielikku 

konserveerumist levaansukraaside seas. Konserveerumise astmed märkisime lisareana 

levaansukraasi valkude joondusele LISA-s 1. 

Leidsime, et MutA isolaat sisaldas kolme mutatsiooni: Ser123Pro; Val329Ala ja Leu406Pro. 

Sahharoosisöötmel ei läinud vastav E. coli transformant limaseks. Konserveerumise astmed 

MutA neile positsioonidele olid järgmised: Leu406 (KA 7), Ser123 (KA 8) ning Val329 (KA 1). 

Kuigi Val329 asub mittekonserveerunud positsioonil, on ikkagi seal kõige sagedamini kas Val või 

Leu. Kuna mutatsioon Val329Ala esines veel ühel isoleeritud mutandil (kuuikmutandil MutF), 

siis otsustati hoolimata positsiooni varieeruvusest selline üksikmutant suunatult tekitada. MutB 

on üksikmutant, mis isoleeriti vähenenud limatootmise järgi ning millel oli vahetunud üks 

aminohape positsioonis 269 (Gln269Arg). Kuigi selle positsiooni KA levaansukraasides oli ainult 

1, on gramnegatiivsete bakterite levaansukraasides seal valdavalt Gln. MutD (Pro222Leu; 

32

Phe344Leu; Ser411Leu) isoleeriti kui lima mitteprodutseeriv kolmikmutant. Pro222 ja Phe344 

paiknevad levaansukraaside keskmiselt konserveerunud piirkondades (KA 5), Ser411 KA oli 6, 

enamasti paikneb selles positsioonis kas Ser või Thr, mitte ühelgi juhul Leu. Otsustati suunatult 

tekitada mutant Ser411Leu, mis aga ei ekspresseerunud valguna korralikult. Oletame, et just see 

asendus põhjustab MutD fenotüübi. MutE (His113Gln; Val195Ile) sisaldas kahte mutatsiooni 

ning vastaval transformandil moodustus lima väga aeglaselt. His113 on konserveerunud 

positsioon levaansukraasides (KA 8), kuid näiteks LevU valgus on seal Asn ja SacB valgus Ala 

(vt. LISA 1). Val195-ga (KA 8) ekvivalentsel kohal on levaansukraasides enamasti kas Val või 

His. Suunatult muteerimiseks valiti välja variant His113Gln. MutF on kuuikmutant (Ala49Thr, 

Glu68Gly, Arg89His, Lys196Arg, Leu281Pro ja Val329Ala). Ala49, Lys196 ja Leu281 on 

levaansukraaside varieeruvate positsioonide aminohapped (KA 1), Glu68 konserveerumise aste 

on 3, Arg89 konserveerumine on MutF mutantsetest positsioonidest suurim (KA 7). Suunatult 

otsustati üksikmutantidena tekitada variandid Val329Ala, kuna sama mutatsioon leiti ka 

mutandist A ning Leu281Pro. Mutantides MutG ja MutH oli toimunud kummaski neli 

aminohappe asendust: MutG puhul Asp31Asn, Glu252Gly, Asp300Asn ja Cys371Trp ning MutH 

puhul Val53Asp, Gln95Arg, Glu209Val ja Thr302Pro. Mõlema mutandi puhul puudus vastaval 

transformandil levaani süntees sahharoosiga söötmel. MutG puhul otsustati suunatult tekitada 

üksikmutandid Asp31Asn, Asp300Asn ja Cys371Trp. Asp31 (KA 6) positsioon on 

läbikonserveerunud gramnegatiivsete bakterite levaansukraasides, Asp300 (KA 8) kuulub 

levaansukraaside konserveerunud motiivi D(E/Q)(T/I/V)ER (Meng ja Fütterer, 2003; Martinez- 

Fleites et al., 2005), milles paikneb ka ennustatud alus-hape katalüüsisija Glu303. Cys371-le (KA 

5) vastaval kohal on levaansukraasidel enamasti kas Cys või Tyr. MutH puhul valiti suunatult 

muteerimiseks variant Thr302Pro. Thr302 (KA 8) paikneb samuti levaansukraaside 

konserveerunud motiivis D(E/Q)(T/I/V)ER. Teistest MutH mutatsioonidest paikneb Glu95 

lõigul, mis puudub paljudes levaansukraasides, Glu209 on varieeruv aminohape (KA 2) 

levaansukraasides ning ka Val53 on suhteliselt vähe konserveerunud (KA 4). 

2.3.3 Lsc3 valgu 3D struktuuri ennustamine 

Kristallstruktuur on kindlaks tehtud kolmel bakteriaalsel levaansukraasil – G. diazotrophicus’e 

LsdA, B. subtilis’e SacB ning B. megaterium’i SacB valgul (Meng ja Fütterer, 2003; Martinez- 

Fleites et al., 2005; Strube et al., 2011). Lsc3 valgu 3D struktuuri ennustasime ModBase serveris 

33

(Pieper et al., 2009) võttes aluseks G. diazotrophicus’e (PDB ID: 1W18) kristalliseeritud 

levaansukraasi struktuuri. Kahe valgu mudeli ah järjestus kattub 46% ulatuses ning Lsc3 mudel 

koosneb 404-st aminohappest (27→431). Mudeli avamiseks kasutasime programmi PyMOL 

(DeLano, 2002). Lsc3 valgu ennustatud 5-labalise β-propelleri struktuur on näidatud Joonisel 5. 

Lsc3 3D mudelit kasutasime mutantsete levaansukraaside fenotüübi interpreteerimisel ja 

kasutame edaspidi ka positsioonide valikuks uute suunatud mutantide tegemisel. 

Joonis5. Lsc3 valgu 3D struktuur ennustatuna G. diazotrophicus’e LsdA baasil (PDB ID: 1W18). 

Punasega on tähistatud katalüütilise kolmiku aminohapped Asp62, Asp219 ja Glu303. 

2.3.4 Mutantsete levaansukraaside ekspresseerimine ja esmane iseloomustamine 

Mitmikmutantidest välja valitud mutatsioonid (vt. Tabel 4) viisime koht-suunatult lsc3 geeni (vt. 

2.2.7). Tekitatud mutatsioonidega lsc3 geenid kloneerisime pURI3 vektorisse (de las Rivas et al., 

2007). pURI3 vektorisse kloneeriti ka eelnevalt minu bakalaureusetöös isoleeritud Lsc3 mutandi 

Thr41Ile geen (Mardo, 2009). Lsc3 valku viidi täiendavalt sisse ka mutatsioon Thr302Met, et 

teha see Lsc3 piirkond sarnaseks Z. mobilis’e invertaasi vastava piirkonnaga. Nimelt on vastavas 

34

positsioonis Z. mobilis’e invertaasil metioniin, kuid levaansukraasil treoniin. Muidu on Z. 

mobilis’e ekstratsellulaarne invertaas (SacC) ja levaansukraas (LevU) omavahel väga sarnased 

(identsus 65.3%), kuid invertaas ei suuda fruktoosijääke polümeriseerida ega levaani 

hüdrolüüsida (Kyono et al., 1995; Kannan et al., 1998). 

Levaansukraasi üleekspressiooniks kasutati E. coli BL21(DE3) tüve, kuhu elektroporeeriti 

mutantset levaansukraasi geeni kandvad plasmiidid. Indutseeritud rakkudest valmistati 

rakuekstraktid (pt. 2.2.8) ning levaansukraaside ekspressiooni kontrolliti SDSpolüakrüülamiidgeelil. 

Kõikides rekombinantsetes rakuekstraktides oli ühtlaselt hea Lsc3 

üleekspressioon. Erandiks oli mutant Ser411Leu, mille puhul puudus rakuekstraktis 

levaansukraasne aktiivsus ning vastava valgu ekspressiooni ei olnud näha ka SDS-geelil. 

Mutansete levaansukraaside head ekspressiooni on näha näiteks geelil, millel analüüsiti valgu 

Thr302Met puhastamise käiku (Joonis 6, rada 2). 

Kuna His-märgisega Lsc3 valgud ekspresseerusid pURI3 vektoris E. coli rakkudes väga hästi, 

siis kasutasime rakulüsaate mutantsete valkude esmaseks iseloomustamiseks. Mõõtsime 

rakuekstraktidest mutantsete ensüümide maksimaalset reaktsioonikiirust (V max ; U/mg) ja afiinsust 

sahharoosile (K m ; mM). Võrdlusena kasutasime ekstrakti rakkudest, mis ekspresseerisid 

muteerimata Lsc3 valku. Tulemused on kokku võetud Tabelis 5. 

Tabel 5. Rakuekstraktides määratud mutantsete levaansukraaside kineetilised parameetrid (V max 

ja K m sahharoosile) võrrelduna metsiktüüpi Lsc3 valgu (WT) vastavate näitajatega. 

Lsc3 valgu variant V max (U/mg) K m (mM) 

WT (muteerimata) 342.3±8.2 24.3 ± 2.7 

D31N* 143.6±7.7 12.8±2.6 

T41I* 181.6±9.7 58.2±8.5 

H113Q* 13.8±1.1 116.0±22.1 

Q269R 169.9±10.6 16.9±3.5 

L281P 206.8±6.7 17.4±1.9 

D300N* 143.1±7.2 48.7±7.1 

T302M* 158.3±5.7 13.9±1.8 

T302P* 138.1±4.9 55.1±5.3 

V329A 196.4±12.7 16.3±3.6 

C371W 250.9±6.9 22.4±1.8 

* Mutantsed valgud, mida hiljem analüüsime ka puhastatud kujul. 

35

Nägime, et kõigil mutantsetel ensüümidel oli V max vähenenud, kuid kõige drastilisemalt oli see 

langenud His113Gln mutandil. Pool või alla selle oli maksimaalsest reaktsioonikiirusest säilinud 

mutantidel Asp31Asn, Gln269Arg, Asp300Asn, Thr302Met ja Thr302Pro. Samas oli mutantidel 

Asp31Asn ja Thr302Met tõusnud afiinsus sahharoosile. Nende andmete põhjal valisime välja 

edasiseks puhastamiseks kuus mutantset Lsc3 varianti: Asp31Asn, Thr41Ile, His113Gln, 

Asp300Asn, Thr302Met ja Thr302Pro. 

2.3.5 Valitud mutantsete levaansukraaside puhastamine ja substraadispetsiifika: 

võrdlus muteerimata Lsc3 valguga 

N-terminaalse His 6 -järjestusega Asp31Asn, Thr41Ile, His113Gln, Asp300Asn, Thr302Met ja 

Thr302Pro valgud puhastati Ni 2+ -afiinsuskromatograafiaga. Protsessi optimiseerimiseks 

puhastasime rakuekstraktist esmalt His 6 -järjestusega muteerimata Lsc3 valgu ning seejärel 

sobivat metoodikat kasutades (vt. pt. 2.2.9) ka mutantsed valgud. Kõigist puhastamise etappidest 

võeti proovid ning SDS-polüakrüülamiidgeelil kontrolliti levaansukraasi olemasolu ning puhtust. 

Joonisel 6 on näidatud mutandi Thr302Met puhastamise käik. 

Joonis 6. SDS-PAGE geel Lsc3 mutantse 

valgu Thr302Met puhastamise etappide 

analüüsimiseks. Rajale 1 kanti valgu 

suurusmarker PageRuler TM SM0671, millel 

on tähistatud valgud suurusega ~70, 55, 40 

ja 35 kDa. Rajale 2 kanti rakulüsaat (~10 μg) 

ning radadele 3-5 sonikeerimispuhvriga 

Ni 2+ -NTA pesemisel saadud supernatant (5 

μl). Radadele 6-8 on sidumiskolonnist 500 

mM imidasooliga elueerunud fraktsioonid (1 

μl). Rajale 9 kanti 1 μg puhastatud 

muteerimata Lsc3 valku (molekulmass ~50 

kDa). 

2.3.5.1 Sahharoos ja rafinoos mutantsete levaansukraaside substraatidena 

Levaansukraasi koguaktiivsust mõõdeti glükoosi eraldumise kiiruse järgi sahharoosist selle 

erinevatel kontsentratsioonidel ning programmi SigmaPlot ensüümikineetika moodulit kasutades 

arvutati välja V max (U/mg) ja K m (mM). Ensüümi afiinsust rafinoosile hinnati K i (mM) kaudu. 

36

Arvutati välja ka ensüümi katalüütiline konstant k cat (1/min) ja katalüütiline efektiivsus (k cat /K m ) 

(vt. pt. 2.2.11). Tulemused on esitatud Tabelis 6. 

Tabel 6. Puhastatud levaansukraaside kineetilised parameetrid võrdlusena muteerimata Lsc3 

(WT) vastavate andmetega. Substraadina kasutati sahharoosi. 

Valk V max (U/mg) K m (mM) K i (mM)* k cat (1/min) 

k cat /K m 

(1/M*min) 

WT (muteerimata) 610.5±82.0 18.5±2.5 39.9±6.1 3.03x10 4 16.36x10 5 

D31N 393.3±23.4 14.9±4.6 33.6±1.1 1.95x10 4 13.09x10 5 

T41I 509.6±43.9 36.8±10.4 89.2±34.1 2.53x10 4 6.87x10 5 

H113Q 51.6±3.8 190.1±28.3 218.2±49.6 0.26x10 4 0.13x10 5 

D300N 406.6±15.2 50.7±5.4 127.9±20.8 2.02x10 4 3.98x10 5 

T302M 356.0±9.8 15.1±1.8 40.8±5.9 1.76x10 4 11.68x10 5 

T302P 420.5±21.9 42.5±6.7 81.8±16.3 2.08x10 4 4.89x10 5 

* inhibitsioonikonstant rafinoosile 

Tabelist 6 on näha, et metsiktüüpi Lsc3 kasutab sahharoosi substraadina väga hästi ja reaktsioon 

toimub kiiresti (k cat 3.03x10 4 1/min), afiinsus sahharoosile (K m 18.5 mM) on samas suurusjärgus 

nagu enamikel levaansukraasidel. Näiteks SacB valgu K m sahharoosile on 8 mM, LsdA valgul 

11.9 mM ja LevU valgul 125 mM (Yanase et al., 2002; Martinez-Fleitez et al., 2005; Ortiz-Soto 

et al., 2008). Afiinsus rafinoosile hinnatuna K i kaudu on Lsc3 valgul umbes kaks korda madalam 

kui sahharoosile (K i 39.9 mM). Suhe k cat /K m näitab katalüüsi efektiivsust, mis on muteerimata 

Lsc3 valgu puhul kõige suurem (16.36x10 5 1/M*min). Seega on Lsc3 kõrgema katalüütilise 

efektiivsusega kui LsdA (k cat /K m 3.2x10 5 1/M*min) (Batista et al., 1999) ja LevU (k cat /K m 

0.14x10 5 1/M*min) (Yanase et al., 2002). Näitasime ka, et His 6 järjestuse lisamine Lsc3 valgu N- 

terminaalsesse otsa ei alanda valgu katalüütilist aktiivsust. Eelnevalt on meie grupis proovitud 

His-järjestust lisada ka Lsc3 valgu C-terminusse. Sellisel juhul oli levaansukraasne aktiivsus ja 

valgu ekspressioon E. coli rakuekstraktis madal (avaldamata andmed). Järeldame, et Lsc3 valgu 

puhul sobib paremini His-märgise lisamine valgu N-terminusse nagu sobis ka Z. mobilis’e 

levaansukraasile LevU (Li et al., 2008). Samas on mõnede teiste bakterite levaansukraaside 

puhastamiseks kasutatud ka C-terminaalset His-märgist (van Hijum et al., 2004; Tieking et al., 

2005; Seibel et al., 2006; Rairakhwada et al., 2010). 

Kõigil Tabelis 6 esitatud mutantidel on alanenud sahharoosi lagundamise katalüütiline efektiivsus, 

k cat /K m , seda tänu nii V max alanemisele kui ka K m tõusule. Mõnel mutandil (Asp31Asn ja 

Thr302Met) oli afiinsus sahharoosile siiski ka natuke tõusnud. Afiinsus rafinoosile oli mutantidel 

37

enam-vähem sama palju alanenud kui sahharoosile. Seega ei muutunud mutantidel 

substraadieelistus – sahharoos oli ensüümile endiselt kaks korda paremaks substraadiks kui 

rafinoos. Erandiks oli mutant His113Gln, millel oli afiinsuse langus sahharoosile suurem kui 

rafinoosile. His113Gln mutant oli ka kirjeldatud mutantide hulgast kõige enam metsiktüüpi Lsc3 

valgust erinev – k cat /K m vähenes ~100 korda. 

2.3.5.2 Levaan mutantsete levaansukraaside substraadina 

Määrasime puhastatud algsel ja muteeritud Lsc3 valkudel Asp31Asn, Thr41Ile, His113Gln, 

Asp300Asn, Thr302Met ja Thr302Pro ka levaani lagundamise võimet. Katsetes kasutasime 

substraadina P. syringae Lsc3 valguga sünteesitud puhastatud levaani (puhastanud T. Visnapuu). 

Mõõtsime redutseerivate suhkrute tekke kiirust 1% levaanist ja võrdlesime seda redutseeriva 

suhkru tekke kiirusega 400 mM sahharoosist. 

Metsiktüüpi Lsc3 valgu puhul moodustab redutseeriva suhkru tekke kiirus levaanist alla 1% 

(0.6±0.1%) vastavast 400 mM sahharoosiga mõõdetud kiirusest. Seega on levaan Lsc3-le 

suhteliselt ebasobiv substraat. Levaani suudab lagundada ka B. subtilis’e levaansukraas 

(Chambert ja Petit-Glatron, 1993). Sarnaselt Lsc3 valgule moodustab Z. mobilis’e levaansukraasi 

levaani hüdrolüüsiv aktiivsus ligikaudu 1% sahharoosi lagundamise aktiivsusest (Jang et al., 

2007). Levaani hüdrolüüsivõime kõige suuremat langust oli märgata Lsc3 mutandil Thr302Pro, 

võrreldes metsiktüüpi valguga oli see langenud ligi 6 korda. Ligikaudu 4 korda oli vähenenud ka 

mutantide Thr41Ile, His113Gln ja Asp300Asn levaani lagundamise võime. Samas oli mutandil 

Asp31Asn levaani hüdrolüüsi võime 1.4 korda suurem kui metsiktüüpi Lsc3 valgul. Thr302Met 

mutant ei erinenud levaani kasutamise poolest metsiktüübist. 

2.3.6 Mutantsete levaansukraaside polümeriseerivad omadused 

Levaansukraaside polümeriseerimisomadused on erinevad. Näiteks kui SacB valk sünteesib 

peamiselt pika ahelaga levaani, siis G. diazotrophicus’e ensüüm toodab suhteliselt palju lühikese 

ahelaga produkte – fruktooligosahhariide (Chambert et al., 1974; Hernandez et al., 1995). Varem 

on näidatud, et teatud mutatsioonid muudavad levaansukraaside polümeriseerimisomadusi. 

Näiteks asendades SacB valgus Arg360 kas leutsiini või seriiniga kaob ensüümil peaaegu võime 

polümeriseerida levaani (Chambert ja Petit-Glatron, 1991). Sarnase fenotüübiga on ka Z. 

38

mobilis’e LevU mutandid His269Leu/Ser ja Glu211Gln (Yanase et al., 2002). Ekvivalentsed 

positsioonid Lsc3 valgus on vastavalt His321 ja Glu236 (LISA 1). 

Antud töös soovisime mõõta meie isoleeritud mutantsete levaansukraaside polümeriseerivat 

aktiivsust ja levaani tekke kineetikat, hinnata sünteesitavate produktide spektrit ning võrrelda 

saadud tulemusi muteerimata valgu vastavate andmetega. Kuna juhuslike mutantide 

selekteerimine viidi läbi just lima (levaani) teket jälgides, siis ootasime siin suuri erinevusi 

metsiktüüpi valgust. Polümerisatsioonireaktsioon viidi läbi McIlvaine-i puhvris temperatuuril 

37°C 20 h jooksul. Reaktsioonisegu sisaldas 1.2 M sahharoosi ning 2.7 U/ml levaansukraasi 

puhastatud valku. Reaktsiooni käigus moodustub erinevaid reaktsiooniprodukte: polümeerset 

levaani, fruktooligosahhariide, vaba fruktoosi ja glükoosi. Segusse võib jääda ka reageerimata 

sahharoosi. Reaktsioonisegud kanti silikageelplaadile ning voolutati, nagu on näidatud peatükis 

2.2.12. Seejärel ilmutati fruktoosi sisaldavad produktid uureat sisaldava reaktiiviga (Joonis 7). 

Joonis 7. Metsiktüüpi ja mutantsete levaansukraaside 1200 

mM sahharoosist sünteesitud reaktsiooniproduktide 

lahutamine õhukese kihi kromatograafiaga. 

Reaktsioonisegusid lahjendati 4 korda ja 0.5 μl kanti plaadi 

stardijoonele. Radadel 1 ja 2 on markersuhkrud: 2% levaan 

(L), 25 mM nüstoos (N; DP 4), 25 mM 1-kestoos (K; DP 3), 

0.1 M sahharoos (S; DP 2) ja 0.1 M fruktoos (F). Rajal 3 on 

muteerimata Lsc3-e, radadel 4 ja 5 mutantide Thr302Met ja 

Thr302Pro produktide spekter. Plaati voolutati ja ilmutati, 

nagu on kirjeldatud pt. 2.2.12. 

TLC analüüs näitab, et metsiktüüpi (muteerimata) Lsc3 toodab palju levaani (vt. tumedat laiku 

stardijoonel), aga sellele lisaks ka lühemaid FOS-e, nagu on näidanud ka meie varasemad tööd 

(Visnapuu et al., 2009). Mutant Thr302Pro toodab rohkem väiksemaid oligosahhariide, näiteks 

on tema puhul näha rohkem kestoosi liikuvusega produkti, samas on pikemate FOS-ide ja levaani 

moodustumine tunduvalt vähenenud. Tundub, et selle aminohappe vahetus põhjustab suuri 

muutusi levaansukraasi polümeriseerivates omadustes. Samas kui Thr302 asendada metioniiniga 

(mutant Thr302Met), siis on sünteesitavate produktide spekter sama, mis metsiktüüpi valgul. 

39

Mõõtsime ka erinevate mutantide polümeriseerivat (transfruktosüleerivat) aktiivsust. Selleks 

määrasime glükoosi ja fruktoosi sisaldust samades reaktsioonisegudes, millest TLC abil lahutati 

1.2 M sahharoosist sünteesitud reaktsiooniprodukte. Glükoosi ja fruktoosi sisalduste vahe kaudu 

arvutati levaansukraasi polümeriseeriv aktiivsus – protsent, mis näitab, kui suur osa reageerinud 

sahharoosis sisaldunud fruktoosist polümeriseeritakse (pt. 2.2.11). Puhastatud levaansukraaside 

transfruktosüleerivad aktiivsused on esitatud Tabelis 7. 

Tabel 7. Mutantsete Lsc3 valkude transfruktosüüliv (TA) aktiivsus. 

Valk WT D31N T41I H113Q D300N T302M T302P 

TA (%)* 73.7±1 67.3±3.7 74.9±0.8 44.6±1.2 60.4±2.8 66.6±0.9 46.8±2.6 

* Puhastatud valke (2.7 U/ml) inkubeeriti McIlvaine-i puhvris (pH 6.0) 1.2 M sahharoosiga 

temperatuuril 37°C 20 h jooksul ning reaktsioonisegus mõõdeti ensümaatiliselt glükoosi ja 

fruktoosi sisaldus. Transfruktosüüliv aktiivsus arvutati välja glükoosi ja fruktoosi sisalduste vahe 

kaudu. 

Metsiktüüpi Lsc3 polümeriseerib nendes reaktsioonitingimustes 74% sahharoosist vabanenud 

fruktoosi jääkidest, kuid mutantidel His113Gln ja Thr302Pro on see väärtus kõigest 45% ja 47%. 

Mutandid Asp31Asn, Thr41Ile ja Thr302Met ei erine polümeriseeriva aktiivsuse poolest 

metsiktüüpi valgust. Mutandi Thr302Pro madalam polümeriseeriv võime on selgelt näha ka TLC 

analüüsil: levaani täpp on suhteliselt nõrk ning pikemaid fruktooligosahhariide moodustub vähe 

(Joonis 7). 

Levaani teket reaktsioonis saab mõõta spektrofotomeetriliselt optilise tiheduse tõusu kaudu, sest 

levaan on hägune (Meng ja Fütterer, 2003). Jälgisime erinevatel Lsc3 mutantsetel variantidel 

levaani tekke kineetikat 150 mM sahharoosist ja 150 mM rafinoosist mikrotiiterplaadil, mõõtes 

lahuse hägusust lainepikkusel 400 nm (pt. 2.2.11). Kõrgemat substraadi kontsentratsiooni ei 

saanud katses kasutada, sest rafinoos sadenes välja. Kasutades Lsc3 puhastatud levaani baasil 

tehtud kaliiberkõverat (T. Visnapuu), arvutati reaktsioonides tekkinud levaani hulk (mg/ml) 

(Joonised 8 ja 9). 

40

Joonis 8. Levaani teke (mg/ml) 150 mM sahharoosist ja 150 mM rafinoosist ~600 min jooksul 

(~10 h). Reaktsioon viidi läbi puhastatud levaansukraasidega McIlvaine-i puhvris temperatuuril 

22°C, valku lisati reaktsioonisegusse 10 μg /ml. Levaani teket mõõdeti lainepikkusel 400 nm ja 

moodustunud levaani kogus arvutati kaliiberkõvera alusel. 

Joonis 9. Levaani teke (mg/ml) 150 mM sahharoosist ja 150 mM rafinoosist ~600 min jooksul 

(~10 h). Reaktsiooni lisati levaansukraase ekspresseerivate E. coli rakkude ekstrakti arvestusega 

50 μg valku/ml. Täiendav informatsioon on esitatud Joonise 8 allkirjas. 

Puhastatud muteerimata Lsc3 sünteesib sahharoosist levaani maksimaalselt 27 mg/ml (120 

minutiga), kuid rafinoosist sünteesib ta levaani ligi poole vähem (18 mg/ml, 300 minutiga). 

Kõige suuremat erinevust metsiktüüpi Lsc3 valgust näitas mutant Thr302Pro, mis sünteesis 

sahharoosist ja rafinoosist väga vähe levaani (vastavalt 4.4 ja 2.2 mg/ml; 180 minutiga ja 440 

minutiga) (Joonis 8). Vähe ja väga aeglaselt sünteesis levaani ka mutant His113Gln: sahharoosist 

sünteesis see mutant levaani kuni 2.4 korda vähem (11.4 mg/ml, 1440 minutiga) kui metsiktüüpi 

valk, rafinoosist 3.4 korda vähem (5.2 mg/ml) ning maksimaalne mõõdetud levaani kogus oli 

detekteeritav alles 1380 minuti möödudes. Mutantidel Thr41Ile ja Asp300Asn oli levaani teke nii 

41

sahharoosist kui ka rafinoosist aeglasem kui metsiktüüpi Lsc3 valgul. Asp300Asn vahetuse korral 

on levaani süntees rafinoosist palju aeglasem kui sahharoosist, mis võib tuleneda Asp300Asn 

mutandi vähenenud afiinsusest rafinoosile (vt. Tabel 6). Teised puhastatud mutantsed Lsc3 valgud 

(Asp31Asn ja Thr302Met) käitusid selles katses suhteliselt sarnaselt muteerimata valgule. 

Analüüsisime levaani sünteesi ka neil Lsc3 mutantidel, mida ei puhastatud. Reaktsioon viidi läbi 

neid valke ekspresseerivate E. coli rakkude ekstraktidega. Joonis 9 näitab, et mutant Gln269Arg 

toodab neist mutantidest kõige vähem levaani nii sahharoosist (12 mg/ml, 120 minutiga) kui ka 

rafinoosist (8 mg/ml, 240 minutiga). Võrreldes metsiktüüpi Lsc3 valguga (sahharoosist 21 

mg/ml, 105 minutiga; rafinoosist 16.6 mg/ml 165 minutiga) oli sel mutandil levaani süntees 

langenud ligi poole võrra. Gln269Arg mutatsioon on pärit üksikmutandist MutB, mis isoleeriti 

10% sahharoosiga tardsöötmelt vähenenud lima tekke järgi. Levaani sünteesi andmed on seega 

kooskõlas isoleeritud mutantse klooni fenotüübiga. Ka mutandil Cys371Trp on levaani süntees 

vähenenud, kuigi mitte nii tugevasti kui mutandil Gln269Arg. Ülejäänutel katses analüüsitud 

mutantidel (Leu281Pro ja Val329Ala) ei olnud levaani moodustumine vähenenud. 

2.3.7 Mutantsete levaansukraaside termostabiilsus 

Juba 1889. aastal leidis S. Arrhenius, et nii keemiliste kui ka ensümaatiliste reaktsioonide kiirus 

suureneb temperatuuri tõustes. Siiski tuleb silmas pidada asjaolu, et valgud hakkavad kõrgetel 

temperatuuridel denatureerima. Ka on näidatud, et mida puhtam on valk, seda 

temperatuuritundlikum ta on (Lasch, 1987) ja mutatsioonid valgus võivad muuta ensüümi 

termolabiilsemaks. Näiteks muteerides grampositiivse bakteri Lb. reuteri 121 levaan- ja 

inulosukraasis Ca 2+ sidumises osalev aspartaat alaniiniks, langeb mõlemal ensüümil nii 

termostabiilsus kui ka katalüütiline aktiivsus (Ozimek et al., 2005). Lb. reuteri levaansukraasi 

Asp500 positsioonile vastab B. subtilis’e SacB valgus Asp339 ning Lsc3 valgus vastab sellele 

omakorda Asp300 (vt. LISA 1). 

Et saada teada, kuidas mõjutasid uuritud mutatsioonid Lsc3 valgu stabiilsust (struktuuri), 

uurisime valkude termostabiilsust (vt. metoodika 2.2.11). Tulemused on esitatud Joonisel 10. 

42

Joonis 10. Lsc3 valgu ja selle mutantide termostabiilsus. Puhastatud valke inkubeeriti McIlvainei 

puhvris (pH 6.0) 30 minutit erinevatel temperatuuridel (20°C-70°C), jahutati jääl ja seejärel 

mõõdeti ensüümide jääkaktiivsus glükoosi tekke järgi 100 mM sahharoosist temperatuuril 37°C. 

Aktiivsuse väljendamisel võrdsustati 100%-ga temperatuuril 20°C inkubeeritud valgu 

jääkaktiivsus. Joonisele on märgitud kahe määramise keskmised ning standardhälbed. 

Jooniselt 10 on näha, et muteerimata Lsc3 valk on kõige termostabiilsem, hakates kaotama 

aktiivsust alles 60°C inkubeerimisel. Kõrgele temperatuurile tundlikumad on mutandid, millel on 

vahetunud aminohape valgu N-terminaalses piirkonnas (Asp31Asn ja Thr41Ile). See näitab, et 

valgu N-terminus on oluline valgu struktuuri säilumiseks ning et mutatsioonid selles piirkonnas 

destabiliseerivad valku. Ka Thr302Pro ning Asp300Asn mutandid on väiksema 

termostabiilsusega kui muteerimata Lsc3. Ilmselt võib Thr302 asendus H-sidemeid mitteandva 

proliiniga mõjutada valgu stabiilsust, Thr302 asendus metioniiniga aga seda ei tee. Kuigi 

gramnegatiivsete bakterite levaansukraasid (sh. Lsc3) ei vaja struktuuri stabiliseerimiseks Ca 2+ - 

ioone (Hettwer et al., 1995; Martinez-Fleites et al., 2005; T. Visnapuu, avaldamata andmed), 

näitavad meie tulemused, et Asp300 võiks ka olla oluline Lsc3 valgu struktuuri hoidmisel. 

His113Gln mutandil on küll tugevasti vähenenud ensümaatiline aktiivsus, kuid valk on väga 

stabiilne. 

43

2.3.8 Mutatsioonide paigutamine Lsc3 valgu mudelile ja mutantsete fenotüüpide 

analüüs 

Tähistasime meie poolt isoleeritud mutatsioonid Lsc3 valgu ennustatud mudelil. LISA-s 2 on 

esitatud Lsc3 mudelite joonised, millel on punasega tähistatud aktiivtsentri katalüütilise kolmiku 

aminohapped ning helerohelisega aminohapped, mille asendused tuvastati üksikmutandis MutB 

ja mitmikmutantides MutA, MutD, MutE, MutF, MutG ning MutH. 

Levaansukraasi katalüütilisi omadusi mõjutas kõige enam asendus His113Gln. Mutantsel valgul 

H113Q oli afiinsus sahharoosile langenud ~10 korda ning K i rafinoosile oli tõusnud ~5 korda. 

Lisaks oli tugevalt langenud ka maksimaalne reaktsioonikiirus (~12 korda) ja polümeriseeriv 

aktiivsus (73%-lt 43%-ni), katalüüsi efektiivsus k cat /K m vähenes 100 korda. Valgu termostabiilsus 

jäi siiski sarnaseks muteerimata Lsc3-ga (Joonis 10). Meie tulemused näitavad, et His113 on 

oluline aminohape nii substraatide sidumisel kui ka katalüüsis. 24 levaansukraasi järjestuste 

konserveerumise analüüsi kohaselt on His113 väga konserveerunud (KA 8; Joonis 11; LISA 1). 

Samas ei ole ta täielikult konserveerunud ning näiteks LevU valgus on selles kohas asparagiin ja 

SacB valgus alaniin (LISA 1). Ennustatud 3D mudelil paikneb His113 aktiivtsentri lähedal, β- 

propelleri I β-lehe 2. ja 3. β-ahela vahelisel lühikesel α-heeliksil (Joonis 11) ning tema kõrvalahel 

on suunatud aktiivtsentri poole. 

Joonis 11. His113 paiknemine Lsc3 

valgu ennustatud 3D mudelil. Kasutati 

ModBase programmi (Pieper et al., 

2009), aluseks võeti LsdA valgu 

struktuur (PDB ID: 1W18). Punasega 

on tähistatud Lsc3 valgu katalüütilise 

kolmiku aminohapped (Asp62, Asp219, 

Glu303), rohelisega on tähistatud 

His113. Valgupiirkonnad on värvitud 

vastavalt ConSurf 

(http://consurf.tau.ac.il) programmiga 

leitud konserveerumisastmete järgi. 

Mudeli avamiseks ja visualiseemiseks 

on kasutatud programmi PyMOL 

(DeLano, 2002). 

Histidiini asendamine glutamiiniga mõjutab selles piirkonnas valgu laengut, sest positiivse 

külgahelaga aminohape asendub mutandis laenguta glutamiiniga. B. subtilis’e levaansukraasis on 

His113-ga homoloogilises positsioonis Ala116. Rafinoosiga kompleksis oleva SacB 

44

kristallstruktuuri andmetel on Ala116 vee molekuli kaudu seotud rafinoosi molekuli galaktoosi 

jäägiga (Meng ja Fütterer, 2008). Kuna galaktoosi jääk seostub +2 alapiirkonnas, siis võiks 

arvata, et ka Lsc3 valgus on His113 seotud substraadi seostumistasku +1 või +2 piirkonnas 

paikneva suhkrujäägi fikseerimisega. Substraadi seondumine +1 või +2 piirkonda on oluline ka 

levaaniahela hüdrolüüsil. Mutant His113Gln hüdrolüüsis levaani 4 korda halvemini kui 

metsiktüüpi valk. Kirjanduse andmete kohaselt pole varem katseliselt näidatud His113 vastava 

positsiooni olulisust levaansukraaside katalüüsis. 

Meie poolt analüüsitud mutantide hulgas oli kaks mutanti, T41I ja D31N, millel aminohappe 

asendus oli toimunud valgu N-terminaalses osas. Thr41 positsiooni konserveerumise tase 

levaansukraasides on keskmine (KA 5). Ta asub ennustatult Lsc3 valgu pinnal, kohe pärast 

ennustatud 10 ah pikkust N-terminaalset α-heeliksit, mis sisaldab ka aminohapet Asp31. 

Mutandis Thr41Ile vahetub polaarne treoniin hüdrofoobse isoleutsiini vastu. Kuigi Thr41 asub 

aktiivtsentrist suhteliselt kaugel (Joonis 12), on Thr41Ile mutandil langenud afiinsus nii 

sahharoosile kui ka rafinoosile ning katalüütiline efektiivsus vähenenud ~2 korda. Mutatsioon 

Asp31Asn suurendas vähesel määral Lsc3 valgu afiinsust sahharoosile. Asp31 asub N- 

terminaalsel α-heeliksil, levaansukraaside konserveerunud motiivis RADAL (LISA 1), kuid ta 

paikneb mudelil aktiivtsentrist kaugel (Joonis 12). Olulisi erinevusi kineetilistes näitajates 

mutandil Asp31Asn võrreldes muteerimata ensüümiga me ei näinud. 

Joonis 12. Asp31 ja Thr41 

paiknemine Lsc3 valgu ennustatud 

3D mudelil. Punasega on tähistatud 

katalüütilise kolmiku aminohapped 

Asp62, Asp219 ja Glu303. 

Rohelisega on tähistatud Asp31 ja 

Thr41. Täiendav informatsioon on 

esitatud joonise 11 allkirjas. 

Mõlemad N-terminaalsete mutatsioonidega mutandid olid muutunud väga termolabiilseks (vt. pt. 

2.3.7; Joonis 10), mis näitab, et levaansukraaside N-terminaalsed piirkonnad on olulised 

levaansukraasi struktuuri püsimiseks. Struktuurimuutusele neil mutantidel viitab ka see, et 

45

natiivses polüakrüülamiidgeelis liiguvad Asp31Asn ja Thr41Ile valgud erinevalt teistest 

mutantidest ja metsiktüüpi valgust (Joonis 13). 

Joonis 13. Puhastatud levaansukraasi valkude 

elektroforees natiivses polüakrüülamiidgeelis. 

Rajale 1 on kantud metsiktüüpi Lsc3, radadel 2- 

7 on Lsc3 mutandid D31N, T41I, H113Q, 

D300N, T302M ja T302P. Paneelil A on geel 

värvitud Coomassie Brilliant Blue G250-ga ja 

paneelil B on valgud ilmutatud levaani sünteesi 

järgi, inkubeerides geele 10% sahharoosi 

lahuses. Valke kanti rajale 1.5 μg. 

Levaansukraasidel ei ole seni palju tehtud N-terminaalsete aminohapete mutatsioonanalüüsi. 

Uuritud on nukleofiiliks oleva aminohappe (Lsc3 puhul Asp62) asendusi ning selle aminohappe 

lähiümbrust. Nukleofiili muteerimisel kaob levaansukraasidel katalüüsivõime (Meng ja Fütterer, 

2003; Martinez-Fleitez et al., 2005; vt. ka Tabel 1). Ka siis, kui asendada nukleofiili kõrval olev 

trüptofaan (uuritud Z. mobilis’e LevU valgu puhul) kas asparagiini või histidiiniga, väheneb väga 

tugevasti (~30 korda) katalüütiline aktiivsus. Neil mutantidel on tugevasti langenud FOS-ide 

süntees. Vastavad mutandid levaani suudavad sünteesida madalal temperatuuril +4°C, kuid mitte 

temperatuuril +15°C (Li et al., 2011). Vastavalt kirjandusele on ka levaansukraaside C- 

terminaalsete piirkondade aminohapete asendused toonud kaasa valkude stabiilsuse languse. 

Näiteks kui SacB valgus asendati Gly361 Phe-ga, siis muutus valk väga ebastabiilseks (Ortiz- 

Soto et al., 2008). See näitab, et levanaasukraaside N- ja C-terminaalsed piirkonnad on olulised 

valgu stabiilsuse säilitamiseks. 

Lsc3 aminohapped Asp300 ja Thr302, mis on asendunud mutantides D300N, T302P ning 

T302M, kuuluvad levaansukraaside konserveerunud piirkonda D(Q/E)(T/I/V)E cat RP, milles 

paikneb ka alus-hape katalüüsija E cat . Neil aminohapetel on ka kõrged konserveerumise skoorid – 

mõlema puhul 8 (LISA 1). Kuigi Asp300 asub Lsc3 valgus ennustatud alus-hape katalüüsija 

Glu303 vahetus läheduses, on Asp300 kõrvalahel mudelil pööratud aktiivtsentrist väljapoole, III 

ja IV β-propelleri laba vahelisse piirkonda (Joonis 14). 

46

Joonis 14. Asp300 ja Thr302 paiknemine 

Lsc3 valgu ennustatud 3D mudelil. Punasega 

on tähistatud katalüütilise kolmiku 

aminohapped Asp62, Asp219 ja Glu303. 

Rohelised on Asp300 ja Thr302. Täiendav 

informatsioon on esitatud joonise 11 

allkirjas. 

Mutandil Asp300Asn on katalüütiline efektiivsus langenud ligi neli korda (vt. Tabel 6). Seda võib 

põhjustada negatiivse laenguga aminohappe (aspartaadi) vahetus laenguta aminohappega 

(asparagiiniga) selles nii konserveerunud piirkonnas 

(https://sites.google.com/site/12karin28/joondus). Mutant sünteesib levaani nii sahharoosist kui 

ka rafinoosist aeglasemalt kui muteerimata Lsc3 (Joonis 8), samas on võimeline tootma pika 

ahelaga fruktaane ja levaani isegi rohkem kui muteerimata Lsc3. 

Yanase ja kolleegid (2002) muteerisid koht-spetsiifiliselt Z. mobilis’e levaansukraasis LevU 

Asp300-le homoloogilises positsioonis oleva Asp275 asparagiiniks ja leidsid, et nii muteeritud 

valgu afiinsus sahharoosile kui ka k cat /K m olid ligi 3x langenud. Seega käitub Lsc3 vastav mutant 

sarnaselt LevU vastava mutandiga. Huvitav on ka see, et Asp300 positsioonile B. subtilis’e 

levaansukraasis vastab aspartaat, mille kaudu Ca 2+ -iooni vahendusel stabiliseeritakse valgu 

struktuuri (Meng ja Fütterer, 2003). Asp300 võib olla oluline valgu struktuuri hoidmises, sest 

mutant Asp300Asn on kindlasti vähem termostabiilne kui metsiktüüpi Lsc3 (Joonis 10). 

Mutandi Thr302Pro katalüütilised näitajad olid võrreldes muteerimata valguga oluliselt 

muutunud: alanenud oli afiinsus substraatidele, katalüüsi maksimaalkiirus ning 

polümeriseerimisaktiivsus (viimane langes 74%-lt 47%-le). Meie andmetel on sellel mutandil 

väga tugevalt langenud nii levaani kui ka pikema ahelaga fruktooligosahhariidide süntees 

(Joonised 7 ja 8; Tabel 7). Seega tundub, et Thr302 on oluline just pikemate fruktaaniahelate 

sünteesiks. Treoniini asendamine proliiniga võiks muuta ka valgu struktuuri. Samas hüdrofiilse 

Thr302 asendamine hüdrofoobse aminohappega – metioniiniga – ei mõjutanud oluliselt 

levaansukraasi kineetilisi parameetreid. Siiski, Thr302Met mutandil oli afiinsus sahharoosile 

veidi tõusnud. Thr302Met asendus tehti selleks, et muuta Lsc3 selles piirkonnas sarnaseks Z. 

47

mobilis’e invertaasile. Invertaaside afiinsus sahharoosile on tavaliselt kõrgem kui 

levaansukraasidel. Nii on näiteks Z. mobilis’e invertaasi K m sahharoosile 86 mM, levaansukraasil 

aga 125 mM (Sangiliyandi ja Gunasekaran, 2000; Yanase et al., 2002). B. subtilis’e 

levaansukraasis kuuluvad D(Q/E)(T/I/V)ERP motiivi aminohapped Glu340 ja Glu342 substraadi 

sidumise tasku +1 alapiirkonda (Meng ja Fütterer, 2008; Lammens et al., 2009). Oletame, et ka 

Thr302 võiks kuuluda Lsc3 substraaditasku +1 alapiirkonda. 

Üksikmutandina kloonist MutB leitud Lsc3 variant Q269R selekteeriti vähenenud limatootmise 

järgi. Gln269 asub ennustuse järgi aktiivtsentri suudme lähedal valgu pinnal, propelleri III laba β- 

ahelate vahelise lingul, olles suhteliselt konserveerunud aminohape (KA 5). Mutandil on 

neutraalset laengut omava kõrvalahelaga glutamiin asendunud positiivselt laetud arginiiniga. 

Sellel mutandil oli umbes kaks korda vähenenud levaansukraasi maksimaalne reaktsioonikiirus 

ning ka levaani süntees oli poole aeglasem (Tabel 5 ja Joonis 9). 

Cys371 asendus trüptofaaniga (C371W; mutatsioon esines mitmikmutandis MutG) ei muutnud 

oluliselt levaansukraasireaktsiooni kineetikat. Ainsaks tuvastatud erinevuseks oli umbes 

kolmandiku võrra alanenud levaani sünteesi võime mutandil (Joonis 9). Asendades suhteliselt 

konserveerunud (KA 5) ja lineaarse kõrvalahelaga tsüsteiini hoopis suurema aromaatset tuuma 

sisaldava trüptofaaniga võiks eeldada konformatsioolisi muutusi. Cys371 asub ennustuse järgi 

valgu aktiivtsentri põhjas, propelleri viiendal labal vahetult enne sisemist -lehte (LISA-s 2 

oleval joonisel vt. mitmikmutanti MutG). Seega võib arvata, et valgu aktiivtsentri põhjas on 

piisavalt ruumi, et sinna mahub ka trüptofaani suur kõrvalahel. Ekvivalentset positsiooni 

(Phe414) on muteeritud ka B. subtilis’e levaansukraasis. Mutant Phe414Trp ei erinenud oluliselt 

metsiktüüpi valgust (Ortiz-Soto et al., 2008). Arvame, et asendus Cys371Trp Lsc3 valgus ei saa 

üksinda põhjustada levaani sünteesi puudumist kolmikmutandis MutG. 

48

KOKKUVÕTE JA JÄRELDUSED 

Levaansukraasid on bakteriaalsed ekstratsellulaarsed fruktosüüli transferaasid, mille katalüüsi 

struktuursed määratlejad ei ole täielikult teada. Näiteks on siiani ebaselge, millised aminohapped 

määravad ära substraadispetsiifika, sünteesitavate produktide pikkuse ja sidemetüübi. 

Levaansukraasi mutantide kirjeldamine annab võimaluse vastata neile küsimustele. Kuna 

levaansukraaside abil saaks suhteliselt odavast substraadist – sahharoosist ja melassidest – 

sünteesida bioloogilise aktiivsusega produkte, on neil uuringutel ka praktiline väärtus. 

Põhjalikumat mutatsioonanalüüsi on tehtud kolmel levaansukraasil – B. subtilis’e, B. 

megaterium’i ja Z. mobilis’e ensüümidel. P. syringae patovaridel on aga peamiselt uuritud 

levaansukraaside seost taimepatogeneesiga, samas on nende ensüümide biokeemiat vähe uuritud. 

Selles töös alustasime P. syringae pv. tomato DC3000 Lsc3 valgu struktuuri ja funktsiooni 

vaheliste seoste uurimisega. Isoleerisime Lsc3 valgu juhuslikke mutante, milles oli asendunud 

kas üks või mitu aminohapet. Mitmikmutantide hulgast valisime välja mõned asendused, mis 

viisime ühekaupa koht-suunatult lsc3 geeni, saades nii kümme uut Lsc3 valgu mutantset varianti. 

Mutantsed valgud sünteesiti E. coli’s N-terminaalse His 6 järjestusega, kasutades 

ekspressiooniplasmiidi pURI3, neist kuus valku puhastati Ni 2+ -afiinsuskromatograafiaga. Nelja 

mutantset valku iseloomustati kasutades preparaadina bakteri rakulüsaati. Levaansukraasidel 

uuriti koguaktiivsust, substraadispetsiifikat, üldist polümeriseerimisvõimet, sünteesitavate 

fruktaanide spektrit, levaani sünteesi ja valkude termostabiilsust. Et ennustada mutantsetes Lsc3 

valkudes asendunud aminohapete paiknemist, tehti Lsc3 valgu 3D mudel, võttes aluseks G. 

diazotrophicus’e LsdA kristallstruktuuri. 

Töö põhitulemused olid järgmised: 

1. Kõige enam mõjutas Lsc3 katalüütilisi omadusi His113 asendumine valgus. His113Gln 

mutandi polümeriseeriv aktiivsus alanes 30% võrra ning katalüüsi efektiivsus k cat /K m 

langes 100 korda. His113 paikneb Lsc3 valgu modelleerimise alusel katalüütilise kolmiku 

aminohapete lähedal. Ennustame, et His113 võiks osaleda substraadi sidumises 

aktiivtsentri +1 või +2 alapiirkondadesse; 

2. N-terminaalsed mutatsioonid (Asp31Asn ja Thr41Ile) muutsid Lsc3 valgu 

termolabiilseks, kuid ei mõjutanud oluliselt ensüümi katalüütilisi omadusi. Mõlemad 

49

aminohapped asuvad ennustuse kohaselt aktiivtsentrist eemal ja on arvatavasti olulised 

valgu struktuuri säilitamisel; 

3. Asp300 ja Thr302 asuvad Lsc3 valgus regioonis D(Q/E)(T/I/V)ERP, mis on 

levaansukraasides väga konserveerunud. Näitasime, et asendus Asp300Asn põhjustab 

katalüüsi efektiivsuse neljakordset langust, alaneb levaani sünteesi kiirus ning valgu 

termostabiilsus. Thr302Pro asendus Lsc3 valgus alandab tema afiinsust substraatidele, 

katalüüsi maksimaalkiirust ja polümeriseemisaktiivsust. Mutandil Thr302Pro on oluliselt 

langenud nii levaani kui ka pika ahelaga fruktooligosahhariidide süntees. Ennustame, et 

Thr302 võiks kuuluda Lsc3 valgu substraadi sidumise tasku +1 alapiirkonda ja osaleb 

kindlasti pika ahelaga fruktaanide sünteesil; 

4. His113 ja Thr302 positsioonidele vastavate aminohapete olulisust levaansukraaside 

katalüüsis ei ole varem näidatud; 

5. Töös välja töötatud mutageneesi ja selekteerimise meetod sobib levaansukraasi juhuslike 

mutantide isoleerimiseks. Edaspidi soovime kasutada lühemaid mutageeniga töötlemise 

aegu, et tekiks vähem mitmikmutante. 

50

Structure modelling and mutational analysis of the Pseudomonas syringae pv. 

tomato levansucrase Lsc3 

Karin Mardo 

SUMMARY 

Levansucrases are very stable bacterial exoenzymes belonging to fructosyltransferases. Their 

catalytic and structural properties are not fully understood. It is still unknown which amino acids 

of these proteins determine substrate specificity, product length and type of glycosidic bond to be 

synthesized. Levansucrase mutants provide an opportunity to identify these determinants. 

Levansucrases can use relatively cheap substrates (sucrose and molasses) to synthesize 

biologically active products, thereby providing practical value for the research. So far mutation 

analysis has been done for three well-described levansucrases originating from Bacillus subtilis, 

B. megaterium, Gluconacetobacter diazotrophicus and Zymomonas mobilis. Our research interest 

is Lsc3 protein from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. 

In this work we started structure-function analysis of the Lsc3 protein. As a result of chemical 

mutagenesis of lsc3-expressing E. coli and following screening procedure, we isolated several 

mutants with substitutions of one or more amino acids. Some of these multiple substitutions were 

singly introduced into Lsc3 protein. Finally, we obtained ten single amino acid substitution 

mutants of Lsc3 protein. These proteins were overexpressed in E. coli with N-terminal His 6 -tag. 

Six mutant proteins were purified using Ni 2+ -affinity chromatography and four mutant proteins 

were characterized using bacterial cell-lysates. We investigated total levansucrase activity, 

substrate specificity, polymerizing acitvity, spectrum of produced fructans, kinetics of levan 

synthesis and thermostability of the proteins. 3D model of Lsc3 protein was predicted using G. 

diazotrophicus levansucrase crystal structure for a template in order to interprete phenotype of 

Lsc3 mutants. 

Our main results are following: 

1. The method applied in this work is suitable to obtain random mutants of Lsc3 protein. In 

further experiments we recommend to use shorter mution time to reduce isolation of 

mutants with multiple subtitutions; 

51

2. Histidine substitution with glutamine at position 113 reduced catalytic activity of Lsc3 

protein most drastically. Polymerizing activity of this mutant enzyme decreased about 

30% and catalytic efficiency about 100 times. We hypothesize that His113 is involved in 

substrate binding at subsites +1 or +2; 

3. N-teminal substitutions (Asp31Asn and Thr41Ile) affected thermostability of the 

levansucrase, but had almost no effect on catalysis. These residues were predicted to 

locate far from the active site and maintain protein structure; 

4. Asp300 and Thr302 of Lsc3 locate at positions that are highly conserved in levansucrases. 

We showed that Asp300Asn substitution reduced catalytic efficiency of Lsc3 four fold, 

decreased the rate of levan synthesis and reduced thermostability of the protein. The 

Thr302Pro substitution also reduced affinity of Lsc3 for sucrose, as well as its maximum 

velocity and polymerizing activity. Thr302Pro mutant was specifically hampered in 

synthesis of levan and long-chain oligofructans. We suggest that Thr302 belongs to +1 

subsite of Lsc3 substrate binding pocket and is specifically important for synthesis of 

levan and long-chain FOS; 

5. Importance of positions equivalent to His113 and Thr302 of Lsc3 for catalysis of 

levansucrases is described for the first time. 

52

KASUTATUD MATERJALID 

Alegre, R. M., Wendt, R., Rigo, M. (2005). Levan production by isolated mutants of Zymomonas 

mobilis. Rev. Cienc. Exact. Nat. 7: 103-112 

Altenbach, D., Nuesch, E., Meyer, A. D., Boller, T., Wiemken, A. (2004). The large subunit 

determines catalytic specificity of barley sucrose: fructan 6-fructosyltransferase and fescue 

sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase. FEBS Lett. 567: 214-218 

Ammar, Y. B., Matsubara, T., Ito, K., Iizuka, M., Limpaseni, T., Pongsawasdi, P., Minamiura, N. 

(2002). Characterization of a thermostable levansucrase from Bacillus sp. TH4-2 capable of 

producing high molecular weight levan at high temperature. J. Biotechnol. 99: 111-119 

Andersone, I., Auzina, L., Vigants, A., Mutere, O., Zikmanis, P. (2004). Formation of levan from 

raffinose by levansucrase of Zymomonas mobilis. Eng. Life Sci. 4: 56-59 

Anwar, M. A., Kralj, S., van der Maarel, M. J. E. C., Dijkhuizen, L. (2008). The probiotic 

Lactobacillus johnsonii NCC 533 produces high molecular-mass inulin from sucrose by using an 

inulosucrase enzyme. Appl. Environ. Microb. 74: 3426-3433 

Anwar, M. A., Kralj, S., Pique, A. V., Leemhuis, H., van der Maarel, M. J. E. C., Dijkhuizen, L. 

(2010). Inulin and levan synthesis by probiotic Lactobacillus gasseri strains: characterization of 

three novel fructansucrase enzymes and their fructan product. Microbiology 156: 1264-1274 

Arrieta, J., Hernández, L., Coego, A., Suárez, V., Balmori, E., Menéndez, C., Petit-Glatron, M.-F., 

Chambert, R., Selman-Housein, G. (1996). Molecular characterization of the levansucrase gene 

from the endophytic sugarcane bacterium Acetobacter diazotrophicus SRT4. Microbiology 142: 

1077-1085 

Aymerich, S. (1990). What is the role of levansucrase in Bacillus subtilis? Symbiosis 9: 179-184 

Batista, F. R., Hernandez, L., Fernandez, J. R., Arrieta, J., Menendez, C., Comez, R., Tambara, Y., 

Pons, T. (1999). Substitution of Asp-309 by Asn in the Arg-Asp-Pro (RDP) motif of Acetobacter 

diazotrophicus levansucrase affects sucrose hydrolysis, but not enzyme specificity. Biochem. J. 

337: 503-506 

Bello, F. D., Walter, J., Hertel, C., Hammes, W. P. (2001). In vitro study of prebiotic properties of 

levan-type exopolysaccharides from Lactobacilli and non-digestible carbohydrates using 

denaturing gradient gel electrophoresis. Syst. Appl. Microbiol. 24: 232-7 

Bereswill, S., Geider, K. (1997). Characterization of the rcsB gene from Erwinia amylovora and 

its influence on exoploysaccharide synthesis and virulence of the fire blight pathogen. J. 

Bacteriol. 179: 1354-1361 

Chambert, R., Treboul, G., Dedonder, R. (1974). Kinetic studies of levansucrase of Bacillus 

subtilis. Eur. J. Biochem. 41: 285-300 

Chambert, R., Petit-Glatron, M.-F. (1991). Polymerase and hydrolase activities of Bacillus 

subtilis levansucrase can be separately modulated by site-directed mutagenesis. Biochem. J. 279: 

35-41 

Chambert, R., Petit-Glatron, M.-F. (1993). Immobilisation of levansucrase on calcium phosphate 

gel strongly increases its polymerase activity. Carbohyd. Res. 244: 129-136 

Chuankhayan, P., Hsieh, C. Y., Huang, Y. C., Hsieh, Y. Y., Guan, H. H., Hsieh, Y. C., Tien, Y. C., 

Chen, C. D., Chiang, C. M., Chen, C. J. (2010). Crystal structures of Aspergillus japonicus 

53

fructosyltransferase complex with donor/acceptor substrates reveal complete subsites in the 

active site for catalysis. J. Biol. Chem. 285: 23251-23264 

Cote, G. L. (1988). Production of a constitutive, extracellular levanusucrase from Erwinia 

herbicola NRRL B-1678. Biotechnol. Lett. 12: 879-882 

Dedonder, R. (1966). Levansucrase from Bacillus subtilis. Method. Enzymol. 8: 500-505 

DeLano, W. L. (2002). The PyMOL molecular graphics system. California, USA: DeLano 

Scientific, San Carlos (http://www.pymol.org) 

Ebisu, S., Kato, K., Kotani, S., Misaki, A. (1975). Structural differences in fructans elaborated by 

Streptococcus mutans and Streptococcus salivarius. J. Biochem. 78: 879-887 

Edelman, J., Jefford, T. G. (1968). The metabolism of fructose polymers in plants. New Phytol. 

67: 517-531 

Edgar, R. C. (2004). MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high 

throughput. Nucleic Acids Res. 32: 1792-1797 

Elmi, T. (2011). Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise tsentri 

aminohapete kindlakstegemine mutatsioonanalüüsiga. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool 

van den Ende, W., van Laere, A. (1996). De-novo synthesis of fructans from sucrose in vitro by a 

combination of two purified enzymes (sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase and fructan:fructan 

1-fructosyltransferase) from chicory roots (Cichorium intybus L.). Planta 200: 335-342 

Euzenat, O., Guibert, A., Combes, D. (1997). Production of fructo-oligosaccharides by 

levansucrase from Bacillus subtilis C4. Process Biochem. 32: 237-243 

Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D., Bairoch, A. 

(2005). Protein identification and analysis tools on the ExPASy server, p. 571-607. In: Walker, J. 

M. (ed), The Proteomics Protocols Handbook. Humana Press, USA 

Geier, G., Geider, K. (1993). Characterization and influence on virulence of levansucrase gene 

from the fireblight pathogene Erwinia amylovora. Physiol. Mol. Plant Pathol. 42: 387-404 

Geiser, M., Cebe, R., Drewello, D., Schmitz, R. (2001). Integration of PCR fragments at any 

specific site within cloning vectors without the use of restriction enzymes and DNA ligase. 

BioTechniques 31: 88-92 

Glaser, F., Pupko, T., Paz, I., Bell, R. E., Bechor, D., Martz, E., Ben-Tal, N. (2003). ConSurf: 

identification of functional regions in proteins by surface-mapping of phylogenetic information. 

Bioinformatics 19: 163-164 

Gunasekaran, P., Mukundan, G., Kannan, T. R, Velmurugan, S., Ait-Abdelkader, N., Alvarez- 

Macarie, E., Baratti, J. (1995). The sacB and sacC genes encoding levansucrase and sucrase form 

a gene cluster in Zymomonas mobilis. Biotehnol. Lett. 17: 635-642 

Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis 

program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41: 95-98 

Han, Y. W. (1990). Production and characterization of microbial levan. J. Agr. Food Chem. 38: 

393-396 

Hernandez, L., Arrieta, J., Menendez, C., Vazquez, R., Coego, A., Suarez, V., Selman, G., Petit- 

Glatron, M.-F., Chambert, R. (1995). Isolation and enzymic properties of levansucrase secreted 

54

y Acetobacter diazotrophicus SRT4, a bacterium associated with sugar cane. Biochem. J. 309: 

113-118 

Hettwer, U., Gross, M., Rudolph, K. (1995). Purification and characterization of an extracellular 

levansucrase from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. J. Bacteriol. 177: 2834-2839 

Hettwer, U., Jaeckel, F. R., Boch, J., Meyer, M., Rudolph, K., Ullrich, M. S. (1998). Cloning, 

nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of levansucrase genes from the plant 

pathogens Pseudomonas syringae pv. glycinea and P. syringae pv. phaseolicola. Appl. Environ. 

Microbiol. 64: 3180-3187 

van Hijum, S. A. F. T., Bonting, K., van der Maarel, M. J. E. C., Dijkhuizen, L. (2001). 

Purification of a novel fructosyltransferase from Lactobacillus reuteri strain 121 and 

characterization of the levan produced. FEMS Microbiol. Lett. 205: 323-328 

van Hijum, S. A. F. T., van Geel-Schutten, G. H., Rahaoui, H., van der Maarel, M. J. E. C., 

Dijkhuizen, L. (2002). Characterization of a novel fructosyltransferase from Lactobacillus reuteri 

that synthesizes high molecular weight inulin and inulin oligosaccharides. Appl. Environ. Microb. 

68: 4390-4398 

van Hijum, S. A. F. T., Szalowska, E., van der Maarel, M. J. E. C., Dijkhuizen, L. (2004). 

Biochemical and molecular characterization of a levansucrase from Lactobacillus reuteri. 

Microbiology 150: 621-630 

van Hijum, S. A. F. T., Kralj, S., Ozimek, L. K., Dijkhuizen, L., van Geel-Schutten, I. G. H. 

(2006). Structure-function relationships of glucansucrase and fructansucrase enzymes from lactic 

acid bacteria. Microbiol. Mol. Biol. R. 70: 157-176 

Homann, A., Biedendieck, R., Gotze, S., Jahn, D., Seibel, J. (2007). Insights into polymer versus 

oligosaccharide synthesis: mutagenesis and mechanistic studies of a novel levansucrase from 

Bacillus megaterium. Biochem. J. 407: 189-198 

Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli 

with plasmids. Gene 96: 23-28 

Jang, K.-H., Kang, S.-A., Kim, C.-H., Lee, J.-C., Kim, M.-H., Son, E.-W., Rhee, S.-K. (2007). 

Characterization of levan hydrolysis activity of levansucrase from Zymomonas mobilis ATCC 

10988 and Rahnella aquatilis ATCC 33071. Food Sci. Biotechnol. 16: 482-484 

Kallas, E. (2010). IHF-i osalus Pseudomonas aeruginosa mobiilse elemendi ISPa20 

transpositsioonis. Magistritöö, Tartu Ülikool 

Kamal, F., Mehrgan, H., Assadi, M. M., Mortazavi, S. A. (2003). Mutagenesis of Xanthomonas 

campestris and selection of strains with enhanced xanthan production. Iran Biomed. J. 7: 91-98 

Kannan, T. R., Sangiliyandi, G., Gunasekaran, P. (1998). Improved ethanol production from 

sucrose by a mutant of Zymomonas mobilis lacking sucrases in immobilized cell fermentation. 

Enzyme Microb. Tech. 22: 179-184 

Kyono, K., Yanase, H., Tonomura, K., Kawasaki, H., Sakai, T. (1995). Cloning and 

characterization of Zymomonas mobilis genes encoding extracellular levansucrase and invertase. 

Biosci. Biotech. Bioch. 59: 289-293 

Lammens, W., Le Roy, K., Schroeven, L., van Laere, A., Rabijns, A., van den Ende, W. (2009). 

Structural insights into glycoside hydrolase family 32 and 68 enzymes: functional implications. J. 

Exp. Bot. 60: 727-740 

55

Landau, M., Mayrose, I., Rosenberg, Y., Glaser, F., Martz, E., Pupko, T., Ben-Tal, N. (2005). 

ConSurf 2005: the projection of evolutionary conservation scores of residues on protein 

structures. Nucleic Acids Res. 33: 299-302 

Lasch, L.1987. Enzymkinetik. Eine Einführung für Biochemiker, Mediziner, Biologen, Chemiker 

und Pharmazeuten. In: Springer-Verlag, Berlin, Saksamaa 

Lepasant, J. A., Lepasant-Kejzlarova, J., Pascal, M., Kunst, F., Billault, A., Dedonder, R. (1974). 

Identification of the structural gene of levansucrase in Bacillus subtilis Marburg. Mol. Gen. 

Genet. 128: 213-221 

Li, H., Schenk, A., Srivastava, A., Zhurina, D., Ullrich, M. S. (2006). Thermo-responsive 

expression and differential secretion of the extracellular enzyme levansucrase in the plant 

pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. glycinea. FEMS Microbiol. Lett. 265: 178-185 

Li, S. Y., Chen, M., Li, G., Yan, Y. L., Yu, H. Y., Zhan, Y. H., Peng, Z. X., Wang, J., Lin, M. 

(2008). Amino acid substitutions of His296 alter the catalytic properties of Zymomonas mobilis 

10232 levansucrase. Acta Biochim. Pol. 55: 201-206 

Li, S., Yan, Y., Zhou, Z., Yu, H., Zhan, Y., Zhang, W., Chen, M., Lu, W., Ping, S., Lin, M. (2011). 

Single amino acid residue changes in subsite -1 of levansucrase from Zymomonas mobilis 10232 

strongly influence the enzyme activities and products. Mol. Biol. Rep. 38: 2437-2443 

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the 

Folin-Phenol reagents. J. Biol. Chem. 193: 265-275 

Mardo, K. (2009). Pseudomonas syringae levaansukraasi mutageniseerimine: mutantide 

selektsioon ja iseloomustamine. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool 

Mardo, K., Visnapuu, T., Alamäe, T. (2010). Isolation and high-throughput screening methods of 

levansucrase mutants of a plant pathogen Pseudomonas syringae DC3000, p. 36-39. In: 

Proceedings of the 6th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Praha, Tšehhi 

Vabariik 

Martinez-Fleites, C., Ortiz-Lombardia, M., Pons, T., Tarbouriech, N., Taylor, E. J., Arrieta, J. G., 

Hernandez, L., Davies, G. J. (2005). Crystal structure of levansucrase from the Gram-negative 

bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus. Biochem. J. 390: 19-27 

McIlvaine, T. C. (1921). A buffer solution for colorimetric comparison. J. Biol. Chem. 49: 183- 

186 

Meng, G., Fütterer, K. (2003). Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis 

levansucrase. Nat. Struct. Biol. 10: 935-941 

Meng, G., Fütterer, K. (2008). Donor substrate recognition in the raffinose-bound E342A mutant 

of fructosyltransferase Bacillus subtilis levansucrase. BMC Struct. Biol. 8: 16-28 

Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. 

Anal. Chem. 31: 426-428 

Miller, J. H. (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold 

Spring Harbour, NY. 

Morales-Arrieta, S., Rodríguez, M. E., Segovia, L., López-Munguía, A., Olvera-Carranza, C. 

(2006). Identification and functional characterization of levS, a gene encoding for a levansucrase 

from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F. Gene 376: 59-67 

56

Olivares-Illana, V., Wacher-Rodarte, C., Le Borgne, S., López-Munguía, A. (2002). 

Characterization of a cell-associated inulosucrase from a novel source: a Leuconostoc citreum 

strain isolated from Pozol, a fermented corn beverage from Mayan origin. J. Ind. Microbiol. 

Biotechnol. 28: 112-117 

Olivares-Illana, V., López-Munguía, A., Olvera, C. (2003). Molecular characterization of 

inulosucrase from Leuconostoc citreum: a fructosyltransferase within a glucosyltransferase. J. 

Bacteriol. 185: 3606-3612 

Ortiz-Soto, M. E., Rivera, M., Rudiño-Piñera, E., Olvera, C., López-Munguía, A. (2008). 

Selected mutations in Bacillus subtilis levansucrase semi-conserved regions affecting its 

biochemical properties. Protein Eng. Des. Sel. 21:589-95 

Ozimek, L. K., Euverink, G. J. W., van der Maarel, M. J. E. C., Dijkhuizen, L. (2005). Mutational 

analysis of the role of calcium ions in the Lactobacillus reuteri strain 121 fructosyltransferase 

(levansucrase and inulosucrase) enzymes. FEBS Lett. 579: 1124-1128 

Ozimek, L. K., Kralj, S., van der Maarel, M. J. E. C., Dijkhuizen, L. (2006). The levansucrase 

and inulosucrase enzymes of Lactobacillus reuteri 121 catalyse processive and non-processive 

transglycosylation reactions. Microbiology 152: 1187-1196 

Pieper, U., Eswar, N., Webb, B. M., Eramian, D., Kelly, L., Barkan, D. T., Carter, H., Mankoo, P., 

Karchin, R., Marti-Renom, M. A., Davis, F. P., Sali, A. (2009). MODBASE, a database of 

annotated comparative protein structure models and associated resources. Nucleic Acids Res. 37: 

347-354 

Rairakhwada, D., Seo, J.-W., Seo, M.-Y., Kwon, O., Rhee, S.-K., Kim, C. H. (2010). Gene 

cloning, characterization, and heterologous expression of levansucrase from Bacillus 

amyloliquefaciens. J. Ind. Microbiol. Biot. 37: 195-204 

de las Rivas, B., Curiel, J. A., Mancheño, J. M., Muñoz, R. (2007). Expression vectors for 

enzyme restriction- and ligation-independent cloning for producing recombinant His-fusion 

proteins. Biotechnol. Progr. 23: 680-686 

Rosell, K. G., Birkhed, D. (1974). An inulin-like fructan produced by Streptococcus mutans strain 

JC2. Acta Chem. Scand. 28: 589 

Rotblat, F., O’Brien, D. P., O’Brien, F. J., Goodall, A. H., Tuddenhamt, E. G. D. (1985). 

Purification of human factor VII1:C and its characterization by western blotting using 

monoclonal antibodies. Biochemistry 24: 4294-4300 

Sambrook, J., Fritsch, E. T., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold 

Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 

Sangiliyandi, G., Ray, K. C., Gunasekaran, P. (1999). Elevated temperature and chemical 

modification selectively abolishes levan forming activity of levansucrase of Zymomonas mobilis. 

Biotechnol. Lett. 21: 179-182 

Sangiliyandi, G., Gunasekaran, P. (2000). A simple method for the purification of over-expressed 

extracellular sucrase of Zymomonas mobilis from a recombinant Escherichia coli. Biotechol. 

Lett. 22: 1059-1062 

Schwab, C., Walter, J., Tannock, G. W., Vogel, R. F., Ganzle, M. G. (2007). Sucrose utilization 

and impact of sucrose on glycosyltransferase expression in Lactobacillus reuteri. Syst. Appl. 

Microbiol. 30: 433-443 

57

Schägger, H. (2006). Tricine-SDS-PAGE. Nat. Protoc. 1: 16-22 

Seibel, J., Moraru, R., Götze, S., Buchholz, K., Na'amnieh, S., Pawlowski, A., Hecht, H. J. 

(2006). Synthesis of sucrose analogues and the mechanism of action of Bacillus subtilis 

fructosyltransferase (levansucrase). Carbohyd. Res. 341: 2335-2349 

Senthikumar, V., Bushby, S. J. W., Gunasekaran, P. (2003). Serine substitution for cysteine 

residues in levansucrase selectively abolishes levan forming activity. Biotechnol. Lett. 25: 1653- 

1656 

Seymour, F., Knapp, R., Jeans, A. (1979). Structural analysis of levans by use of 13 C-nuclear 

magnetic resonance spectroscopy. Carbohyd. Res. 72: 222-228 

Sharma, R. C., Schimke, R. T., (1996). Preparation of electro-competent E. coli using saltfree 

growth medium. BioTechniques 20: 42-44 

St. John, J. A., Bonnett, G. D., Simpson, R. J. (1996). A method for rapid quantification of 

sucrose and fructan oligosaccharides suitable for enzyme and physiological studies. New Phytol. 

134: 197-203 

Studier, F. W., Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct 

selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189: 113-130 

Strube, C. P., Homann, A., Gamer, M., Jahn, D., Seibel, J., Heinz, D. W. (2011). Polysaccharide 

synthesis of the levansucrase SacB from Bacillus megaterium is controlled by distinct surface 

motifs. J. Biol. Chem. 286: 17593-17600 

Tajima, K., Tanio, T., Kobayashi, Y., Kohno, H., Fujiwara, M., Shiba, T., Erata, T., Munekata, M., 

Takai, M. (2000). Cloning and sequencing of the levansucrase gene from Acetobacter xylinum 

NCI 1005. DNA Res. 7: 237-242 

Tateyama, I., Hashii, K., Johno, I., Iino, T., Hirai, K., Suwa, Y., Kiso, Y. (2005). Effect of 

xylooligosaccharide intake on severe constipation in pregnant women. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 5: 

445-448 

Tieking, M., Ehrmann M. A., Vogel, R. F., Gänzle, M. G. (2005). Molecular and functional 

characterization of a levansucrase from the sourdough isolate Lactobacillus sanfranciscensis 

TMW 1.392. Appl. Microbiol. Biot. 66: 655-663 

Tiirik, K. (2010). Levaansukraasi katalüüsis osalevate aminohapete kindlakstegemine Asp219 ja 

Asp225 muteerimisega. Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool 

Toomemaa, R. (2007). Pseudomonas syringae pv. tomato levaansukraaside omaduste uurimine. 

Bakalaureusetöö, Tartu Ülikool 

Trujillo, L. E., Gomez, R., Banguela, A., Soto, M., Arrieta, J. G., Hernández, L. (2004). 

Catalytical properties of N-glycosylated Gluconacetobacter diazotrophicus levansucrase 

produced in yeast. Electron. J. Biotechnol. 7: 116-123 

Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi geenide ekspresseerimine E. coli’s ja valkude omaduste 

uurimine. Magistritöö, Tartu Ülikool 

Visnapuu, T., Mäe, A., Alamäe, T. (2008). Hansenula polymorpha maltase gene promoter with 

sigma 70-like elements is feasible for Escherichia coli-based biotechnological applications: 

Expression of three genomic levansucrase genes of Pseudomonas syringae pv. tomato. Process 

Biochem. 43: 414-422 

58

Visnapuu, T., Zamfir, A. D., Mosoarca, C., Stanescu, M. D., Alamäe, T. (2009). Fully automated 

chip-based negative mode nanoelectrospray mass spectrometry of fructooligosaccharides 

produced by heterologously expressed levansucrase from Pseudomonas syringae pv. tomato 

DC3000. Rapid Commun. Mass Spectrom. 23: 1337-1346 

Wada, T., Ohguchi, M., Iwai, Y. (2003). A novel enzyme of Bacillus sp. 217C-11 that produces 

inulin from sucrose. Biosci. Biotech. Bioch. 67: 1327-1334 

Wei, D., Li, M., Zhang, X., Xing, L. (2004). An improvement of the site-directed mutagenesis 

method by combination of megaprimer, one-side PCR and Dpn I treatment. Anal. Biochem. 331: 

401-403 

Yanase, H., Maeda, M., Hagiwara, E., Yagi, H., Taniguchi, K., Okamoto, K. (2002). 

Identification of functionally important amino acid residues in Zymomonas mobilis levansucrase. 

J. Biochem. 132: 565-572 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID 

http://consurf.tau.ac.il/ 

http://expasy.org/tools/pi_tool.html 

http://www.acaclone.com/ 

http://www.cazy.org 

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ 

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html 

https://sites.google.com/site/12karin28/joondus 

http://www.microsynth.ch 

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ 

59

LISA 1 

Levaansukraasi valkude aminohappeliste järjestuste joondus. Gluconacetobacter diazotrophicus 

(Gd LsdA; ah 75-544; kokku 584 ah), Zymomonas mobilis (Zm LevU; ah 5-404; kokku 423 ah), 

Bacillus subtilis (Bs SacB; ah 34-473; kokku 473 ah) ja Pseudomonas syringae (Ps Lsc3; ah 19- 

427; kokku 431 ah). Rohelisega on tähistatud keemilise muteerimise tulemusena saadud 

mutatsioonid ja vastava aminohappe konserveerumise aste, punasega on tähistatud ennustatud 

katalüütilise kolmiku aminohapped. Joonduse visualiseerimisel on kasutatud programmi BioEdit 

(Hall, 1999). Joonduse viimane rida (KA) tähistab aminohapete konserveerumise astet (1-9)* 

levaansukraasides. 

130 140 150 160 170 180 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA ------QAYDPQSDFTARWTRADALQIKAHSDATVAAGQNSLPAQLTMPNIPADFPVINP 129 

Zm LevU ------GIAEPSL-----WTRADAMKVHTDDPTA------------TMPTIDYDFPVMTD 42 

Bs SacB ------KPYKETYGISH-ITRHDMLQIPEQQKNE----------KYQVPEFDSSTIKNIS 77 

Ps Lsc3 ------IKYPPTV-----WSRADALKVNENDPTT------------TQPLVSADFPVMSD 56 

KA ------1111311-----7898685685445354------------76916214554344 

D31N T41I 

190 200 210 220 230 240 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA D------------VWVWDTWTLIDKHADQFSYNGWEVIFCLTADPNAG------------ 165 

Zm LevU K------------YWVWDTWPLRDINGQVVSFQGWSVIFALVADRT-------------- 76 

Bs SacB SAKG---------LDVWDSWPLQNADGTVANYHGYHIVFALAGDPK-------------- 114 

Ps Lsc3 T------------VFIWDTMPLRELDGTVVSVNGWSVIITLTADRHPDDPQYLGPDGRYD 104 

KA 2------------75789985973367246673974767798977351353312127378 

D62 

250 260 270 280 290 300 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA --YGFDDRHVHARIGFFYRRAGIPASR----RPVNGGWTYGGHLFPDGASAQVYAGQTYT 219 

Zm LevU -KYGWHNRNDGARIGYFYSRGG-------------SNWIFGGHLLKDGANPRSW------ 116 

Bs SacB -------NADDTSIYMFYQKVG---------ETSIDSWKNAGRVFKDSDKFDANDSILKD 158 

Ps Lsc3 IKRDWEDRHGRARMCYWYSRTG-------------KDWIFGGRVMAEGVSPTTR------ 145 

KA 7321747885595855888579-------------3582469677567561246------ 

H113Q 

310 320 330 340 350 360 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA NQAEWSGSSRLMQI-----------HGNTVSVFYTDVAFNRDANA-------------NN 255 

Zm LevU ---EWSGCTIMAPG-----------TANSVEVFFTS----------------------VN 140 

Bs SacB QTQEWSGSATF--T-----------SDGKIRLFYTDF---------------------SG 184 

Ps Lsc3 ---EWAGTPILL-N-----------DKGDIDLYYTC------------------------ 166 

KA ---988987662-5-----------11517547897------------------------ 

370 380 390 400 410 420 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA ITPPQAI--ITQTLGRIHA-DFNHVWFTGFTAHTPLLQPDGVLYQNGAQ-----NE---- 303 

Zm LevU DTPSESV--PAQCKGYIYA-DDKSVWFDGFDKVTDLFQADGLYYADYAE-----NN---- 188 

Bs SacB KHYGKQT--LTTAQVNVSA-SDSSLNINGVEDYKSIFDGDGKTYQNVQQFIDEGNYSSGD 241 

Ps Lsc3 VTPGAAI---AKVRGRIVT-SDQGVELKDFTQVKKLFEADGTYYQTEAQ-----NS---- 213 

KA 4785576---635272517-72148141871181177189911987239-----71---- 

430 440 450 460 470 480 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA FFNFRDPFTFEDPKHPGVN---YMVFEGNTAGQR---------------GVANCTEADLG 345 

Zm LevU FWDFRDPHVFINPED-GKT---YALFEGNVAMER---------------GTVAVGEEEIG 229 

Bs SacB NHTLRDPHYVEDK---GHK---YLVFEANTGTEDGYQGEESLFNKAYYGKSTSFFRQESQ 295 

Ps Lsc3 SWNFRDPSPFIDPND-GKL---YMVFEGNVAGER---------------GSHTVGVAELG 254 

KA 156899945849617-655---677998976317---------------63115411617 

D219 

60

490 500 510 520 530 540 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA FRPNDPNAETLQEVLDSGAYYQKANIGLAIATD----STLSKWKFLSPLISANCVNDQTE 401 

Zm LevU PVPPK------TETPD-GARYCAAAIGIAQALN----EARTEWKLLPPLVTAFGVNDQTE 278 

Bs SacB KLLQS--------DKKRTAELANGALGMIELND-----DYTLKKVMKPLIASNTVTDEIE 342 

Ps Lsc3 PVPPG------HEDVG-GARFQVGCIGLAVAKD----LSGEEWEILPPLVTAVGVNDQTE 303 

KA 

13735------43431-1624568779481736----14251665569867765998889 E303 

Q269R L281P D300N T302P/M 

550 560 570 580 590 600 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA RPQVYLHNGKYYIFTISHRTTFAAGVDGPDGVY--GFVG-DGIRSDFQPMNYGSGLTMG- 457 

Zm LevU RPHVVFQNGLTYLFTISHHSTYADGLSGPDGVY--GFVSENGIFGPYEPLNG-SGLVLG- 334 

Bs SacB RANVFKMNGKWYLFTDSRGSKMTIDGITSNDIYMLGYVS-NSLTGPYKPLNK-TGLVLKM 400 

Ps Lsc3 RPHYVFQDGKYYLFTISHKFTYADGVTGPDGVY--GFVG-EHLFGPYRPMNA-SGLVLG- 358 

KA 998682558789889899259393714848889--9897-528585819892-888867- 

V329A 

610 620 630 640 650 660 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA --NPTDLNTAAGTDFDPSPDQNPRAFQSYSHYVMPG--G---LVESFID----------- 499 

Zm LevU --NPSS-----------------QPYQAYSHYVMTN--G---LVTSFID----------- 359 

Bs SacB DLDPND-----------------VTFT-YSHFAVPQAKGNNVVITSYMT----------- 431 

Ps Lsc3 --NPPE-----------------QPFQTYSHCVMPN--G---LVTSFID----------- 383 

KA --9946-----------------4658699858877--6---6969889----------- 

C317W 

670 680 690 700 710 720 

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 

Gd LsdA --TVEN------------RRGGTLAPTVRVRIAQNASAVDLRYGNGGLGGYGDI-PANRA 544 

Zm LevU --TIPS------SDPNVYRYGGTLAPTIKLELVG-----HRSFVTEVK-GYGYI-PPQIE 404 

Bs SacB --NRGF--------YADKQ--STFAPSFLLNIKGK----KTSVVKDSILEQGQL-TVNK- 473 

Ps Lsc3 --SVPT-------TGEDYRIGGTEAPTVRILLKG-----DRSFVQEEY-DYGYI-PAMKD 427 

KA --5551-------141117599879996451716-----466361314-36738-85312 

*24 levaansukraasi valgujärjestused (CAZy andmebaasist; http://www.cazy.org) joondati 

MUSCLE programmiga (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) (Edgar, 2004). Seda joondust 

kasutati sisendina ConSurf programmis (Glaser et al., 2003; Landau et al., 2005). ConSurf 

analüüs vajab täiendava sisendina ka Lsc3 valgu mudelit, mis ennustati ModBase programmiga 

(Pieper et al., 2009) LsdA (PDB ID: 1W18) baasil. ConSurf analüüsil leitud iga aminohappe 

konserveerumise aste (KA) on esitatud joonduse all. 

ConSurf analüüsil kasutatud 24 levaansukraasi olid pärit järgmistest mikroobidest: 

Serratia odorifera 4Rx13 (D1RZ84), Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca (Q93FU9), 

Rahnella aquatilis (O54435), Beijerinckia indica subsp. indica (gi_182678986), 

Gluconacetobacter diazotrophicus (Gd LsdA; Q43998), Cellulomonas flavigena 

(gi_296131231), Zymomonas mobilis (Zm LevU; Q60114), Haloarcula marismortui (Q5V249), 

Clostridium acetobutylicum (gi_15895050), Gluconobacter oxydans (gi_58039338), 

Halalkalicoccus jeotgali (gi_300710312), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Q48BC9), 

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Ps Lsc3; Q88BN6), Actinomyces viscosus 

(gi_304364376), Burkholderia pseudomallei (Q3JGQ0), Streptomyces viridochromogenes 

(gi_302555562), Burkholderia phymatum (B2JVY2), Bacillus megaterium (D5DC07), 

Pseudomonas fluorescens (C3K8D6), Halorubrum lacusprofundi (B9LT89), Halomicrobium 

mukohataei (C7P4M9), Erwinia amylovora (Q46654), Bacillus subtilis (Bs SacB; P05655), 

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Q48JY3). 

61

LISA 2 

Juhusliku keemilise mutageneesiga isoleeritud Lsc3 mutandid. lsc3 geeni sisaldavad plasmiidid 

eraldati sahharoosisöötmel lima mittesünteesivatest E. coli kloonidest (MutA kuni MutG) ja 

mutatsioonid tuvastati sekveneerimisega. Igal Lsc3 mutandil on rohelise värviga tähistatud 

aminohapped, mille asendus valgus tuvastati. Lsc3 valgu ennustatavad aktiivtsentri katalüütilise 

kolmiku aminohapped on näidatud punasega. 

62

LISA 3 

Ekspressioonivektorid pHIPMalprom-lsc3 (A; 8256 ap) ja pURI3-lsc3 (B; 3830 ap), millele on 

märgitud BamHI ja SalI lõikesaidid (A), suunatud muteerimisel (B) ning sekveneerimisel 

kasutatud praimerid (alla joonitud). Joonise tegemisel on kasutatud programmi pDRAW32 

(http://www.acaclone.com/). 

A 

64

Pseudomonas syringae pv. tomato levaansukraasi Lsc3 struktuuri ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?