Neuraalsete eellasrakkude jagunemise, tekke ning apoptoosi ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

ARENGUBIOLOOGIA ÕPPETOOL 

Epp Kaleviste 

Neuraalsete eellasrakkude jagunemise, tekke ning apoptoosi uurimine 

NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliinis vanuses E10.5 – E12.5 

Bakalaureusetöö 

Juhendajad: MSc Keiu Kask 

PhD Tambet Tõnissoo 

TARTU 2012

SISUKORD 

SISUKORD ................................................................................................................................ 2 

KASUTATUD LÜHENDID ...................................................................................................... 4 

SISSEJUHATUS ........................................................................................................................ 5 

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ................................................................................................. 6 

1.1. Neurogenees .................................................................................................................... 6 

1.1.1. Neuraalsed eellasrakud ......................................................................................... 6 

1.1.2. Neokorteksi areng ................................................................................................. 7 

1.2. Asümmeetriline jagunemine ............................................................................................ 8 

1.2.1. Mitoosikäävi orientatsioon ................................................................................... 9 

1.2.2. Polaarsus ............................................................................................................. 10 

1.2.3. Diferentseerumine .............................................................................................. 11 

1.3. Apoptoos närvisüsteemi arengus ................................................................................... 11 

1.4. Nukleotiidivahetusfaktor RIC8 ..................................................................................... 12 

1.4.1. Ülevaade RIC8 valgust ....................................................................................... 12 

1.4.2. Ric8 biokeemiline roll ........................................................................................ 12 

1.4.3. Ric8 roll närvisüsteemis ..................................................................................... 14 

1.4.4. Ric8 roll varajases embrüogeneesis ja asümmeetrilises jagunemises ................ 14 

1.4.5. Ric8 muud rollid ................................................................................................. 16 

2. EKSPERIMENTAALNE OSA ............................................................................................ 18 

2.1. Töö eesmärgid ............................................................................................................... 18 

2.2. Materjal ja metoodika .................................................................................................... 18 

2.2.1. Kasutatud hiireliinid ........................................................................................... 18 

2.2.2. Embrüote dissekteerimine .................................................................................. 19 

2.2.3. Embrüote genotüpiseerimine .............................................................................. 19 

2.2.4. Parafiinlõikude valmistamine ............................................................................. 20 

2.2.6. Whole-mount embrüote ja koelõikude pildistamine .......................................... 21 

2.2.7. Rakkude loendamine programmiga CellProfiler 2.0 .......................................... 22 

2.3. Tulemused ..................................................................................................................... 23 

2.3.1. NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliini üldine fenotüüp .............................................. 23 

2

2.3.2. E10.5 NestinRic8 -/- embrüote otsaju immunohistokeemiline analüüs ............ 24 



2.3.5. NestinRic8 -/- embrüote neuraaltoru immunohistokeemiline analüüs .............. 32 

2.4. Arutelu ........................................................................................................................... 34 

KOKKUVÕTE ......................................................................................................................... 39 

SUMMARY ............................................................................................................................. 40 

Tänusõnad ................................................................................................................................. 41 

Kasutatud kirjanduse loetelu .................................................................................................... 42 

3

KASUTATUD LÜHENDID 

AC – adenülüül-tsüklaas 

aPKC – atypical protein kinase C; ebatüüpiline proteiinkinaas C 

Brat – kasvu inhibiitor, Brain tumour 

DAG – diatsüülglütserool 

GEF – guanine nucleotide exchange factor; guaniini nukleotiidivahetusfaktor 

GMC – ganglion mother cell; ganglioni emarakk 

GPCR – G protein coupled receptor; G-valkudega seotud retseptor 

Insc. – valk Inscuteable 

INP – intermediate neural precursor, intermediaalne neuroni eellasrakk 

IPC – intermediate precursor cell, intermediaalne eellasrakk 

IZ –intermediaalne tsoon 

Mira – transportvalk Miranda 

Mud – Mushroom body defect 

NuMa – nuclear mitotic apparatus 

Par – partitioning defective protein 

PBS – posphate buffered saline, fosfaatpuhver 5 

PFA – paraformaldehüüd 

PH-3 – fosfo-histoon-3 

pI – sensory precursor cell, sensoorne eellasrakk 

Pins – valk Partner of Inscuteable 

PON – valk Partner of Numb 

PP – preplate; eelplaat 

Pros – transkriptsioonifaktor Prospero 

RIC8 – Resistant to Inhibitors of Cholinesterase 

SOP – sensory organ precursor; sensoorse organi eellasrakk 

SP – subplate; alamplaat 

Stau – valk Staufen 

SVZ – subventrikulaartsoon 

VZ – ventrikulaartsoon 

4

SISSEJUHATUS 

Organismi normaalse ning täisväärtusliku elu tagamiseks on kesknärvisüsteemi välja 

kujunemine fundamentaalse tähtsusega. Mitmed arenguga seotud neurospetsiifilised 

väärarengud saavad alguse juba embrüonaalses eas, kuid tänu teaduse pidevale edenemisele 

on erinevate defektide teke tuvastatav juba varajases arengus. Suuresti on uudsed teadmised 

ning avastused tehtud erinevate loommudelite ning transgeense tehnoloogia abiga. 

Imetaja närvisüsteemi arengus on üheks uuritavamaks ja atraktiivsemaks struktuuriks 

evolutsiooniliselt uudne 6-kihiline neokorteks. Mitmed kortikaalsed väärarengud on 

põhjustatud muutustest raku tasemel, mille jagunemist ja talitlemist reguleerivad erinevad 

molekulaarsed mehhanismid. Need mehhanismid tagavad neuraalsete rakkude mitmekesisuse, 

kus kõrgelt reguleeritud eellasrakkude sümmeetriliste ja asümmeetriliste jagunemistega 

genereeritakse erinevat tüüpi neuronid. Rakkude diferentseerumisel ja kogu organismi 

korrektsel arengul on asümmeetriline jagunemine kriitilise tähtsusega. Selle jooksul 

määratakse spetsiaalsete valgukompleksidega mitoosikäävi orientatsioon, raku polaarsus ja 

seeläbi kogu raku saatus. Närvisüsteemi funktsionaalseks arenguks omab kriitilist rolli ka 

programmeeritud rakusurm ehk apoptoos, mille vahendusel eemaldatakse peaaegu pooled 

tekkinud neuronid ja gliiarakud. 

Rakkude asümmeetrilisel jagunemisel omavad olulist rolli heterotrimeersed G-valgud, 

mis osalevad käävi orientatsiooni kujunemisel. G-valkude retseptorist sõltumatu signaaliraja 

lahutamatu osa on Gα subühiku nukleotiidivahetusfaktor RIC8, millel on võime pikendada ja 

võimendada Gα subühiku poolt edastatavat signaali. Üheks RIC8 võimalikuks rolliks on 

rakkude asümmeetrilise jagunemise regulatsioon embrüonaalses arengus. RIC8 puudumine 

varajases embrüogeneesis põhjustab letaalsust mitmetes mudelorganismides – ümaruss 

C.elegans, äädikakärbes Drosophila ja koduhiir Mus musculus. 

Antud bakalaureusetöö annab ülevaate närvisüsteemi arengus esinevatest neuraalsetest 

eellasrakkudest, raku saatust määravatest molekulaarsetest mehhanismidest ning 

neurogeneesis toimuvast apoptoosist. Detailsemalt antakse ülevaade guaniini 

nukleotiidivahetusfaktori RIC8 erinevatest rollidest mudelorganismide arengus. 

Eksperimentaalses osas uuritakse neuraalsete eellasrakkude spetsiifilise konditsionaalse 

hiireliini NestinCre;Ric8 lacZ/lox embrüoid vanuses E10.5-E12.5. Detailsemalt analüüsitakse 

NestinCre;Ric8 lacZ/lox embrüote otsajus jagunevaid neuraalseid eellasrakke, basaalseid 

eellasrakke ning apoptootilisi rakke. 

5

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

1.1. Neurogenees 

1.1.1. Neuraalsed eellasrakud 

Kesknärvisüsteemi arengu käigus tekib arvukalt erinevat tüüpi neuroneid. Selline 

rakkude mitmekesisus tagatakse kõrgelt reguleeritud eellasrakkude sümmeetriliste ja 

asümmeetriliste jagunemistega, mille tulemusel genereeritakse erineva saatusega rakud 

(Noctor jt., 2001;). Algselt paiknevad eellasrakud neuraalplaadina, mis neurulatsiooni käigus 

paindub neuraalvaoks ning sulgudes moodustub neuraaltoru. Selle anterioorsest osast areneb 

peaaju ning posterioorsem osa annab aluse seljaajule (Ybot-Gonzalez jt., 2007). Imetaja 

peaaju evolutsiooniliselt noorimaks struktuuriks peetakse 6-kihilist neokorteksit, mille 

arengurada sisaldab neuraalsete eellasrakkudena neuroepiteeli rakke ja radiaalgliia rakke 

(Kriegstein ja Götz, 2003; Malatesta jt., 2000; Noctor jt., 2001). Embrüonaalses otsaju 

arengus toimub neurogenees kahes proliferatiivses regioonis – ventrikulaartsoonis 

(ventricular zone, VZ) ja subventrikulaartsoonis (subventricular zone – SVZ) (Noctor jt., 

2004). VZ olevad neuraalsed eellasrakud omavad ühendust nii ventrikulaarse luumeni kui ka 

pehmekestaga (pia mater) (Wodarz ja Huttner, 2003; Kriegstein jt., 2006). Nii neuroepiteeli 

rakkudele kui ka radiaalgliia rakkudele on omane tuumade interkineetiline migreerumine piki 

apiko-basaalset telge, mis jätab pseudokihistunud mulje (Chenn ja McConnel, 1995; Götz ja 

Huttner, 2005). Mitoosi S-faasis on tuumad migreerunud VZ-i basaalsesse poolde ning G2- 

faasis liiguvad tuumad tagasi apikaalsele luumeni pinnale, kus toimub jagunemine ja algab 

uus rakutsükkel (Chenn ja McConnel, 1995). 

Hiire embrüonaalses vanuses E9–E12 transformeeruvad neuroepiteeli rakud 

radiaalgliia rakkudeks (Hartfuss jt., 2001; Noctor jt., 2002; Noctor jt., 2004) ja nende 

jagunemise kõrgpunkt esineb vanuses E13–E18 (Bultje jt., 2009). Radiaalgliia omab 

bipolaarset morfoloogiat, mille puhul üks jätke on ühenduses ventrikulaarse pinnaga ja teine 

ulatub pika jätkega pehmekestani (Kriegstein ja Götz, 2003). Raku jagunemisel säilitab 

radiaalgliia oma jätked ning pehmekestani ulatuva jätke pärib üks jagunemisel tekkinud 

iseuuenev radiaalgliia rakk (Noctor jt., 2004; Miyata jt., 2001; Noctor jt., 2001). Selline 

morfoloogia ja jagunemine põhjustab asümmeetriat tekkivate tütarrakkude vahel (Noctor jt., 

2004; Noctor jt., 2001;). Neurogeensed radiaalgliia rakud läbivad ventrikulaartsoonis 

6

omakorda kaks erineva tulemusega asümmeetrilist jagunemist (Noctor jt., 2004; Haubensak 

jt., 2004). Ühel jagunemisel tekivad radiaalgliia rakk ja postmitootiline neuron, teisel juhul 

tekivad radiaalgliia ja intermediaalne ehk basaalne eellasrakk (intermediate progenitor cell, 

IPC; basal progenitor) (Noctor jt., 2004; Noctor jt., 2001; Miyata jt., 2001; Malatesta jt., 

2000; Tamamaki jt., 2001). IPC rakud erinevad eelnevatest rakkudest sellepoolest, et nende 

rakutuuma mitoos leiab aset ventrikulaartsooni basaalsel poolel, kus nad produtseerivad ainult 

neuroneid, mitte gliiarakke (Noctor jt., 2004; Haubensak jt., 2004; Miyata jt., 2004). IPC 

rakud liiguvad eemale ventrikulaarsest pinnast ning moodustavad basaalsemalt paikneva 

subventrikulaartsooni, kus sümmeetrilise jagunemisega toodetakse kaks postmitootilist 

neuronit (Noctor jt., 2004; Haubensak jt., 2004). IPC rakud jagunevad nii basaalses VZ-s kui 

ka SVZ-s (Farkas ja Huttner, 2008) ning neid leidub teatud aju piirkondades, eelkõige 

külluslikult otsajus (Haubensak jt., 2004). 

1.1.2. Neokorteksi areng 

Neuraalsetest eellasrakkudest tekkinud postmitootilised neuronid migreeruvad areneva 

korteksi erinevatesse kihtidesse. Embrüonaalses vanuses E11–E18 migreeruvad neuronid 

radiaalselt VZ väljapoole ja moodustavad kuuekihilise neokorteksi (Zhong, 2003; Gupta jt., 

2002). Rakkude liikumine tagatakse kas rakukeha (soma) translokatsiooniga, kus neuron on 

radiaaljätke abil ühenduses pehmekestaga (Miyata jt., 2001; Nadarajah jt., 2001), või 

lokomotsiooniga, kus neuron liigub piki radiaalgliia jätket pehmekesta suunas (Noctor jt., 

2004). Vanuses E11 sisaldab arenev neokorteks eellasrakkudest moodustunud proliferatiivset 

1-kihilist VZ, kust postmitootilised neuronid migreeruvad radiaalselt pehmekesta suunas ja 

moodustavad eelplaadi (Gupta jt., 2002). Vanuses E13 toimub teine migreerumine, kus 

neuronid liiguvad läbi intermediaalse tsooni (intermediate zone, IZ) ja lõhestavad eelplaadi 

pindmiseks marginaaltsooniks ja subplaadiks ning nende vahele tekib kortikaalplaat (Gupta 

jt., 2002). Vanuses E14–E18 moodustub marginaaltsooni alla ja kortikaalplaadi peale 

erinevatest neuronitest kihid. Täiskasvanuna pehmekest kaob ning alles jääb 6-kihiline 

neokorteks (Gupta jt., 2002). 

7

1.2. Asümmeetriline jagunemine 

Raku jagunemine on ajalis-ruumiliselt sõltuv erinevatest raku saatust määravatest 

determinantidest, mitoosikäävi orientatsioonist ja selle asetusest. Neuroepiteeli eellasrakkudes 

paneb jagunemistasapind paika sümmeetrilise või asümmeetrilise jagunemise (Chenn ja 

McConnell, 1995). Rakkude diferentseerumisel, mitmekesisuse tekkel ning kogu organismi 

korrektsel arengul on asümmeetriline jagunemine kriitilise tähtsusega (Schaefer ja Knoblich, 

2001). Mudelorganismi Caenorhabditis elegans-i varajases embrüogeneesis põhjustab 

mitoosikäävi posterioorsem paigutumine embrüos ebavõrdse rakujagunemise, mille 

tulemusena jaguneb P0 sügoot suuremaks anterioorseks AB rakuks ja väiksemaks 

posterioorseks P1 rakuks (Hyman ja White, 1987). Äädikakärbse Drosophila 

kesknärvisüsteemis jagunevad neuroblastid piki apiko-basaalset telge (Kaltschmidt jt., 2000). 

Drosophila neuroblast jaguneb sümmeetriliselt ning tekitab kaks sama saatusega rakku või 

asümmeetriliselt, mille tulemusena jaguneb neuroblast uueks apikaalseks neuroblastiks ja 

väiksemaks basaalseks ganglioni emarakuks (GMC – ganglion mother cell). Edasisel GMC 

jagunemisel tekib kaks diferentseerunud neuronit (Jan ja Jan, 2001; Schaefer ja Knoblich, 

2001). Tekkinud iseuuenenud neuroblast jaguneb edasi intermediaalseks neuroni eellasrakuks 

(INP, intermediate neural precursor), mis omakorda jaguneb GMC rakuks ja iseuuenevaks 

INP rakuks, mis jagunedes annab kaks GMC rakku (Bowman jt., 2008; Bello jt., 2008). 

Imetaja neokorteksi arengurada sisaldab neuraalsete eellasrakkudena neuroepiteeli rakke ja 

radiaalgliia rakke, milledest lõpuks arenevad asümmeetrilise jagunemise ja diferentseerumise 

tagajärel postmitootilised neuronid ja gliia (Kriegstein ja Götz, 2003; Malatesta jt., 2000; 

Noctor jt., 2001). 

Erinevatel organismidel on konserveerunud raku jagunemise molekulaarsed 

mehhanismid, mis määravad raku saatuse. Üldiselt võib asümmeetrilise jagunemise 

molekulaarsed determinandid jagada kolme gruppi – polaarsuse, diferentseerumise ning 

mitoosikäävi orientatsiooni eest vastutavad valgukompleksid (joonis 1) (Knoblich, 2001 rev). 

8

Joonis 1. Asümmeetrilisel jagunemisel osalevad valgukompleksid. Erinevatel organismidel on 

konserveerunud raku jagunemise molekulaarsed mehhanismid, mis määravad raku saatuse. Apikaalselt 

paigutuvad mitoosikäävi orientatsiooni ja polaarsuse tekke eest vastutavad valgukompleksid, basaalsesse poolde 

paigutuvad raku diferentseerumise eest vastutavad valgud. 

1.2.1. Mitoosikäävi orientatsioon 

Asümmeetrilise jagunemise oluline osa on korrektse käävi orientatsiooni määramine, 

sest selle tulemusel tekkiv jagunemistasapind tagab raku polariseerumise ning raku saatust 

määravate determinantide koondumise ühte tütarrakku (White ja Strome, 1996; Hawkins ja 

Garriga, 1998). Käävi positsiooni ja selle seotust korteksiga kontrollib valgukompleks 

NuMA-LGN-Gα (Siller ja Doe, 2009). Imetaja valgu LGN (Du jt., 2001; Du ja Macara, 2004) 

homoloogid Drosophila´s on Pins (Partner of Inscuteable) (Schaefer jt., 2000) ja C. 

elegansís GPR-1 ja GPR-2 ehk GPR-1/2 (Schaefer jt., 2000; Srinivasan jt., 2003; Gotta jt., 

2003). LGN sisaldab kolme GoLoco domääni, mille abil seondub see membraanile 

ankurdatud Gα-GDP valguga (Gotta jt., 2003; Srinivasan jt., 2003). Aktiivne kompleks LGN- 

Gα-GDP seostub seejärel valguga NuMA (nuclear mitotic apparatus) (C.elegans’i homoloog 

LIN-5; Drosophila homoloog Mud ehk mushroom body defect) (Srinivasan jt., 2003; Gotta 

jt., 2003), mis omakorda seostub düneiin-dünaktiin kompleksiga (Gönczy jt., 1999; 

Couwenbergs jt., 2007; Nguyen-Ngoc jt., 2007). Mitoosikäävi regulatsioonis on tähtis roll 

düneiin-dünaktiin kompleksil, mis on mikrotuubuli miinus-otsa suunaline mootor-kompleks, 

kus düneiin on motoorne valk ning dünaktiin on tema aktivaatorvalk (Dujardin ja Vallee, 

9

2002). Düneiini miinus-otsa suunaline liikumine tekitab tõmbejõu, mille tulemusena muutub 

mitoosikäävi asetus (Nguyen-Ngoc jt., 2007; Couwenbergs jt., 2007). Kui vähendada valkude 

Gα, LGN ja NuMA taset, esinevad käävi positsioneerumises defektid (Gönczy jt., 1999; 

Miller ja Rand, 2000; Gotta jt., 2003), mis sarnanevad düneiin-dünaktiini vähenemise mõjule 

(Nguyen-Ngoc jt., 2007; Couwenbergs jt., 2007). Gα i puudumine imetaja raku korteksist 

põhjustab käävi apiko-basaalse orientatsiooni lülitumise planaarseks (Konno jt., 2008), kus 

planaarne orientatsioon genereerib sama saatusega rakke ja apiko-basaalne orientatsioon 

genereerib erinevat tüüpi tütarrakke (Chenn ja McConnell, 1995). 

1.2.2. Polaarsus 

Raku polaarsuse tekke eest vastutab evolutsiooniliselt konserveerunud Par 

(partitioning defective proteins) valgukompleks, mis koosneb kolmest valgust – selgroogse 

näitel Par-3 (Drosophila homoloog Bazooka; C.elegans’i homoloog Par3), Par-6 ning 

ebatüüpiline proteiini kinaas C (aPKC – atypical protein kinase C) (Wodarz jt., 1999; 

Petronczki ja Knoblich, 2001). C.elegans’i sügoodis asub Par kompleks anterioorsel 

rakupoolusel (Schneider ja Bowerman, 2003; Gönczy, 2008), Drosophila neuroblastis 

paikneb Par-kompleks apikaalses korteksis (Wodarz jt., 1999) ja imetaja neuroepiteeli 

eellasrakus apikaalsel poolusel (Götz ja Huttner, 2005). Par-3 interakteerub Inscuteable (Insc) 

valguga (Wodarz jt., 1999) ankurdades viimase endaga samale poolusele. Neuroblastis Par-3 

ja Insc valkude kadumine põhjustab juhuslikku käävi orientatsiooni (Wodarz jt., 1999) ja 

asümmeetria kadumist, mille tulemusena tekivad võrdse suurusega tütarrakud (Schneider ja 

Bowerman, 2003). Valk Insc seondub mitoosikäävi orientatsiooni kompleksi valguga LGN 

läbi N terminaalse domääni (Srinivasan jt., 2003), mis omakorda läbi C-terminaalse GoLoco 

domääni seostub kortikaalse Gα i -GDP-ga (Schaefer jt., 2000; Gotta jt., 2003; Srinivasan jt., 

2003; Žigman jt., 2005). Seeläbi ühendab Insc nii polaarsuskompleksi kui ka mitoosikäävi 

orientatsiooni eest vastutava kompleksi samale poolusele (Bellaiche jt., 2001; Jan ja Jan, 

2001; Žigman jt., 2005). 

10

1.2.3. Diferentseerumine 

Raku diferentseerumist juhivad kindlad valgulised determinandid, mis segregeeruvad 

raku asümmeetrilises jagunemises ainult diferentseeruvasse rakku (Schuldt jt., 1998). Valk 

Numb ja translatsiooni inhibiitor Brain tumour (Brat) (Sonoda ja Wharton, 2001) 

akumuleeruvad hilises prometafaasis raku plasmamemembraani basaalses pooles (Knoblich, 

2001; Schaefer ja Knoblich, 2001). Valkude Numb ja Brat asümmeetrilist lokalisatsiooni 

soodustavad kaks valku – Brat lokaliseerub transportvalgu Miranda (Mira) abiga (Ikeshima- 

Kataoka jt., 1997) ja Numb lokaliseerumist soodustab adaptervalk Partner of Numb (PON) 

(Lu jt., 1998; Schaefer ja Knoblich, 2001). Miranda on transportvalk, mis on vajalik raku 

saatust määravate determinantide basaalseks segregatsiooniks. Tüüp I neuroblastis ja INP 

rakus transpordib Miranda valkude Prospero (Pros), Brat ning Staufen (Stau) GMC rakku 

(Ikeshima-Kataoka jt., 1997). Valk Stau kolokaliseerub Miraga ning osaleb ülejäänud valkude 

transpordil (Zhong ja Chia, 2008; Wu jt., 2008). Translatsiooni inhibiitor Brat aktiveerib 

transkriptsioonifaktori Pros, mis seejärel siseneb GMC rakutuuma ning aktiveerib 

diferentseerumisele suunavad geenid (Knoblich, 2001; Schaefer ja Knoblich, 2001). 

1.3. Apoptoos närvisüsteemi arengus 

Apoptoos ehk programmeeritud rakusurm on oluline füsioloogiline protsess, mis omab 

kriitilist rolli erinevate kudede ja kogu organismi arengus (Zimmermann jt., 2001). Apoptoos 

on närvisüsteemi arengus asendamatu osa ja uuringute kohaselt eemaldatakse apoptoosi 

vahendusel pooled neuronid ja gliiarakud (Lossi ja Merighi, 2003; Nijhawan jt., 2000). 

Mitmes aju piirkonnas esineb kaks järjestikust rakusurma perioodi – esimene leiab aset enne 

neurogeneesi algust, teine on seotud postmitootiliste neuronitega (Lossi jt., 2002c). Hiire 

embrüos kortikaalse neurogeneesi (E10–E18) käigus on programmeeritud rakusurma tippfaas 

(70%) vanuses E14 ja sellele järgneb selle kahanemine (50%) kuni vanuseni E18 (Lossi ja 

Merighi, 2003). 

Apoptoosi jooksul leiavad rakus aset mitmesugused muutused membraani struktuuris 

ja permeaabluses ning mitokondrite potentsiaalis (Darzynkiewicz jt., 1997). Muudatused 

leiavad aset ka kromatiini struktuuris, DNA ahelad katkevad ning tuuma koostis väheneb 

(Darzynkiewicz jt., 1997). Rakusisene dehüdratatsioon viib tsütoplasma kondensatsioonini, 

mille tulemusena muutuvad rakud piklikumaks ning väiksemaks. Teine tähtis tunnus on 

11

tuuma kromatiini kondensatsioon, mis võtab poolkuu või sirbi kuju (Darzynkiewicz jt., 1997). 

Apoptoosile on iseloomulik endonukleaaside aktivatsioon (Darzynkiewicz jt., 1997), mis 

degradeerivad DNA 50-300 kb suurusteks fragmentideks (Oberhammer jt., 1993). Apoptoosi 

lõppstaadiumis fragmenteerub rakk väikesteks apoptoosikehakesteks (apoptotic bodies), mis 

fagotsüteeritakse makrofaagide või naaberrakkude poolt (Darzynkiewicz jt., 1997). 

1.4. Nukleotiidivahetusfaktor RIC8 

1.4.1. Ülevaade RIC8 valgust 

RIC8 (Resistant to Inhibitors of Cholinesterase) on evolutsiooniliselt konserveerunud 

63-kDa tsütoplasmaatiline valk, mis isoleeriti esmakordselt koliinesteraasi inhibiitorite suhtes 

resistentsetelt C.elegansí mutantidelt (Miller, 1996). RIC8 asub kontsentreerituna neuronite 

tsütoplasmas (Miller jt., 2000) ning omab mitmesuguseid rolle erinevates mudelorganismides 

– nematood C.elegans (Miller jt., 2000; Hess jt., 2004; Afshar jt., 2004), äädikakärbes 

Drosophila melanogaster (David jt., 2005; Hampoelz jt., 2005), kannuskonn Xenopus laevis 

(Figueroa jt., 2009), sebrakala Danio rerio (Nagayoshi jt., 2008), hiirel Mus musculus (Tall 

jt., 2003), rotil Rattus norvegicus (Thomas jt., 2008). Funktsionaalselt on RIC8 seost näidatud 

erinevate mudelorganismide embrüonaalses arengus, sünaptilises signaaliülekandes ning 

asümmeetrilisel rakkude jagunemisel (Miller & Rand 2000, Miller jt., 2000). Biokeemiliselt 

on RIC8 nukleotiidivahetusfaktor (GEF, nucleotide exchange factor) guaniini nukleotiidi 

siduvatele G valgu subühikutele – Gα q , Gα i , Gα o , Gα s ja Gα 13 (Reynolds jt., 2005; Tall jt., 

2003). Xenopus laevis mudeli põhjal on välja selgitatud RIC8 valgu struktuur, mille põhjal 

RIC8 koosneb 10 armadillo domäänist ning võimaldab seeläbi endaga siduda erinevaid valke, 

samuti osaleda mitmetes rakuprotsessides ja signaaliradades (Figueroa jt., 2009). 

1.4.2. Ric8 biokeemiline roll 

Klassikalises G-valgu signaalirajas edastatakse rakuväline signaal transmembraanse 

retseptori vahendusel heterotrimeersetele G-valkudele, mis kannavad selle edasi rakusisestele 

signaaliradadele (Neves jt., 2002). Inaktiivne Gα-GDP vorm on seotud Gβγ-subühikuga ning 

7-korda membraani läbiva retseptori (GPCR, G-protein-coupled receptors) tsütoplasmaatilise 

12

osaga (Bastiani jt., 2006). Ligandi seondumisel omandab retseptor guaniini 

nukleotiidivahetusfaktori (GEF, guanine nucleotide exhange factor) aktiivsuse ja stimuleerib 

Gα-subühiku GDP vahetamist GTP vastu. Aktiivne Gα-GTP vabaneb Gβγ-subühiku küljest ja 

seondub rakusisese efektoriga, mis kannab signaali edasi (Neer, 1995 rev). Gα subühikule 

omane ATPaasne aktiivsus hüdrolüüsib GTP γ-fosfaadi, mille tulemusena vabaneb GTP ja 

taastub Gα-GDP vorm, mis seostub uuesti βγ-subühikuga. Taastekkinud heterotrimeerne G- 

valk lõpetab signaali (Bastiani jt., 2006). 

Lisaks klassikalisele rajale eksisteerib ka retseptorist sõltumatu G-valgu signaalirada, 

kus transmembraanse retseptori asemel funktsioneerib tsütoplasmaatiline valk RIC8 (Tall jt., 

2003; Reynolds jt., 2005, Wilkie ja Kinch, 2005). Erinevalt GPCR-st, mis seondub 

heterotrimeerse G-valguga, seondub RIC8 ainult dissotseerunud Gα subühikuga. RIC8 on 

nukleotiidivahetusfaktor Gα subühikutele – Gα q , Gα i , Gα o , kuid mitte Gα s . (Tall jt., 2003). 

Valk RIC8 interakteerub Gα-GDP vormiga, mille tulemusena vabaneb GDP ja tekib stabiilne 

nukleotiidivaba kompleks RIC8-Gα. Sellise kompleksiga on võimeline liituma GTP, mis 

vabastab RIC8 ja tekitab aktiivse Gα-GTP vormi (Tall jt., 2003; Reynolds jt., 2005, Wilkie ja 

Kinch, 2005). Seondudes nukleotiidivaba Gα subühikuga võib üheks RIC8 võimalikuks 

funktsiooniks pidada individuaalse G-valgu signaali võimendamist ning pikendamist (Tall jt., 

2003). 

Aastal 2011 avaldas Gabay töögrupp oma uurimuses uudse võimaliku rolli RIC8 

valgule, kus RIC8 toimib kui molekulaarne chaperon vahendades sünteesitud Gα-subühiku 

seondumist endomembraaniga. Tsütosoolsetes ribosoomides sünteesitud Gα ahelad ei suuda 

seonduda nukleotiididega seni, kuni need pole korralikult volditud ja seetõttu ei teki guaniini 

nukleotiidi seondumistaskut. Kui RIC8 seondub ribosoomil valmivale Gα-le, siis võib see 

aidata voltimist. Gα pakkimise ajal tekib ajutine kompleks RIC8-Gα-CCT ja peale pakkimist 

vabaneb RIC8-Gα kompleks, kus RIC8 käitub kui eskort-chaperon transportides 

nukleotiidivaba Gα subühiku endoplasmaatilise retiikulumi membraan-spetsiifilisele faktorile 

(Gabay jt., 2011). Ric8A -/- rakkudes transleeritakse endogeensed Gα i ja Gα q efektiivselt, kuid 

integreeritakse halvasti endomembraanidesse ning paljud valgud jäävad tsütoplasmasse ja 

degradeeritakse (Gabay jt., 2011). Ric8A -/- rakkudes esineb Gα i , Gα q , Gβ 1 subühikute 

kiirenenud degradatsioon (Gabay jt., 2011). Arvatakse, et GEF aktiivsuse eesmärk pole 

tingimata produtseerida aktiveeritud Gα-GTP vorme, vaid pigem RIC8 roll on sooritada 

nukleotiidivahetus, et dissotseeruda Gα küljest lahti, sest RIC8 eelistab seonduda vaba 

monomeerse Gα-subühiku külge (Gabay jt., 2011). 

13

1.4.3. Ric8 roll närvisüsteemis 

Närvisüsteemis toimub informatsiooni ülekandumine ühest rakust teise keemilise 

sünapsi kaudu. C.elegansí vastsetes ja täiskasvanud isendites ekpresseerub ric8 kogu 

närvisüsteemis – pea ganglionites ja kõhtmises seljaajus (Miller jt., 2000). C.elegansí 

sünaptilist transmissiooni kontrollib antagonistlik Gα o -Gα q signaalirada, mis reguleerideb 

diatsüülglütserooli (DAG) intratsellulaarset kontsentratsiooni ja seeläbi neurotransmitterite 

sekretsiooni (Miller jt., 2000; Tall jt. 2003). Gα q subühik võimaldab sünaptilist transmissiooni 

aktiveerides fosfolipaasi Cβ ja seeläbi DAG tekkimise (Singer jt., 1997 rev), mis aitab 

kontrollida intratsellulaarset Ca 2+ vabanemist (Smrcka jt., 1991). Signaalirajas olev Gα o 

subühik mõjub negatiivselt sünaptilisele ülekandele stimuleerides DAG kinaasi, mis vähendab 

DAG taset (Miller jt., 2000). Nukleotiidivahetusfaktor RIC8 on resistentne koliinesteraasi 

inhibiitorite suhtes ning aktiveerib Gα q -ga sarnaselt Gα o -Gα q signaalirada, mille tagajärel 

tõuseb DAG tase ja väheneb atsetüülkoliini vabanemine sünapsis (Miller, 1996; Miller ja 

Rand, 2000). Deleteeritud Gα q ja ric8 mutatsiooniga C.elegansí isenditel esineb fenotüübilisi 

sarnasusi – resistentsus koliinesteraasi inhibiitor aldicarb suhtes, kahjustunud 

neurotransmitterite vabanemine, mille tulemusel on vähenenud keha paindlikkus, liikumine ja 

munemine (Miller jt., 1996; Miller ja Rand, 2000). RIC8 valgud on võimelised tugevdama 

Gα q , Gα s ja Gα olf -vahendatud signaali ülekannet, osaledes peale GPCR retseptoriga 

seondumist vastavate G-valkude rajas (Malik jt., 2005; Von Dannecker jt., 2005; Nishimura 

jt., 2006; Romo jt., 2008). 

Hiire varajases arengus vanuses E9.5-E12.5 on Ric8 ekpressioon tugevalt 

neurospetsiifiline, ekspresseerudes kraniaalganglionides, neuraaltorus, sümpaatilises tüves, 

läätses, vomeronasaalorganis ja endolümfaatilises juhas. Täiskasvanud hiirel on Ric8 

ekspresseeritud peaajus käitumuslikult tähtsates piirkondades nagu neokorteks, hipokampus, 

väikeaju, ajuripats, ependümaalne kiht, vöökäär, juttkeha ja käbinääre (Tõnissoo jt., 2003). 

Haplodefitsiitsetel Ric8 +/- heterosügootsetel hiirtel on probleeme ruumilise mäluga, raskused 

õppimisel ja suurenenud ärevus (Tõnissoo jt., 2006). 

1.4.4. Ric8 roll varajases embrüogeneesis ja asümmeetrilises jagunemises 

RIC8 osaleb rakkude asümmeetrilisel jagunemisel organismide embrüonaalses 

arengus. RIC8 puudumine varajases embrüogeneesis põhjustab letaalsust mudelorganismidele 

14

C.elegans, Drosophila ja koduhiir Mus musculus (Tõnissoo jt., 2010; Hampoelz jt 2005; 

Wang jt 2005; Gabay jt. 2011). C.elegansí varajases embrüonaalses arengus reguleerivad 

RIC8 ja Gα o (GOA-1) tsentrosoomide liikumist. RIC8 ja Gα-subühik osalevad üherakulises 

posterioorses tsentrosoomi kiikumises, P1 tsentrosoomi lamendumises, mitoosikäävi 

joondumises ja tuumade migratsioonil (Miller ja Rand, 2000). Mitoosikäävi moodustumise 

ajal liigub posterioorne tsentrosoom edasi-tagasi, läbides embrüo keskkohta 4-6 korda. See 

põhjustab mitoosikäävi posterioorsema paigutumise, mille tulemusena jaguneb sügoot 

asümmeetriliselt, tekitades suurema AB raku ja väiksema P1 raku (Hyman ja White, 1987). 

Mutantsetel isenditel esinevad häired tsentrosoomide liikumises, üherakulise posterioorse 

tsentrosoomi kiikumise puudumises, käävi joondumisel ja hilinenud tuumade migratsioonil. 

Wild type hiirel on anterioorne astraalne mikrotuubul ümmargune ning posterioorne 

mikrotuubul tõmbejõu tulemusena lamendunud, RIC8 mutandil on aga mõlemad 

mikrotuubulid ümmargused (Couwenbergs jt., 2004). Anafaasis esinev käävi pikkus 

korreleerub tõmbejõu tugevusega, kus elongeerunud käävil esineb tõmbejõud. RIC8 mutandil 

on anafaasis esinev kääv tunduvalt lühem (Couwenbergs jt., 2004). Mutantsetel Ric8 -/- 

embrüotel esineb nõrk tsentrosoomi edasi-tagasi pendeldamine või puudub täielikult, 

mitoosikääv positsioneerub vähem posterioorselt võrreldes wt. embrüoga – AB blastomeer on 

sama suur või natuke suurem P1 blastomeerist (Miller ja Rand, 2000; Couwenbergs jt., 2004). 

Drosophila´s ja C.elegansís reguleerib RIC8 positiivselt Gα i aktiivsust ja on vajalik 

asümmeetriliseks jagunemiseks (Afshar jt., 2004; Couwenbergs jt., 2004; David jt., 2005; 

Hampoelz jt., 2005; Wang jt., 2005). Ric8 osaleb ka Drosophila neuroblastide ja sensoorsete 

eellasrakkude formeerumisel (David jt., 2005; Hampoelz jt., 2005; Wang jt., 2005). 

Drosophila sensoorne eellasrakk (sensory precursor cell, pI) on polaarne piki anterioposterioorset 

telge. Ric8 reguleerib Gα i kortikaalset lokalisatsiooni, et soodustada Gα i - 

sõltuvat käävi planaarset orientatsiooni (David jt., 2005). Raku pI anterio-posterioorne 

planaarne polaarsus sõltub anterioorselt asümmeetriliselt lokaliseeruvatest rakusaatuse 

determinantidest – Numb, Neutralized ja Bazooka (Roegiers jt., 2001; Schaefer ja Knoblich, 

2001). Ric8 on vajalik valkude Pins, Bazooka ja Numb asümmeetriliseks lokalisatsiooniks ja 

käävi positsioneerumiseks, lokaliseerides Gα i membraanile (David jt., 2005). Drosophila 

neuroblastis ekspresseeruv Ric8 vastutab peale käävi positsioneerimise ka apiko-basaalse 

polaarsuse säilitamise eest, lokaliseerides heterotrimeerse G-valgu plasmamembraanile 

(Hampoelz jt., 2005). 

2010. aastal avaldati imetaja RIC8 roll raku jagunemises, kus RIC8 mõjutab GDP- 

Gα i /LGN/NuMa kompleksi. RIC8 ja Gα i valgud ankurdavad LGN, NuMA ja düneiini 

15

akukorteksile, et aidata imetaja metafaasi rakkudes joondada mitoosikäävi. RIC8 vabastab 

katalüütiliselt Gα i -GTP vormi ja põhjustab sellega NuMA ja LGNi vabanemise (Tall ja 

Gilman, 2005; Tall jt., 2003). NuMA dünaamiline vabanemine LGN-st reguleerib astraalsete 

mikrotuubulite tõmbejõudusid (Du ja Macara, 2004) (joonis 2). RIC8 funktsiooni häirumine 

mõjutab düneiini, LGN ja NuMA lokalisatsiooni rakukorteksis. Vähendatud RIC8 

ekspressioon põhjustab mitoosi pikenemist, juhuslikku mitoosiaresti ja vähendab 

mitoosikäävi liikumist (Woodard jt., 2010). Olenevalt mitoosifaasist lokaliseerub RIC8 raku 

korteksis, käävipoolustel, tsentromeerides, tsentraalses käävis ja keskkehandis (midbody). 

Imetaja varajases embrüonaalses arengus surevad Ric8 -/- embrüod vanuses E6.5–E8.5. 

Homosügootne Ric8 -/- on väiksem, kui normaalne Ric8 +/+ või Ric8 +/- pesakonnakaaslane, neil 

on ebanormaalne morfoloogia ja tugev taandareng (Tõnissoo jt., 2010). 

Joonis 2. RIC8 mõjutab GDP-Gα i /LGN/NuMa kompleksi raku asümmeetrilises jagunemises. Valk RIC8 

toimib guaniini nukleotiidivahetusfaktorina ja stimuleerib Gα-subühiku GDP vahetamist GTP vastu. RIC8 

vabastab katalüütiliselt Gα i -GTP vormi ja põhjustab sellega NuMA ja LGNi vabanemise. NuMA dünaamiline 

vabanemine LGN-st reguleerib astraalsete mikrotuubulite tõmbejõudusid (Hinrichs jt., 2012). 

1.4.5. Ric8 muud rollid 

Imetajatel eksisteerib kaks RIC8 isovormi – RIC8A ja RIC8B. Mõlemad vormid 

omavad guaniini nukleotiidivahetusaktiivsust Gα subühikutele. RIC8A inerakteerub Gα q , 

Gα o , Gα i ja Gα 13 subühikutega, kuid mitte Gα s subühikuga ning RIC8B aktiivsust on 

täheldatud Gα q ja Gα s subühikute juures (Klattenhoff jt., 2003; Tall jt., 2003). Ric8A ja Ric8B 

ekpresseeritakse suurtes kogustes maitsepunga rakkudes ning RIC8A tugevdab 

maitseretseptorite signaliseerimist (Fenech jt., 2009). G-valgud vahendavad signaali maitse 

tuvastamisel, kus RIC8B võimendab maitseretseptorite signaaliülekannet, võimendades 

lõhna-aine retseptorite signaliseerimist olfaktoorsetes sensoorsetes neuronites (Von 

16

Dannecker jt., 2005). RIC8B seondub Gα olf -ga, kuid mitte Gα i2 , RIC8A seevastu seondub 

Gα i2 -ga ja mitte Gα olf -ga (Von Dannecker jt., 2005; Tall jt., 2003). Gα olf on aju-spetsiifiline 

maitsemeele adenülüül-tsüklaasi (AC) stimulaator. Adenülüül-tsüklaas ekpresseerub kõrgelt 

olfaktoorsetes kudedes ja RIC8B osaleb Gα olf sõltuvas odorant-retseptori signaliseerimises. 

On leitud kaks GPCR perekonda, mis on vastavalt seotud teatud magusa, umami ja mõru 

maitsekomponentide tuvastamisega (Chandrashekar jt., 2006) ning on seotud ka RIC8A-ga, 

seega võib RIC8A olla mõru maitse GPCR signaliseerimise üldine modulaator. 

RIC8 on võimeline seonduma adenülüül-tsüklaasi (AC5) N-terminusega (Wang jt., 

2007). AC-d on ensüümid, mis rakuvälise signaali peale viivad läbi ATP muutmist cAMP-ks. 

G-valkude subühikud Gα s ja Gα i on seotud selle rajaga. Gα s strimuleerib cAMP-st sõltuvat 

rada, kus membraanseoseline ensüüm adenülaadi-tsüklaas sünteesib ATP-st cAMP-d ning 

cAMP omakorda aktiveerib proteiinkinaas A, mis reguleerib erinevaid signaaliradasid. Gα i 

subühik inhibeerib AC ensüümi ja selle tulemusena väheneb cAMP-sõltuva proteiinkinaasi 

aktiivsus. RIC8 seondumisel AC5 N-terminusega, toimub Gα i sõltuvalt AC5 aktiivsuse maha 

surumine. RIC8 võib AC5 N-terminusega seondudes reguleerida Gα i retseptorist sõltumatut 

aktivatsiooni. Arvatakse, et RIC8 võib ära hoida AC5 liigsest aktivatsioonist tingitud trauma, 

näiteks südamerabanduse korral (Wang jt., 2007). 

17

2. EKSPERIMENTAALNE OSA 

2.1. Töö eesmärgid 

Varasemalt on näidatud, et NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliinil esineb embrüonaalselt 

mitmeid väärarenguid (Kask 2010, magistritöö). Nendele tulemustele tuginedes püstitati 

antud bakalaureusetöös järgmised eesmärgid: 

Kirjeldada NestinCre;Ric-8 lacZ/lox hiireliini fenotüübi defekte. Kirjeldada ning võrrelda 

vanuses E10.5–E12.5 NestinCre;Ric8 lacZ/lox mutantsete embrüote ja nende heterosügootsete 

pesakonnakaaslaste ning wild type embrüote otsaju arengut, hinnates neuraalsete 

eellasrakkude ja basaalsete eellasrakkude teket ning arvu, mitoosis olevate rakkude arvu ning 

närvisüsteemi arengus esineva apoptoosi rolli väärarengute tekkes. 

2.2. Materjal ja metoodika 

2.2.1. Kasutatud hiireliinid 

Neuroni eellasrakkude spetsiifilise konditsionaalse hiireliini NestinCre;Ric8 lacZ/lox 

loomiseks kasutati järgnevaid hiireliine: 

1. Ric8 lox/lox – transgeenne hiireliin, kus märklaudgeen Ric8 asetseb Cre-rekombinaasi 

poolt äratuntavate LoxP järjestuste vahel. 

2. Ric8 lacZ/+ – lacZ knock-in hiireliin, kus märklaudgeeni Ric8 ühte alleeli on viidud 

reportergeen lacZ, millelt sünteesitava β-galaktosidaasi ekpressioon jäljendab Ric8 

ekpressiooni. 

3. NestinCre – transgeenne hiireliin, kus neurospetsiifiline Cre-rekombinaasi ekpressioon 

on hiire Nestin-promootori kontrolli all. 

Kõikide ristamiste puhul kasutati nn wild-type hiireliinina C57BL/6J liini. Standardsetes 

tingimustes hoitud katseloomadele võimaldati ööpäevaringne puhas söök ja jook. 

Eksperimentides uuritavad katseloomad ohverdati vastavalt Euroopa Liidus kehtestatud 

eeskirjadele (FELASA). 

18

2.2.2. Embrüote dissekteerimine 

Antud bakalaureusetöös kasutatud hiirelooted olid embrüonaalses vanuses E10.5- 

E12.5 arengupäeva. Embrüote vanus määrati 0,5 päeva peale kopulatsiooni emahiirel 

tuvastatud vaginaalse limakorgi järgi, vanuse täpsustamiseks loendati ka somiidipaaride arv. 

Embrüod eemaldati emakasarvedest ja asetati kuivamise vältimiseks fosfaatpuhvrisse 

(phosphate buffered saline, PBS). Puhvris eemaldati ekstra-embrüonaalsed kestad ning 

genotüübi määramiseks eraldati rebukotist tükike. Peale puhastamist asetati embrüod 2 

tunniks fikseeruma 4% PFA (paraformaldehüüd)/PBS lahusesse. 

2.2.3. Embrüote genotüpiseerimine 

Genotüpiseerimisel kasutati DNA materjalina dissekteerimisel eraldatud rebukoti 

koetükki. Koematerjal lüüsiti 100μl lüüsilahuses, mille komponendid olid ddH 2 O; 10 x 

lüüsipuhver (180 mM Tris-HCl (pH 9.0); 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.02% Tween 20) ja proteinaas 

K (187 ng/μl). Koematerjali inkubeeriti üleöö 55°C ning inaktiveeriti 98°C juures 25 minutit. 

Seejärel tsentrifuugiti lüüsilahust 10 minutit 13000 p/min (Biofuge pico). Saadud genoomset 

DNA materjali kasutati polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR). 

PCR-i läbiviimisel olid kasutusel järgnevad alleel-spetsiifilised praimerid: 

Ric8 lacZ/+ LacZ300 5´ - CGCATCGTAACCGTGCATCT - 3´ 

RicPTGgenoF 5´ - CTCTCCCAGCATCCCTCAC – 3´ 

PTG(Ric8)in1rev 5´ - CACACCCCAGCCGAGTTG - 3´ 

NestinCre +/- 

NestinCre1 5´ - AGGTGTAGAGAAGGCACTTAGC - 3´, 

NestinCre2 5´ - CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG- 3´ 

Ric8 lox/lox 

RicCregenoF 5´ - GGTAGGGCTCAATGTTGG - 3´ 

RicCregenoR 5´- GCCAAACAATCTCTCGAACC - 3´ 

19

PCR reaktsioonisegus kasutati järgmisi komponente: 1 x (NH 4 ) 2 SO 4 puhver (Fermentas), 1.5 

mM MgCl 2 (Fermentas), 0.2 mM dNTP, praimerid 0,25 μM, Taq polümeraas 0.02 U/μl, 1 μl 

DNA ja ddH 2 O. Reaktsiooni kogumaht oli 10μl ning PCR teostati masinal 

Biometra®TProffessional Thermocycler. 

PCR-i reaktsiooni läbiviimiseks seadistati programm järgnevatele tingimustele: 

95°C 5 minutit 

95°C 30 sekundit 

58°C 40 sekundit 32 tsüklit 

72°C 1 minut 

72°C 10 minutit 

4°C paus 

Saadud PCR tulemusi analüüsiti geeleletroforeesil, kus reaktsiooniprodukti jooksutati 1% või 

1,5%-lises TAE (Tris-atsetaat-EDTA) agaroosgeelil ning kontrolliks kasutati DNA 

pikkusmarkerina 1kb DNA Ladderít (Fermentas). 

2.2.4. Parafiinlõikude valmistamine 

Lõikude valmistamiseks ja immuunohistokeemilise analüüsi teostamiseks sisestati 

hiirelooted parafiini. Dissekteerimisel 4% PFA/PBS lahuses fikseeritud hiirelooted pesti kolm 

korda 15 minutit PBS lahuses. Sellele järgnes dehüdreerimine tõusva kontsentratsiooniga 

etanooli lahuses (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% ja kaks korda 100% etanool) üleöö 4°C 

juures. Peale veetustamist immutati embrüosid kaks korda 1,5 tundi ksüleenis. Seejärel asetati 

need 100% parafiini ning inkubeeriti 60°C juures 1 tund, mille järel korrati puhta parafiiniga 

inkubeerimist 2h. Hiirelooted sisestati puhta parafiiniga eelnevalt glütserooliga määritud 

plastvormidesse, jahutati kiiresti külmaplaadil ning säilitati 4°C juures. 

Parafiinplokkidest lõigati mikrotoomiga MICROM Ergostar HM200 8μm 

seerialõigud, mis asetati polülüsiiniga kaetud alusklaasidele (Menzel-Gläser). Lõikudel lasti 

kuivada ja kinnituda 24 tundi 37°C juures ning säilitati 4°C juures. 

20

2.2.5. Immunohistokeemiliste preparaatide valmistamine 

Mitoosi, apoptoosi ja basaalsete eellasrakkude uurimiseks teostati 

immunohistokeemiline analüüs. Parafiinlõikudega klaasid asetati lõikude tugevaks 

kinnitumiseks 30 minutiks 60°C juurde. Sellele järgnes deparafiniseerimine ksüleeniga kaks 

korda 5 minutit, mille peale rehüdreeriti koelõigud langeva kontsentratsiooniga etanooli 

lahustes. Kõigepealt leotati lõike 100% etanoolis kaks korda 3 minutit, seejärel 96%; 90%; 

80%; 70% etanoolis kaks korda 1 minut. Fikseerimisel tekkinud valkudevaheliste ristsidemete 

lõhkumiseks kuumutati alusklaase 30 minutit tsitraatpuhvris (10mM; pH=6.0) 96°C juures. 

Peale kuumutamist asetati tsitraatpuhvris olevad alusklaasid toatemperatuurile 20 minutiks 

jahtuma, millele järgnes 20 minutit klaaside pesu 0,1% TritonX/PBS lahuses. Antikeha 

mittespetsiifilise seondumise vältimiseks teostati lõikudele 1h blokeerimine kitse seerumiga 

(5% kitse seerum; 1% BSA/PBT (PBS; 20% Tween20)). Järgnevalt inkubeeriti koelõike 

üleöö pimedas niisutuskambris 4°C juures primaarse antikehaga: mitoosis olevate rakkude 

märkimiseks kasutati fosfo-histooni (PH3) vastast küülikus valmistatud polüklonaalset 

antikeha (lahjendus 1:1000) (Abcam); basaalsete eellasrakkude märgistamiseks kasutati Tbr2 

vastast küülikus valmistatud polüklonaalset antikeha (lahjendus 1:500) (Abcam); apoptoosi 

uurimiseks märgistati rakud kaspaas-3 vastase küülikus valmistatud polüklonaalse antikehaga 

(lahjendus 1:600) (R&D Systems). Negatiivsete kontroll-lõikude inkubeerimine toimus ilma 

primaarse antikehata. 

Järgmisel päeval pesti alusklaase PBT lahusega ning inkubeeriti sekundaarse 

antikehaga (Alexa 594 goat aRabbit) 1 tund 4°C juures. Seejärel pesti koelõike PBT lahusega 

kaks korda 10 minutit, millele järgnes pesu PBS-ga kaks korda 5 minutit. Peale pesu värviti 

rakutuumad DAPI reagendiga 3 minutit. Kõige lõpuks pesti klaasid taaskord mitu korda PBSga 

ning sulundati Fluoromount (Calbiochem) geeliga, millele asetati ettevaatlikult katteklaas. 

Kuivamise vältimiseks kaeti katteklaasi ääred läbipaistva lakiga. 

2.2.6. Whole-mount embrüote ja koelõikude pildistamine 

Bakalaureusetöös uuritud whole-mount embrüosid vaadeldi ning pildistati Leica 

M165FC mikroskoobiga ning kujutiste saamiseks kasutati Olympus XC50 kaamerat. 

Histoloogilisi preparaate analüüsiti mikroskoobiga Olympus BX51 ning kaameraks Olympus 

DP71. Piltide töötlemiseks kasutati arvutiprogrammi Adobe Photoshop CS5.1. 

21

2.2.7. Rakkude loendamine programmiga CellProfiler 2.0 

Immunohistokeemilisel analüüsil tehtud otsaju ja neuraaltoru piltidelt rakkude 

loendamiseks kasutati programmi CellProfiler 2.0 (r11710). Otsaju puhul võeti piirkonnaks 

700x700 ruutpiksli suurune ala, kus ruudu algpunktiks (x; y) oli otsaju vatsakese ülemise 

käänaku luumeni poolne äär ja lõpp-punktiks määrati vastavalt (x+700; y+700) suurune ala. 

Esmalt loeti DAPIga märgistatud rakutuumade koguarv ja seejärel samast piirkonnast 

antikehaga (PH-3, Tbr2 ja kaspaas-3) märgistatud positiivsete rakkude arv ning määrati nende 

suhe. Neuraaltoru puhul loendati rakutuumad ning PH-3, Tbr2 ja kaspaas-3 positiivsed rakud 

kogu neuraaltoru ulatuses. Intensiivsuse lävendiks määrati (lower and upper bounds on 

threshold) 0.1-1 ning raku diameetri piirid (pikslid) määrati vastavalt raku suurusele. Kuna 

vanuseliselt ei varieerunud rakkude suurus otsaju piirkonnas, siis määrati analüüsil kõikides 

vanustes (E10.5, E11.5 ja E12.5) raku diameetriks 7-45 pikslit. Kuna aga neuraaltoru rakkude 

suurus kasvas sõltuvalt vanusest, siis neuraaltoru analüüsil määrati vanuses E10.5 raku 

diameetriks 7-45 pikslit ja vanustes E11.5 ja E12.5 9-45 pikslit. 

22

2.3. Tulemused 

2.3.1. NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliini üldine fenotüüp 

Käesolevas bakalaureusetöös uuriti neurospetsiifilisi Ric8 mutantseid konditsionaalseid 

NestinCre;Ric8 lacZ/lox (edaspidi nimetatud NestinRic8 -/- ) embrüoid vanuses E10.5-E12.5. 

Embrüote dissekteerimisel märgiti üles pesakonna suuruse arv, absorbeerunud järglased ning 

NestinRic8 -/- embrüod ja nende pesakonnakaaslased genotüpiseeriti alleelspetsiifilise PCR-ga. 

Embrüote genotüpiseerimisel avaldunud statistika polnud vastavuses klassikalisele Mendeli 

seadusele (1/4 järglastest peaks olema konditsionaalsed NestinRic8 -/- loomad). 

Identifitseeritud NestinRic8 -/- embrüoid oli uuritud pesakondades (E10.5-E12.5, n=4) ca 28% 

(Tabel 1), mis näitab, et enamus NestinRic8 -/- on võimelised arenema E10.5-E12.5. Samas 

absorbeerunud järglaste arv (ca 17 % genotüpiseeritud embrüotest) vanuse kasvades suureneb 

(E10.5-E12.5, n=6; Tabel 1), mis viitab varasele embrüonaalsele suremusele. 

Tabel 1. Järglaste jaotumine pesakonnas 

Pesakonna 

Vanus 

Genotüpiseeritud 

embrüote arv 

NestinRic8 -/- 

embrüote arv 

Absorbeerunud 

embrüote arv 

E10.5 5 2 1 

E10.5 12 4 0 

E11.5 9 2 3 

E12.5 9 2 2 

NestinCre;Ric8 lacZ/lox (edaspidi nimetatud NestinRic8 -/- ) loodete fenotüübiliste iseärasuste 

kirjeldamiseks võrreldi neid normaalsete pesakonnakaaslastega (NestinCre +/- ;Ric8 lox/+ ; 

NestinCre -/- ;Ric8 lacZ/lox ; NestinCre -/- ;Ric8 lox/+ ; edaspidi nimetatud NestinRic8 +/- ) ja samas 

embrüonaalses vanuses wild type embrüotega. Analüüsi tulemusena selgus, et vanuses E10.5- 

E12.5 dissekteeritud NestinRic8 -/- embrüote fenotüüp oli küllaltki varieeruv, eelkõige vanuses 

E10.5, kus avastati tugevate väärarengutega isendeid. Osad (grupp I kuuluvad embrüod) 

NestinRic8 -/- embrüod (n=2; kaks pesakonda) olid võrreldes teiste NestinRic8 -/- mutantidega 

(grupp II) ja NestinRic8 +/- kontroll-embrüotega tõsisemate väärarengutega (joonis 3D). Need 

embrüod olid oluliselt väiksemad ning neil esinesid mitmed neurodefektid: ajuvatsakesed 

(otsajupõis, keskajupõis, tagaajupõis) olid väiksemad ja ebanormaalselt kokkusurutud 

23

morfoloogiaga (joonis 3D) võrrelduna wild type (joonis 3A) ja NestinRic8 +/- embrüotega 

(joonis 3B). Lisaks on ühel NestinRic8 -/- embrüol täheldatav neuraaltoru sulgumise defekt 

keskaju ning otsaju posterioorses piirkonnas (joonis 3D; punane nooleots). NestinRic8 -/- 

embrüotel esinevad veel mõningad näopiirkonna arengudefektid nagu ninapiirkonna ja 

lõpuskaarte ebanormaalne morfoloogia (joonis 3D). Teise gruppi kuuluvad E10.5 NestinRic8 - 

/- 

embrüod olid küll mõnevõrra väiksemad kui NestinRic8 +/- embrüod, kuid nende üldine 

fenotüüp oli kontroll-embrüotele sarnane (joonis 3C). Embrüonaalses vanuses E11.5 ja E12.5 

suuri fenotüübilisi väärarenguid ei tuvastatud, NestinRic8 -/- embrüod sarnanesid üldiselt 

NestinRic8 +/- embrüotega (joonis 6B, C ja joonis 8B, C). Samas abrosbeerunud järglaste hulk 

(E10.5-E12.5) kasvas vanemates vanustes (Tabel 1). 

Joonis 3. Neurospetsiifilise NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliini fenotüübi analüüs. (A) wild-type embrüo (+/+), 

(B) NestinRic8 +/- embrüo (+/-) ja (C, D) NestinRic8 -/- (-/-) vanuses E10.5 vaadelduna vasakult poolt; punane 

nooleots tähistab neuraaltoru sulgumatuse defekti. Lühendid: Tec, otsaju; Mec, keskaju; Hb (hindbrain), tagaaju. 

Mõõtkava 1mm. 

2.3.2. E10.5 NestinRic8 -/- embrüote otsaju immunohistokeemiline analüüs 

E10.5-E12.5 vanuste NestinRic8 -/- embrüote morfoloogiliste-anatoomiliste iseärasuste 

täpsemaks analüüsimiseks teostati immunohistokeemiline analüüs embrüote peaaju 

piirkonnast tehtud koelõikudele. Analüüsiti kolme erinevat rakupopulatsiooni embrüonaalses 

otsajus (telencephalon) – basaalsed eellasrakud (markeriks kasutati Tbr2 vastast antikeha, mis 

tunneb ära basaalsete eellasrakkude tuumas oleva transkriptsioonifaktori TBR2), mitoosis 

olevad rakud (markeriks fosfo-histoon-3 (PH-3) vastane antikeha), ja apoptoosis olevad rakud 

(markeriks kaspaas-3 (caspase-3) vastane antikeha). Punase punktiiriga (joonis 4A) on ära 

tähistatud parafiinlõikude lõikamise frontaalne suund. Joonisel 4F; 4J; 4N on punase ruuduga 

24

ära märgitud, mis otsaju piirkonda rakkude loendamisel uuriti. DAPIga märgitud tuumadest 

loendati kõik rakud kokku ning võeti positiivsete rakkude suhe, mis toodi välja 

tulpdiagrammil protsentidena (joonis 5; § 2.2.7.). 

E10.5 olid Tbr2 positiivsed rakud (joonis 4E-H) detekteeritavad areneva otsaju 

korteksi basaalsemas osas, kus nad moodustavad subventrikulaartsooni. Tbr2 positiivsete 

rakkude paiknemise osas wild-type embrüotel (joonis 4E), NestinRic8 +/- embrüotel (joonis 4F) 

kui ka NestinRic8 -/- mutantsetel embrüotel (joonis 4G; 2H) muutusi ei olnud, vaid üksikuid 

rakke oli näha apikaalsemal poolel. Tbr2 positiivsete rakkude loendamisel otsajust tehtud 

lõikudelt statistiliselt olulist erinevust NestinRic8 +/- (n=2) ja grupp II NestinRic8 -/- (n=2) 

embrüote vahel ei leitud (F=0.490; P=0.214; joonis 5). Samas grupp I kuuluvatel NestinRic8 -/- 

embrüotel (n=2) oli Tbr2 positiivseid rakke märgatavalt vähem kui pesakonnakaaslastel 

(F=0.047; P

apoptootiliste rakkude arvu osas võrreldud gruppide vahel puudus (wt. embrüo (n=1) ja grupp 

II mutantsed embrüod (n=2), F=0.232; P=0.813; wt. ja grupp I mutantsed embrüod (n=2); 

F=0.172; P=0.741; kontroll-embrüod (n=2) ja grupp II embrüod (n=2); F=0.434; P=0.834; 

kontroll-embrüod ja grupp I embrüod (n=2); F=0.629; P=0.923; joonis 5). 

Joonis 4. E10.5 embrüote otsajudest tehtud frontaallõikude immunohistokeemiline analüüs. (A) wild-type 

embrüo (+/+), (B) NestinRic8 +/- embrüo (+/-) ja (C, D) Nestin;Ric8 -/- embrüo (-/-). (E-H) Basaalsed eellasrakud 

märgistatud Tbr2 (punane), (I-L) mitootilised rakud märgistatud PH-3 (punane), (M-P) apoptootilised rakud 

26

märgistatud kaspaas-3 (punane). DAPI märgistab rakkude tuumi (sinine). Punase punktiiriga on märgistatud 

frontaaltasapind otsaju piirkonnast, kust lõigud tehti. Punane ruut tähistab piirkonda, kust loendati vastavaid 

immuunreaktsiooni andvaid fluoresseeruvaid rakke ning DAPI-ga märgistatud rakkude tuumi (rakkude koguarv). 

Mõõtkava: (A-D) 1mm ja (E-P) 100 μm. 

Joonis 5. Tbr2, PH-3 ja caspase-3 positiivsete rakkude osakaal protsentides DAPIga märgistatud kogu 

rakkude arvust embrüonaalses vanuses E10.5. Wild type (+/+); NestinRic8 +/- embrüo (+/-); II grupi 

Nestin;Ric8 -/- embrüo (-/-); I grupi Nestin;Ric8 -/- isend (-/- *). 


E11.5 vanuste NestinRic8 -/- embrüote morfoloogiliste-anatoomiliste iseärasuste 

täpsemaks analüüsimiseks teostati immuunohistokeemiline analüüs samuti kolme erineva 

rakupopulatsiooni kohta embrüonaalses otsajus (telencephalon) – basaalsed eellasrakud 

(Tbr2), mitoosis olevad rakud (PH-3) ja apoptoosis olevad rakud (caspase-3). 

Embrüonaalses vanuses E11.5 ei esinenud tõsiseid väärarenguid, fenotüübiliselt olid loomad 

sarnased. NestinRic8 +/- pesakonnakaaslane oli pisut väiksem võrreldes NestinRic8 -/- mutantse 

embrüoga (joonis 6B-C), mis oli tingitud pesakonnasisesest vanuselisest erinevusest 

(NestinRic8 +/- somiitide arv oli 43, NestinRic8 -/- somiitide arv oli 45 somiiti). E11.5 joondusid 

Tbr2 positiivsed rakud (joonis 6D-F) areneva otsaju korteksi basaalses osas paiknevas 

subventrikulaartsoonis. Tbr2 positiivsete rakkude paiknemise osas wild-type embrüotel 

(joonis 6D), NestinRic8 +/- embrüotel (joonis 6E) kui ka NestinRic8 -/- mutantsetel embrüotel 

(joonis 6F) muutusi ei olnud. Otsajult analüüsitud lõikudelt Tbr2 positiivsete rakkude 

27

loendamisel statistiliselt olulist erinevust NestinRic8 +/- (n=2) ja NestinRic8 -/- (n=2) embrüote 

vahel ei leitud (F=0.719; P=0.884; joonis 7). Basaalsete eelasrakkude hulk wild type embrüol 

(n=1) ei olnud märgatavalt erinev võrreldes NestinRic8 -/- embrüoga (F=0.257; P=0.826; joonis 

7). 

Vanuses E11.5 joondusid fosfo-histoon (PH-3) positiivsed mitoosis olevad rakud 

otsaju apikaalsemas luumeni poolses ventrikulaartsooni piirkonnas, kus üksikud rakud 

paiknesid basaalsemal alal (joonis 6G-I). PH-3 positiivsete rakkude paiknemises märgatavaid 

muutusi NestinRic8 -/- embrüol (joonis 6I) ei täheldatud võrrelduna wild-type (joonis 6G) ja 

NestinRic8 +/- embrüoga (joonis 6H). Statistika näitas, et PH-3 positiivsete rakkude 

loendamisel puudus statistiliselt oluline erinevus NestinRic8 +/- (n=2) ja NestinRic8 -/- (n=2) 

embrüote vahel (F=0.780; P=0.938; joonis 7). Sarnaselt ka wild-type embrüo (n=1) ning 

NestinRic8 -/- mutantse embrüo otsaju piirkonnas mitoosis olevate rakkude arvus olulisi 

erinevusi ei esinenud (F=0.420; P=0.219; joonis 7). 

Apoptootilisi rakke esines E11.5 vanuses otsaju piirkonnas minimaalsel määral 

kõikides vaadeldud embrüotes (joonis 6J-L). Analüüsitud lõikudest esines vaid mõnel lõigul 

üksikud apoptoosis olevad rakud. Apoptootiliste rakkude loendamine näitas, et puudus 

statistiliselt oluline erinevus võrreldud gruppide vahel (wt. (n=1) ja NestinRic8 -/- embrüo 

(n=2) F=0.312; P=0.912; kontroll-embrüo (n=2) ja NestinRic8 -/- embrüo (n=2) F=0.190; 

P=0.319; joonis 7). 

28


embrüo (+/+), (B) NestinRic8 +/- embrüo (+/-) ja (C) Nestin;Ric8 -/- embrüo (-/-). (D-F) Basaalsed eellasrakud 

märgistatud Tbr2 (punane), (G-I) mitootilised rakud märgistatud PH-3 (punane), (J-L) apoptootilised rakud 


frontaaltasapind otsajupiirkonnast, kust lõigud tehti. Punane ruut tähistab piirkonda, kust loendati vastavaid 


Mõõtkava: (A-C) 1mm ja (D-L) 100 μm. 

29


rakkude arvust embrüonaalses vanuses E11.5. Wild type (+/+); NestinRic8 +/- embrüo (+/-); Nestin;Ric8 -/- 

embrüo (-/-). 


Embrüonaalses vanuses E12.5 ei esinenud tõsiseid väärarenguid, fenotüübiliselt olid 

kõik loomad sarnased. E12.5 vanuses, sarnaselt E10.5 ja E11.5 vanuste embrüotega, Tbr2 

positiivsed basaalsed eellasrakud paiknesid subventrikulaartsoonis kõigil uuritud embrüotel 

(joonis 8D-F). Basaalsete eellasrakkude rakkude loendamisel statistiliselt olulist erinevust 

NestinRic8 +/- (n=1) ja NestinRic8 -/- (n=1) embrüote vahel ei leitud (F=0.888; P=0.284; joonis 

9). Samas Tbr2 positiivsete rakkude hulk wild type embrüol oli märgatavalt suurem kui 

NestinRic8 -/- embrüol (F=0.895; P

L), mida kinnitas ka statistiline analüüs (wt. (n=1) ja NestinRic8 -/- embrüo (n=1) F=0.608; 

P=0.853; kontroll-embrüo (n=1) ja NestinRic8 -/- embrüo (n=1) F=0.991; P=0.674; joonis 9). 


embrüo (+/+), (B) NestinRic8 +/- embrüo (+/-) ja (C) Nestin;Ric8 -/- embrüo (-/-). (D-F) Basaalsed eellasrakud 

märgistatud Tbr2 (punane), (G-I) mitootilised rakud märgistatud PH-3 (punane), (J-L) apoptootilised rakud 


31

frontaaltasapind otsajupiirkonnast, kust lõigud tehti. Punane ruut tähistab piirkonda, kust loendati vastavaid 


Mõõtkava: (A-C) 1mm ja (D-L) 100 μm. 


rakkude arvust embrüonaalses vanuses E12.5. Wild type (+/+); NestinRic8 +/- embrüo (+/-); Nestin;Ric8 -/- 

embrüo (-/-). 

2.3.5. NestinRic8 -/- embrüote neuraaltoru immunohistokeemiline analüüs 

Antud bakalaureusetöös analüüsiti ka embrüonaalseid neuraaltorusid. 

Immunohistokeemiline analüüs näitas, et arenguperioodil E10.5-E12.5 kõikides vaadeldud 

genotüüpides mitootiliste rakkude paigutus neuraaltorus oli sarnane ja normaalne (joonis 10 

G-I). Mitootiliste rakkude loendamisel neuraaltorus selgus, et vanuses E10.5 on wild type 

embrüol mitootilisi rakke vähem kui NestinRic8 -/- embrüotel (F=0.046; P

embrüoga oli NestinRic8 -/- embrüol kaspaas-3 positiivseid rakke oluliselt rohkem (wt. (n=1) ja 

NestinRic8 -/- embrüo (n=1) F=0.306; P

Joonis 11. PH-3 positiivsete rakkude osakaal protsentides DAPIga märgistatud kogu rakkude arvust 

neuraaltorus embrüonaalses vanuses E12.5. Wild type (+/+); NestinRic8 +/- embrüo (+/-); Nestin;Ric8 -/- 

mutantne embrüo (-/-). 

2.4. Arutelu 

Katsed erinevate mudelorganismidega on näidanud, et raku jagunemise molekulaarsed 

mehhanismid, mis määravad raku saatuse (polaarsuse, diferentseerumise ning mitoosikäävi 

orientatsiooni) on loomariigis konserveerunud (Knoblich, 2001 rev). Käävi positsiooni ja selle 

seotust raku korteksiga kontrollib valgukompleks NuMA-LGN-Gα:GDP (Siller ja Doe, 

2009). NuMA dünaamiline vabanemine LGN-st reguleerib astraalsete mikrotuubulite 

tõmbejõudusid rakus (Du ja Macara, 2004). Antud bakalaureusetöös uuritud GEF RIC8 on 

võimeline samuti seda kompleksi ära tundma. Gα i valgud ankurdavad LGN, NuMA ja 

düneiini rakukorteksile, joondades mitoosikäävi imetaja metafaasi rakkudes. RIC8 GEF-i 

aktiivsus vabastab katalüütiliselt Gα i -GTP vormi ja põhjustab sellega NuMA ja LGNi 

vabanemise (Tall ja Gilman, 2005; Tall jt., 2003). Lisaks on näidatud, et RIC8 taseme 

häirimine rakus mõjutab düneiini, LGN ja NuMA lokalisatsiooni rakukorteksis. RIC8 

vähendamine põhjustab ka mitoosi pikenemist, juhuslikku mitoosiaresti ja vähendab 

mitoosikäävi liikumist (Woodard jt., 2010). Sarnaselt on näidatud nematoodi embrüonaalses 

arengus ja äädikakärbse närvisüsteemi arengus, et RIC8 osaleb koos oma 

seondumispartneritega rakkude asümmeetrilisel jagunemisel, reguleerides positiivselt Gα i 

aktiivsust, tsentrosoomide liikumist ja käävi positsioneerimist ning mitoosikäävi tõmbejõudu 

34

(Miller & Rand 2000, Miller jt., 2000; Afshar jt., 2004; Couwenbergs jt., 2004; David jt., 

2005; Hampoelz jt., 2005; Wang jt., 2005). 

Ehkki peamised molekulaarsed komponendid (nt. G valgud, LGN/AGS3, NuMa, Par 

valgud) ja protsessid, mis reguleerivad asümmeetrilist/sümmeetrilist rakujagunemist on 

konserveerunud nii nematoodis, kärbses kui ka selgroogsetes, on need paljuski veel uurimata 

ja ebaselged. Üheks huvitavaks ja enimkasutatud mudeliks imetaja asümmeetrilise 

rakujagunemise uurimiseks on neurogenees ja neokorteksi areng. Neurogeneesi alguses E9.0- 

E10.0 muutavad neuroepiteeli rakud radiaalgliia rakkudeks, mis läbivad iseuuenevaid 

tüvirakkude sarnaseid asümmeetrilisi jagunemisi, produtseerides neuroneid või basaalseid 

eellasrakke (Noctor jt., 2004; Noctor jt., 2007). 

Antud bakalaureusetöös kasutati imetajate neurogeneesi uurimiseks konditsionaalset 

hiireliini (NestinRic8 -/- ), kus neuraalsetest eellasrakkudest oli Ric8 spetsiifiliselt välja 

lülitatud. Hiire Ric8 ekspressioonimuster vanuses E9.5-E12.5 on neurospetsiifiline, olles 

avaldunud näiteks kraniaalganglionites, sümpaatilistes ganglionites, neuraaltorus ja arenevates 

ajupiirkondades (Tõnissoo jt., 2003). RIC8 seondumispartnerid, Gα i ja LGN, on samuti 

arenevas hiire närvisüsteemis ekspresseeritud. Näidatud on, et nad lokaliseeruvad areneva 

ajukorteksi ventrikulaartsoonis neuraalsetes eellasrakkudes (Konno jt., 2008; Murai jt., 2010). 

LGN inaktiveerimine põhjustab hiire ja kana kortikogeneesis mitoosikäävi orientatsiooni 

häireid, mille tulemusena tekib varajases proliferatiivses sümmeetrilises planaarses 

jagunemises ebanormaalselt paiknevaid basaalseid eellasrakke. Samas see ei takista hilisemas 

arengus neuronite teket (Konno jt., 2008; Morin jt., 2007). Gα i -valgu välja lülitamisel 

neurogeneesi varajases arenguetapis tekivad küll eellasrakud, kuid hilisemas arengufaasis jääb 

neid ebavõrdselt ja häiritud on hilisemate neokorteksi kihtide teke (Murai jt., 2010). See võib 

olla tingitud mitoosi aeglustumisest. Mitoos toimub varajases arengus ja rakud jõuavad 

õigetesse kohtadesse, kuid aja möödudes muutuvad ka signaalid ümbritsevast keskkonnast. 

Eellasrakkude populatsiooni kõrghetk on E14.5-15.5 (Murai jt, 2010) ja kui mitoosi pikkus on 

häiritud, siis tekib vähem eellasrakke ning järgnevate jagunemistega ei jätku piisavalt 

eellasrakke viimaste kihtide tekkeks, samas diferentseerumisele suunavaid signaale esineb 

rohkem. 

Milline roll on RIC8 närvisüsteemi arengus, on suuresti teadmata. Varasemalt on Keiu 

Kask oma magistritöös näidanud, et Ric8 välja lülitamine neuraalsetest eellasrakkudest 

põhjustab embrüonaalset letaalsust ja küllaltki varieeruvaid neuraalseid arengudefekte. 

Tuginedes kirjanduse andmetele RIC8 võimalike rollide osas, sai püstitatud antud töö 

eesmärgiks uurida lähemalt NestinRic8 -/- embrüote kortikogeneesi vanuses E10.5-E12.5. 

35

Selline vanus valiti seetõttu, et sellel perioodil esinevad NestinRic8 -/- embrüotel kõige 

raskemad neuraalsed defektid (nt. neuraaltoru sulgematus, ajupõite defektid, näopiirkonna 

defektid). Kirjanduses on näidatud, et NestinCre transgeeni ekpressioon algab embrüonaalses 

vanuses E7.5 (Dubois jt., 2006). Keiu Kase magistritöös näidati, et NestinCre ekspresseerub 

alates E9.0. Vanuses E10.5 esinevate tõsiste väärarengute ja edasises vanuses absorbeerunud 

järglaste arvu tõus võib olla seotud sellega, et Ric8 lülitatakse välja E9.0, millal leiab aset ka 

neuraaltoru sulgumine ning neuraalharja rakkude migratsioon (Yoshida jt., 2008). Vanuses 

E10.5 ilmnevad mõningad väärarengud ka näo piirkonnas. Hiljutine uuring Xenopus 

tropicalis mudelil on näidanud tugevalt Ric8 ekspressiooni neuraalharja rakkudes just enne ja 

pärast rakkude migratsiooni (Maldonado jt., 2011). Täiskasvanud konnal on Ric8 

ekspressioon olemas neuraaharja derivaatides – kõrva piirkonnas ning näo-kolju kaartes (otic 

capsule and the craniofacial arches), millest on järeldatud, et Ric8 võib omada X.tropicalis’e 

embrüogeneesis rolli näokolju arengus (Maldonado jt., 2011). Imetaja kraniaalse neuraalharja 

rakud moodustuvad neuraalplaadi serva ning epidermaalse ektodermi vahel ning migreeruvad 

üle organismi laiali (Knecht ja Bonner-Fraser, 2002). Neuraalharja rakud migreeruvad 

lainetena (Yoshida jt., 2008) ning kraniaalse neuraalharja rakud jõuavad oma sihtpunkti 

vanuses E9.5-E10.5, mis mõjutavad näo ja kolju arengut (Knecht ja Bonner-Fraser, 2002). 

Kas Ric8 välja lülitamine neuraalsetest eellasrakkudest võib häirida neuraalharja rakkude 

saatust ning migratsiooni oma õigesse kohta, ei ole teada, kuid NestinRic8 -/- embrüote 

fenotüüp viitab võimalikule RIC8 osalusele selles protsessis. 

Kohati üpris raskekujulised arengudefektid NestinRic8 -/- E10.5-E12.5 embrüotel 

viitavad võimalikule indutseeritud apoptoosile kudedes. Arengu käigus on rakutüüpide 

spetsialiseerumine tihedas ajalises ja ruumilises seoses rakkude proliferatsiooni ning 

apoptoosiga, mis reguleerib rakkude arvu. Varasemad uurimistööd näitavad, et apoptoosi 

vahendusel eemaldatakse neurogeneesis 50% neuronitest ja gliiarakkudest (Lossi ja Merighi, 

2003; Nijhawan jt., 2000). Mitmes aju piirkonnas esineb kaks järjestikust rakusurma perioodi 

– esimene leiab aset enne neurogeneesi algust, teine on seotud postmitootiliste neuronitega 

(Lossi jt., 2002c). Hiire embrüos kortikaalse neurogeneesi (E10-E18) käigus on rakusurma 

tipp (70%) vanuses E14 ja sellele järgneb kahanemine kuni vanuseni E18 (Lossi ja Merighi, 

2003). Antud töös oli üks eesmärke tuvastada, kas RIC8 puudumine neuraalsetest 

eellasrakkudest põhjustab suurenenud apoptoosi määra neuraalsetes kudedes. Katsete 

tulemusena selgus, et NestinRic8 -/- hiirtel apoptootiliste rakkude hulk otsaju korteksis oli 

võrreldav normaalsete pesakonnakaaslastega ja wt embrüotega ning võib väita, et 

neurogeneesi alguses vanuses E10.5-E12.5 esineb otsaju neuroepiteelis rakusurma väga 

vähesel määral. Lisaks selgus, et E12.5 võimendus apoptoos perifeersesse närvisüsteemi 

36

kuuluvates spinaalganglionites. Varasemalt on näidatud, et nii Ric8 (Tõnissoo jt., 2003) kui 

NestinCre (Kask 2010, magistritöö) ekspresseerub arenevas perifeerses närvisüsteemis 

spinaalganglionites. Apoptootiliste rakkude hulk NestinRic8 -/- embrüote spinaalganglionites 

märkimisväärselt ei erinenud pesakonnakaaslastest. 

RIC8 üks enim uuritud bioloogiline funktsioon on osalemine asümmeetrilise 

rakujagunemise kujunemisel. Küsimusele, kas ka NestinRic8 -/- embrüotel on neurogeneesis 

asümmeetriline/sümmeetriline rakujagunemine ja basaalsete eellasrakkude teke häiritud, püüti 

anda vastus analüüsides otsaju struktuure immuunohistokeemiaga. Erinevalt RIC8 

seondumispartner LGN töödest, kus on näidatud, et Lgn inaktiveerimine põhjustab hiire ja 

kana kortikogeneesi varajases proliferatiivses planaarses jagunemises ebanormaalselt 

paiknevaid basaalseid eelasrakke (Konno jt., 2008; Morin jt., 2007), ei olnud sarnast tendentsi 

NestinRic8 -/- embrüote puhul märgata. E10.5 tugevamate defektidega embrüotel (grupp I) oli 

küll basaalseid eellasrakke tunduvalt vähem kui pesakonnakaaslastel. Samas proliferatiivseid 

neuraalseid eellasrakke oli NestinRic8 -/- embrüotel rohkem kui pesakonnakaaslastel. Hiljuti on 

näidatud, et vähendatud RIC8 ekspressiooni korral esineb mitoosi pikenemist ja juhuslikku 

mitoosiaresti (Woodard jt., 2010). Sellele tuginedes võib sepkuleerida, et ka Ric8 puudulikud 

neuraalsed eellasrakud võivad mitoosi faasis kauem viibida, mistõttu on mitoosis olevaid 

rakke ventrikulaartsoonis märgata rohkem ja basaalseid eellasrakke ei jõua tekkida kontrollembrüotega 

samas hulgas. Kindlasti oleks edaspidi vaja statistiliselt rohkem embrüoid 

analüüsida, et välistada individuaalset erinevust. Mõneti on probleemiks ka see, et pesakonna 

piires võivad embrüod vanuseliselt varieeruda, mistõttu on nende täpne võrdlemine 

raskendatud. Antud töös kasutada olnud embrüote analüüsil selgus, et grupp II kuuluvad 

NestinRic8 -/- pigem sarnanevad oma kontroll-pesakonnakaaslastele, samas kui grupp I 

NestinRic8 -/- embrüotel on mitmeid iseärasusi. Vanemad E11.5-E12.5 NestinRic8 -/- embrüod 

kuulusid pigem grupp II. Vanemates vanustes grupp I kuuluvad tugevate defektidega 

embrüod on juba enamasti surnud. Immuunohistokeemilise analüüsiga ei selgunud RIC8 

otsene osalus hiire otsaaju korteksi asümmeetrilises rakujagunemises. Hiljuti sooritatud 

uuringutes MDCK (madine-darby canine kidney) rakkudega selgus, et Gα i -LGN vahendatud 

käävi orientatsioon ei pruugi viia raku asümmeetrilise jagunemiseni, vastupidiselt Drosophila 

ja C.elegans’i mudelitele, kus valgukompleks omab kriitilist rolli käävi positsioneerimisel ja 

asümmeetrilises jagunemises (Xiao jt., 2012). Imetajas on Gα i ja LGN vajalikud mitoosikäävi 

positsioneerimiseks, kuid veel pole teada, kas see viib asümmeetrilise jagunemiseni. Seega 

RIC8, mis on seotud G-valguga omab küll olulist rolli mitoosikäävi positsioneerumises, kuid 

see ei pruugi olla rakkude asümmeetrilise jagunemise põhjuseks. Antud töö kontekstis oleks 

huvitav uurida vanemaid embrüonaalseid vanuseid, kui toimuvad uued asümmeetrilised 

37

jagunemised ja diferentseerumised. Keskenduda tuleks ka mitoosikäävi asendile, märkides ära 

näiteks tsentrosoomid (γ-Tubulin), mille abil oleks võimalik määrata raku jagunemise tüüp ja 

ka mitoosifaas. Mõõtes ära nurga jagunemistasapinna ja ventrikulaarse tasapinna vahel on 

võimalik määrata neuraalse eellasraku jagunemistüüp (Konno jt., 2007). 

38

KOKKUVÕTE 

Rakkude mitmekesisus tagatakse kõrgelt reguleeritud eellasrakkude sümmeetriliste ja 

asümmeetriliste jagunemistega. Asümmeetrilisel jagunemisel omavad olulist rolli 

heterotrimeersed G-valgud, mis osalevad käävi orientatsiooni kujunemisel. G-valkude 

retseptorist sõltumatu signaaliraja lahutamatu osa on Gα subühiku nukleotiidivahetusfaktor 

RIC8. Antud bakalaureusetöö eesmärgiks oli selgitada nukleotiidivahetusfaktori RIC8 rolli 

neurogeneesis. Vanuses E10.5–E12.5 võrreldi konditsionaalse NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliini 

jagunevate neuraalsete eellasrakkude arvu, basaalsete eellasrakkude teket ja paiknemist ning 

neuraalsete eellasrakkude apoptoosi. 

Bakalaureustöö kokkuvõtteks tehti järgmised järeldused: 

Vaatamata RIC8 puudusele neuraalsetes eelasrakkudes on enamus NestinRic8 -/- 

mutantseid embrüoid võimelised arenema E10.5-E12.5, ehkki esineb ka 

embrüonaalset suremust. 

Embrüonaalses vanuses E10.5 esinevad NestinRic8 -/- embrüotel kõige tugevamad 

arengudefektid. Neile embrüotele on iseloomulik oluliselt väiksem kasv, nende 

ajuvatsakesed (otsajupõis, keskajupõis, tagaajupõis) on tunduvalt väiksemad ja 

ebanormaalselt kokkusurutud morfoloogiaga. Lisaks on neil täheldatavad neuraaltoru 

sulgumise defektid keskaju ning otsaju posterioorses piirkonnas ning lisaks 

näopiirkonna arengudefektid. 

Vanuses E11.5 ja E12.5 NestinRic8 -/- embrüotel märkimisväärseid fenotüübilisi 

iseärasusi ei tuvastatud. 

Embrüonaalsete otsajude ja neuraaltorude immuunohistokeemilisel analüüsil vanuses 

E10.5-E12.5 leiti, et basaalsed eellasrakud ning mitootilised neuraalsed eellasrakud on 

võimelised tekkima ning paiknevad NestinRic8 -/- mutantsetel embrüotel korrektselt 

võrrelduna NestinRic8 +/- pesakonnakaaslastega. 

Kõige raskemate arengudefektidega NestinRic8 -/- embrüotel (grupp I) vanuses E10.5 

oli basaalseid eellasrakke tunduvalt vähem kui pesakonnakaaslastel, kuid 

proliferatiivseid neuraalseid eelasrakke oli ventrikulaartsoonis märgatavalt rohkem kui 

kontroll-embrüotel. 

Apoptootilisi rakke esineb otsaju ja neuraaltoru neuroepiteelis kõikidel vaadeldud 

embrüotel vanuses E10.5-E12.5 väga vähe. Apoptootiliste rakkude hulk NestinRic8 -/- 

embrüotel ei ole märkimisväärselt tõusnud. 

39

SUMMARY 

Division of neural precursor cells and the role of apoptosis in NestinCre;Ric8 lacZ/lox 

transgenic mouse at the embryonic age E10.5-12.5 

Epp Kaleviste 

Development of nervous system is highly regulated by symmetric and asymmetric division of 

precursor cells. In cell division nucleotide exhange factor RIC8 has been proven to play 

important role in G-protein mediated synaptic transmission and in mitotic spindle orientation 

during asymmetric cell division in embryogenesis and neurogenesis. 

The aim of the present study was to determine the role of RIC8 in neurogenesis – in mitotic 

cells, basal precursor cells and apoptotic cells. The three genotypes – wild type, 

NestinCre;Ric8 -/- mutant and NestinCre;Ric8 +/- littermate were analyzed and compared with 

each other at the embryonic age E10.5-12.5. 

In the early neurogenesis the age E10.5 was most distinctive, embryos had considerable 

malformations in the brain ventricles and the neuraltube had not been closed properly. At the 

ages E11.5 and E12.5 there were not significant changes in the NestinCre;Ric8 -/- phenotype. 

Mitotic cell marker PH-3, basal precursor cell marker Tbr-2 and apoptotic cell marker didn’t 

show any changes in expression or localization in wild type, littermate and NestinCre;Ric8 -/- 

embryos at the ages E10.5-12.5. The statistical analysis was conducted to count positively 

expressed cells and the whole number of cells. The count did not show any changes in the 

quantity of the cells. The results indicate that the defects of NestinCre;Ric8 -/- embryos are not 

caused by increased apoptosis or differences in cell division during observed embryonic 

period. In the further studies the goal is to examine the development of cell division and 

apoptosis in older embryonic ages. 

40

Tänusõnad 

Siirad tänusoovid oma juhendajatele Keiu Kask’le ja Tambet Tõnissoo’le huvitava lõputöö 

teema, kannatliku suhtumise ning suure abivalmiduse eest. 

Lisaks väärivad sooja tänusõna ka Laura Tikker ja Katrin Ruisu, kes andsid nõu 

ekperimentaalse osa sooritamisel. Ning suured tänud tervele laborikollektiivile, kelleta poleks 

lõputöö valmimine möödunud nii töökalt ning rõõmsameelselt. 

41

Kasutatud kirjanduse loetelu 

Afshar, K., Willard, F., Colombo, K., Johnston, C., McCudden, C., Siderovski, D., Gönczy, P. 

(2004). RIC8 Is Required for GPR-1/2-Dependent G [alpha] Function during Asymmetric 

Division of C.elegans Embryos. Cell. 119: 219-230. 

Bastiani, C., Mendel, J. (2006). Heterotrimeric G proteins in C.elegans. WormBook : the online 

review of C. elegans biology. 1-25. 

Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. (2001). Frizzled 

regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell 

division. Nat Cell Biol. 3: 50-7. 

Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. (2008). Amplification of neural stem cell 

proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural Dev. 19: 

3-5. 

Bowman, S. K., Rolland, V., Betschinger, J., Kinsey, K. A., Emery, G., Knoblich, J. A. (2008). 

The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in 

Drosophila. Dev Cell. 14: 535-46. 

Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. (2006). The receptors and cells for 

mammalian taste. Nature. 444: 288-94. 

Chenn, A. and McConnell, S. K. (1995). Cleavage Orientation and the Asymmetric Inheritance of 

Notch1 lmmunoreactivity in Mammalian Neurogenesis. Cell, Vol. 82: 831-841. 

Couwenbergs, C., Labbé, J. C., Goulding, M., Marty, T., Bowerman, B., Gotta, M. (2007). 

Heterotrimeric G protein signaling functions with dynein to promote spindle positioning in 

C.elegans. J Cell Biol. 179: 15-22. 

Darzynkiewicz, Z., Juan, G., Li, X., Gorczyca, W., Murakami, T., Traganos, F. (1997). Cytometry 

in cell necrobiology: analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 27: 1- 

20. 

David, N. B., Martin, C. A., Segalen, M., Rosenfeld, F., Schweisguth, F., Bellaiche, Y. (2005). 

Drosophila Ric8 regulates Gα i cortical localization to promote Gα i -dependent planar orientation 

of the mitotic spindle during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 7: 1083-1090. 

Du, Q., Macara, I. G. (2004). Mammalian Pins is a conformational switch that links NuMA to 

heterotrimeric G proteins. Cell. 119: 503-16. 

Du, Q., Stukenberg, P. T., Macara, I. G. (2001). A mammalian Partner of Inscuteable binds 

NuMA and regulates mitotic spindle organization. Nat Cell Biol. 3: 1069-75. 

42

Dubois, N. C., Hofmann, D., Kaloulis, K., Bishop, J. M., Trumpp, A. (2006). Nestin-Cre 

transgenic mouse line Nes-Cre1 mediates highly efficient Cre/loxP mediated recombination in the 

nervous system, kidney, and somite-derived tissues. Genesis. 44: 355-60. 

Dujardin, D. L., Vallee, R. B. (2002). Dynein at the cortex. Curr Opin Cell Biol. 14: 44-9. 

Farkas, L. M., Huttner, W. B. (2008). The cell biology of neural stem and progenitor cells and its 

significance for their proliferation versus differentiation during mammalian brain development. 

Current Opinion in Cell Biology. 20: 707-715. 

Fenech, C., Patrikainen, L., Kerr, D. S., Grall, S., Liu, Z., Laugerette, F., Malnic, B., Montmayeur, 

J.-P. (2009). Ric8A, a Gα protein guanine nucleotide exchange factor potentiates taste 

receptor signaling. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3. 

Figueroa, M., Hinrichs, M. V., Bunster, M., Babbitt, P., Martinez-Oyanedel, J., Olate, J. (2009). 

Biophysical studies support a predicted superhelical structure with armadillo repeats for Ric8. 

Protein Sci. 18: 1139-45. 

Gabay, M., Pinter, M. E., Wright, F. A., Chan, P., Murphy, A. J., Valenzuela, D. M., 

Yancopoulos, G. D., Tall, G. G. (2011). Ric8 proteins are molecular chaperones that direct 

nascent G protein α subunit membrane association. Sci Signal. 4: ra79. 

Gonczy, P. (2008). Mechanisms of asymmetric cell division: flies and worms pave the way. Nat 

Rev Mol Cell Biol. 9: 355-366. 

Gotta, M., Dong, Y., Peterson, Y. K., Lanier, S. M., Ahringer, J. (2003). Asymmetrically 

distributed C.elegans homologs of AGS3/PINS control spindle position in the early embryo. Curr 

Biol. 13: 1029-37. 

Gupta, A., Tsai, L. H., Wynshaw-Boris, A. (2002). Life is a journey: A genetic look at neocortical 

development. Nature Reviews Genetics. 3: 342-355. 

Gönczy, P., Pichler, S., Kirkham, M., Hyman, A. A. (1999). Cytoplasmic dynein is required for 

distinct aspects of MTOC positioning, including centrosome separation, in the one cell stage 

Caenorhabditis elegans embryo. J Cell Biol. 147: 135-50. 

Götz, M. and Huttner, W. B. (2005). The cell biology of neurogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6: 

777-788. 

Hampoelz, B., Hoeller, O., Bowman, S. K., Dunican, D., Knoblich, J. A. (2005). Drosophila Ric8 

is essential for plasma-membrane localization of heterotrimeric G proteins. Nature Cell Biology. 

7: 1099-1105. 

Hartfuss, E., Galli, R., Heins, N., Götz, M. (2001). Characterization of CNS precursor subtypes 

and radial glia. Dev Biol. 229: 15-30. 

43

Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. (2004). Neurons arise in the basal 

neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: A major site of neurogenesis. 

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101: 3196- 

3201. 

Hawkins, N., Garriga, G. (1998). Asymmetric cell division: from A to Z. Genes Dev. 12: 3625-38. 

Hess, H. A., Röper, J. C., Grill, S. W., Koelle, M. R. (2004). RGS-7 completes a receptorindependent 

heterotrimeric G protein cycle to asymmetrically regulate mitotic spindle positioning 

in C.elegans. Cell. 119: 209-18. 

Hinrichs, M., Torrejón, M., Montecino, M., Olate, J. (2012). Ric8: different cellular roles for a 

heterotrimeric G-protein GEF. J Cell Biochem. doi: 10.1002/jcb.24162. 

Hyman, A. A., White, J.G. (1987). Determination of cell division axes in the early embryogenesis 

of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 105: 2123-35. 

Ikeshima-Kataoka, H., Skeath, J. B., Nabeshima, Y., Doe, C. Q., Matsuzaki, F. (1997). Miranda 

directs Prospero to a daughter cell during Drosophila asymmetric divisions. Nature. 390: 625-9. 

Jan, Y.-N., Jan, L. Y. (2001). Asymmetric cell division in the Drosophila nervous system. Nat 

Rev Neurosci. 2: 772-779. 

Kaltschmidt, J. A., Davidson, C. M., Brown, N. H., Brand, A. H. (2000). Rotation and asymmetry 

of the mitotic spindle direct asymmetric cell division in the developing central nervous system. 

Nat Cell Biol. 2: 7-12. 

Kask, K. (2010) Nukleotiidivahetusfaktor Ric8 uurimine imetajate neurogeneesis ja 

NestinCre;Ric8 lacZ/lox hiireliini iseloomustamine; Magistritöö 

Klattenhoff, C., Montecino, M., Soto, X. et al. (2003). Human brain synembryn interacts with 

Gsalpha and Gqalpha and is translocated to the plasma membrane in response to isoproterenol and 

carbachol. J Cell Physiol, 195: 151-157. 

Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. (2002). Induction of the neural crest: a multigene process. Nat 

Rev Genet. 3: 453-61. 

Knoblich, J. A. (2001). Asymmetric cell division during animal development. Nat Rev Mol Cell 

Biol. 2: 11-20. 

Konno, D., Shioi, G., Shitamukai, A., Mori, A., Kiyonari, H., Miyata, T., Matsuzaki, F. (2007). 

Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain selfrenewability 

during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10: 93-101. 

Kriegstein, A. R., Götz, M. (2003). Radial glia diversity: A matter of cell fate. Glia. 43: 37-43 

44

Kriegstein, A., Noctor, S., Martinez-Cerdeno, V. (2006). Patterns of neural stem and progenitor 

cell division may underlie evolutionary cortical expansion. Nat Rev Neurosci. 7: 883-890. 

Lossi, L., Merighi, A. (2003). In vivo cellular and molecular mechanisms of neuronal apoptosis in 

the mammalian CNS, Progress in Neurobiology. 69: 287– 312. 

Lossi, L., Mioletti, S., Merighi, A. (2002c). Synapse-independent and synapse-dependent 

apoptosis of cerebellar granule cells in postnatal rabbits occur at two subsequent but partly 

overlapping developmental stages. Neuroscience. 112: 509–523. 

Lu, B. W., Rothenberg, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. (1998). Partner of numb colocalizes with Numb 

during mitosis and directs Numb asymmetric localization in Drosophila neural and muscle 

progenitors. Cell. 95: 225-235. 

Malatesta, P., Hartfuss, E., Gotz, M. (2000). Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated 

cell sorting reveals a neuronal lineage. Development. 127: 5253-5263. 

Maldonado-Agurto, R., Toro, G., Fuentealba, J., Arriagada, C., Campos, T., Albistur, M., 

Henriquez, J. P., Olate, J., Hinrichs, M. V., Torrejón, M. (2011). Cloning and spatiotemporal 

expression of RIC8 in Xenopus embryogenesis. Gene Expr Patterns. 11: 401-8. 

Malik, S., Ghosh, M., Bonacci, T. M., Tall, G. G., Smrcka, A. V. (2005). Ric8 enhances G protein 

betagamma-dependent signaling in response to betagamma-binding peptides in intact cells. Mol 

Pharmacol. 68: 129-36. 

Miller, K. G., Emerson, M. D., McManus, J. R., Rand, J. B. (2000). RIC8 (Synembryn): A novel 

conserved protein that is required for G(q)alpha signaling in the C.elegans nervous system. 

Neuron. 27: 289-299. 

Miller, K., Alfonso, A., Nguyen, M., Crowell, J., Johnson, C., Rand, J. (1996). A genetic selection 

for Caenorhabditis elegans synaptic transmission mutants. Proceedings of the National Academy 

of Sciences of the United States of America. 93: 12593. 

Miller, K., Rand, J. (2000). A role for RIC8 (Synembryn) and GOA-1 (Go {alpha}) in regulating 

a subset of centrosome movements during early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. 

Genetics. 156: 1649. 

Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. (2001). Asymmetric Inheritance of Radial 

Glial Fibers by Cortical Neurons. Neuron. 31: 727-741. 

Morin, X., Jaouen, F., Durbec, P. (2007). Control of planar divisions by the G-protein regulator 

LGN maintains progenitors in the chick neuroepithelium. Nat Neurosci. 10: 1440-8. 

45

Murai, K., Qiu, R., Zhang, H., Wang, J., Wu, C., Neubig, R. R., Lu, Q. (2010). Gα subunit 

coordinates with ephrin-B to balance self-renewal and differentiation in neural progenitor cells. 

Stem Cells. 28: 1581-9 

Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. (2001). Two 

modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4: 

143-150. 

Nagayoshi, S., Hayashi, E., Abe, G., Osato, N., Asakawa, K., Urasaki, A., Horikawa, K., Ikeo, K., 

Takeda, H., Kawakami, K. (2008). Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated 

enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembrynlike. 

Development. 135: 159-169. 

Neer, E. J. (1995). Heterotrimeric G proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80: 249- 

57. 

Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. (2002). G protein pathways. Science. 296: 1636-9. 

Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gönczy, P. (2007). Coupling of cortical dynein and G alpha 

proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9: 1294-302. 

Nijhawan, D., Honarpour, N., Wang, X. (2000). Apoptosis in neuronal development and disease, 

Annual Review of Neuroscience. 23: 73–87. 

Nishimura, A., Okamoto, M., Sugawara, Y., Mizuno, N., Yamauchi, J., Itoh, H. (2006). Ric8A 

potentiates Gq-mediated signal transduction by acting downstream of G protein-coupled receptor 

in intact cells. Genes Cells. 11: 487-98. 

Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Wong, W. S., Clinton, B. K., Kriegstein, A. R. 

(2002). Dividing precursor cells of the embryonic cortical ventricular zone have morphological 

and molecular characteristics of radial glia. Journal of Neuroscience. 22: 3161-3173. 

Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. (2004). Cortical neurons arise in 

symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature 

Neuroscience. 7: 136-144. 

Noctor, S.C., Flint, A.C., Weissman, T.A., Dammerman, R.S., Kriegstein, A.R. (2001). Neurons 

derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409: 714-20. 

Oberhammer, F., Wilson, J. M., Dive, C., Morris, I. D., Hickman, J. A., Wakeling, A. E., Walker, 

P. R., Sikorska, M. (1993). Apoptotic death in epithelial cells: Cleavage of DNA to 300 and/or 50 

kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO J. 12: 3679– 

3684. 

46

Petronczki, M., Knoblich, J. A. (2001). DmPAR-6 directs epithelial polarity and asymmetric cell 

division of neuroblasts in Drosophila. Nat Cell Biol. 3: 43-9. 

Reynolds, N. K., Schade, M. A., Miller, K. G. (2005). Convergent, RIC8-dependent Galpha 

signaling pathways in the Caenorhabditis elegans synaptic signaling network. Genetics. 169: 651- 

670. 

Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. (2001). Bazooka is required for 

localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell 

lineage in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98: 14469-74. 

Romo, X., Pastén, P., Martínez, S., Soto, X., Lara, P., Arellano, A. R. d., Torrejón, M., 

Montecino, M., Hinrichs, M. V., Olate, J. (2008). xRic8 is a GEF for Gsalpha and participates in 

maintaining meiotic arrest in Xenopus laevis oocytes. Journal of Cellular Physiology. 214: 673- 

680. 

Schaefer, M., Knoblich, J. A. (2001). Protein localization during asymmetric cell division. 

Experimental Cell Research. 271: 66-74. 

Schaefer, M., Shevchenko, A., Knoblich, J. A. (2000). A protein complex containing Inscuteable 

and the Galpha-binding protein Pins orients asymmetric cell divisions in Drosophila. Current 

Biology. 10: 353-362. 

Schneider, S. Q., Bowerman, B. (2003). Cell polarity and the cytoskeleton in the Caenorhabditis 

elegans zygote. Annu Rev Genet. 37: 221-49. 

Schuldt, A. J., Adams, J. H., Davidson, C. M., Micklem, D. R., Haseloff, J., St Johnston, D., 

Brand, A. H. (1998). Miranda mediates asymmetric protein and RNA localization in the 

developing nervous system. Genes Dev. 12: 1847-57. 

Siller, K. H., Doe, C. Q. (2009). Spindle orientation during asymmetric cell division. Nature Cell 

Biology. 11: 365-374. 

Singer, W. D., Brown, H. A., Sternweis, P.C. (1997). Regulation of eukaryotic 

phosphatidylinositol-specific phospholipase C and phospholipase D. Annu Rev Biochem. 66: 

475-509. 

Smrcka, A. V., Hepler, J. R., Brown, K. O., Sternweis, P. C. (1991). Regulation of 

polyphosphoinositide-specific phospholipase C activity by purified Gq. Science. 251: 804-7. 

Sonoda, J., Wharton, R. P. (2001). Drosophila Brain Tumor is a translational repressor. Genes 

Dev. 15: 762-73. 

Srinivasan, D. G., Fisk, R. M., Xu, H., van den Heuvel, S. (2003). A complex of LIN-5 and GPR 

proteins regulates G protein signaling and spindle function in C.elegans. Genes Dev. 17: 1225-39. 

47

Zhong, W. (2003). Diversifying neural cells through order of birth and asymmetry of division. 

Neuron. 37: 11-4. 

Zhong, W., Chia, W. (2008). Neurogenesis and asymmetric cell division. Current Opinion in 

Neurobiology. 18: 4-11. 

Zigman, M., Cayouette, M., Charalambous, C., Schleiffer, A., Hoeller, O., Dunican, D., 

McCudden, C. R., Firnberg, N., Barres, B. A., Siderovski, D. P., Knoblich, J. A. (2005). 

Mammalian Inscuteable regulates spindle orientation and cell fate in the developing retina. 

Neuron. 48: 539-45. 

Zimmermann, K.C., Bonzon, C., Green, D.R. (2001). The machinery of programmed cell death. 

Pharmacol. Ther. 92, 57–70. 

Tall, G. G., Krumins, A. M., Gilman, A. G. (2003). Mammalian Ric8A (synembryn) is a 

heterotrimeric Gα protein guanine nucleotide exchange factor. Journal of Biological Chemistry. 

278: 8356-8362. 

Tamamaki, N., Nakamura, K., Okamoto, K., Kaneko, T. (2001). Radial glia is a progenitor of 

neocortical neurons in the developing cerebral cortex. Neurosci Res. 41: 51-60. 

Thomas, C. J., Tall, G. G., Adhikari, A., Sprang, S. R. (2008). Ric8A catalyzes guanine nucleotide 

exchange on G alpha1 bound to the GPR/GoLoco exchange inhibitor AGS3. Journal of Biological 

Chemistry. 283: 23150-23160. 

Tõnissoo, T., Kõks, S., Meier, R., Raud, S., Plaas, M., Vasar, E., Karis, A. (2006). Heterozygous 

mice with Ric8 mutation exhibit impaired spatial memory and decreased anxiety. Behavioural 

Brain Research. 167: 42-48. 

Tõnissoo, T., Lulla, S., Meier, R., Pooga, M., Karis, A. (2010). Nucleotide exchange factor Ric8 

is indispensable in mammalian early development. Developmental dynamics. Developmental 

Dynamics. 239: 3404-15. 

Tõnissoo, T., Meier, R., Talts, K., Plaas, M., Karis, A. (2003). Expression of Ric8 (synembryn) 

gene in the nervous system of developing and adult mouse. Gene Expression Patterns. 3: 591-594. 

Wang, H., Ng, K. H., Qian, H., Siderovski, D. P., Chia, W., Yu, F. (2005). Ric8 controls 

Drosophila neural progenitor asymmetric division by regulating heterotrimeric G proteins. Nature 

Cell Biology. 7: 1091-1098. 

Wang, S. C., Lai, H. L., Chiu, Y. T., Ou, R., Huang, C. L. and Chern, Y. (2007). Regulation of 

type V adenylate cyclase by Ric8a, a guanine nucleotide exchange factor. Biochem J. 406: 383- 

388. 

48

White, J., Strome, S. (1996). Cleavage plane specification in C.elegans: how to divide the spoils. 

Cell. 84: 195-8. 

Wilkie, T. M., Kinch, L. (2005). New roles for Galpha and RGS proteins: Communication 

continues despite pulling sisters apart. Current Biology. 15. 

Wodarz, A. and Huttner, W. B. (2003). Asymmetric cell division during neurogenesis in 

Drosophila and vertebrates. Mechanisms of Development. 120: 1297–1309. 

Wodarz, A., Ramrath, A., Kuchinke, U., Knust, E. (1999). Bazooka provides an apical cue for 

Inscuteable localization in Drosophila neuroblasts. Nature. 402: 544-7. 

Von Dannecker, L. E. C., Mercadante, A. F., Malnic, B. (2005). Ric8B, an olfactory putative GTP 

exchange factor, amplifies signal transduction through the olfactory-specific G-protein Gα olf . 

Journal of Neuroscience. 25: 3793-3800. 

Woodard, G. E., Huang, N. N., Cho, H., Miki, T., Tall, G. G., Kehrl, J.H. (2010). Ric8A and Gi 

alpha recruit LGN, NuMA, and dynein to the cell cortex to help orient the mitotic spindle. Mol 

Cell Biol. 30: 3519-30. 

Wu, P.-S., Egger, B., Brand, A. H. (2008). Asymmetric stem cell division: Lessons from 

Drosophila. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19: 283-293. 

Xiao, Z., Wan, Q., Du, Q., Zheng, Z. (2012). Galpha/LGN-mediated asymmetric spindle 

positioning does not lead to unequal cleavage of the mother cell in 3-D cultured MDCK cells. 

Biochem Biophys Res Commun. 420: 888-94. 

Ybot-Gonzalez, P., Gaston-Massuet, C., Girdler, G., Klingensmith, J., Arkell, R., Greene, N. D. 

E., Copp, A. J. (2007). Neural plate morphogenesis during mouse neurulation is regulated by 

antagonism of Bmp signalling. Development. 134: 3203-3211. 

Yoshida, S., Shimmura, S., Nagoshi, N., Fukuda, K., Matsuzaki, Y., Okano, H., Tsubota, K. 

(2006). Isolation of multipotent neural crest-derived stem cells from the adult mouse cornea. Stem 

Cells. 24: 2714-22. 

49

Neuraalsete eellasrakkude jagunemise, tekke ning apoptoosi ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?