Heterotrophic plate count in surface and waste water

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

MOLEKULAARBIOLOOGIA ÕPPETOOL 

Peeter Laas 

Pinna-, reo- ja heitvee kultiveeritavad heterotroofsed 

bakterid 

Magistritöö 

Juhendaja Veljo Kisand, Ph.D. 

Eve Vedler, PhD 

TARTU 

2010

Sisukord 

Pinna-, reo- ja heitvee kultiveeritavad heterotroofsed bakterid .......................................... 1 

Sisukord .............................................................................................................................. 2 

Lühendid ............................................................................................................................. 4 

Sissejuhatus......................................................................................................................... 5 

Kirjanduse ülevaade............................................................................................................ 6 

Mikrobioloogia pudelikael: bakterite kultiveeritavus................................................. 6 

Kultiveerimine metagenoomika ajastul .......................................................................... 7 

Heterotroofne bakterplankton ..................................................................................... 9 

Heterotroofne plaadiloend ........................................................................................ 10 

Standardsed külvitehnikad........................................................................................ 11 

Ülevaade töös kasutatavatest söötmetest: LB, R2A, ZoBell....................... 12 

Inkubeerimise tingimused ja kestus. ............................................................... 14 

Pseudomonas spp...................................................................................................... 14 

Praktiline osa..................................................................................................................... 15 

Materjal ja metoodika ................................................................................................... 15 

Tulemused..................................................................................................................... 24 

Võrtsjärv ................................................................................................................... 24 

Suur-Emajõgi ............................................................................................................ 27 

Tartu Reoveepuhasti ..................................................................................................... 28 

Arutelu .......................................................................................................................... 32 

Võrtsjärv ................................................................................................................... 32 

Kokkuvõte..................................................................................................................... 34 

Kasutatud kirjandus ...................................................................................................... 36 

Raamatud .................................................................................................................. 36 

Artiklid...................................................................................................................... 37 

Internet ...................................................................................................................... 41 

Muud dokumendid.................................................................................................... 41 

Lisad.................................................................................................................................. 42 

Lisa 1............................................................................................................................. 42 

2

Lisa 2............................................................................................................................. 43

Lühendid 

APHA - American Public Health Association 

BHT – bioloogiline hapnikutarve 

CFU – kolooniat moodustav ühik, ingl. k. colony forming unit 

EDTA - etüleendiamiintetraatsetaat 

GuSCN - guanidiinium tiotsüanaat 

HTC – heterotroofne plaadiloend, ingl. k heterotrophic plate count 

KHT – keemiline hapnikutarve 

LB – Luria-Bertani sööde 

MF - membraanfilter 

MPN - kõige tõenäolisem arv (ingl. k. most probable number) 

mQ – milli Q vesi 

PCA – plaadiloendusagar ingl. k. plate count agar 

PK – pindkülv 

RDP – ribosomaalse andmebaasi projekt 

SK – süviskülv 

ZB – sööde ZoBell 2216E 

YEA - pärmiekstrakti agar, ingl. k. yeast extract agar 

4

Sissejuhatus 

Bakterite olemaolu avastas Antonie Philips van Leeuwenhoeki juba rohkem kui kolm 

sajandit tagasi. Kulus kaks sajandit, ennem kui õpiti kasvatama baktereid puhaskultuuris 

(Koch) ja selgitati paljude haiguste põhjustajad. 

Esmalt keskenduti täiesti arusaadavatel põhjustel põhiliselt patogeensete bakterite 

uurimisele ja koos sellega kogunesid olulised teadmised prokarüootsete organismide 

füsioloogia ja geenetika kohta. 

20 sajandi lõpus koos kultiveerimisest-sõltumatute meetodite kasutuselevõtmisega 

avastati „üleöö“ kümneid uusi kultiveerimata bakterite hõimkondi ning selgus, et seni 

teadaolnud liigid moodustavad looduslikes mikroobikooslustes alla 1 % suuruse osa 

(Curtis ja Sloan, 2004). 

Uute bakteriliikide isoleerimine on oluline samm õppimaks tundma nende liikide 

füsioloogiat, biogeokeemilist rolli ja rolli erinevates ökosüsteemides. Arvatakse, et 

ookenides peituv mitmekesis on väärt umbes umbes kümnete miljardite dollarite 

väärtuses uusi ravimeid, kosmeetikatooteid, ensüüme jne. 

Käesolevas töö üheks eesmärgiks sai isoleerida kahest eutroofse kasvukeskkonnast 

(Võrtsjärv ja Tartu reovesi) baktereid isoleerida ja identifitseerida ning nende andmete 

järgi hinnata antud kasvukeskkondi ja kultiveerimiseks kasutatud meetodeid. 

Tahaksin tänada oma juhendajat ning oma geneetilisi ja vaimseid eelkäijaid. 

JA kõiki kergeid ja raskeid erguteid, mis on selle töö v6imalikuks teinud. Jep, ma kirjutan 

selle siia. 

5

Kirjanduse ülevaade 

Mikrobioloogia pudelikael: bakterite kultiveeritavus 

Juba 20 sajandi alguses paljud mikrobioloogid (Z. R. Radsimovsky, V. S. Radsimovsky, 

C. E. ZoBell jt.) märkasid, et otsesel bakterplanktoni arvukuse määramisel 

(mikroskoobiga otsesel loendamisel) saadakse bakterite arvukused, mis on kuni neli 

suurusjärku suuremad, kui kaudsete meetoditega nagu MPN (kõige tõenäolisema arvu, 

ingl. k. most probable number) või plaadimeetodiga saadud loendid (Jannasch ja Jones, 

1959). Alguses oletati, et tegemist on organofoobsete autotroofidega (Radsimovsky) või 

“surnud” rakkudega (Radsimovsky), kuid biokeemilised analüüsid neid väiteid ei 

toetanud (Reasoner, 1990). 

Sajandi viimasel poolel oli probleem ikka veel lahendamata. Staley ja Konopka (1985) 

nimetasid selle nähtuse “suureks plaadiloenduse anomaaliaks” (ingl. k. great plate count 

anomaly). See probleem hakkas vaikselt lahenema, kui C. R. Woese ja G. E. Fox (1977) 

pakkusid välja 16S rRNA geeni kui tööriista organismide fülogeneesi uurimiseks ja N. R 

Pace kolleegidega (1986 ja 1997) otsustasid kasutada polümeraasi ahelrakstiooni (PCR) 

selle geeni amplifitseerimiseks otse keskkonnas olevast DNA-st. 

Uus kultiveerimisest sõltumatu molekulaarbioloogiline lähenemisviis pani alguse 

“metagenoomika” ajajärgule mikroobimaailma uurimisel. Kui 1987. aastal jaotati 

kirjeldatud bakterid 12-sse fülogeneetilisse liini, siis aastal 2003 juba 52-sse, neist 26-s ei 

ole ühtegi kultiveeritud esindajat (Rappé ja Giovannoni, 2003). Joonisel 1 on toodud 

ülevaatlik graafik uute bakterite ja arhede hõimkondade avastamisest. 

Avastati, et seni kultiveerimata organismid olid erinevates ökosüsteemides palju 

arvukamad kui laboritingimustes kultiveeritavad liigid. Näiteks SAR11 fülogeneetilise 

klaadi esindajad moodustavad rRNA järjestuste alusel 26% maailmamere 

bakterplanktonist. Hoolimata selle fülogeneetilise grupi laiast levikust ja suurest 

arvukusest, isoleeriti esimene esindaja puhaskultuuri alles 2002 aastal (Rappe et al, 

2002). 

6

1. Joonis 1. Molekulaarsed meetodid on viimase paarikümne aasta jooksul oluliselt 

parandanud mikroobikoosluste liigilise mitmekesisuse hindamist (Alain ja Querellou 

2009). 

Kultiveerimine metagenoomika ajastul 

1991. kuni 1997. aastatel 65% mikrobioloogiateemalistest publikatsioonidest olid 

pühendatud 8 perekonna uurimisele: Escherichia (18%), Helicobacter (8%), 

Pseudomonas (7%), Bacillus (7%), Streptococcus (6%), Mycobacterium (6%), 

Staphylococcus (6%) ja Salmonella (5%). Need 8 perekonda esindavad ainult kolme 

hõimkonda (Galvez et al, 1998). Samas ainult väikest osa mikroobidest (olenevalt 

keskkonnast

umbrohtude” suunas. Näiteks Kuigi kultiveerimisest sõltumatu bakterite 16S rRNA geeni 

fülogeneesi uurimine on viinud teadlasi bakterite uurimisel oluliselt edasi, jätab see palju 

küsimusi nende organismide kohta vastamata, nagu näiteks milline biokeemiline 

aktiivsus kasvukeskkonnas või millised innovatiivsed muutused nende rakkude 

funktsioonis on mõjutanud nende evolutsiooni (Rappé ja Giovannoni, 2003). 

Sekveneerimisjõudluse kasvades on käima läinud suured projektid metagenoomilise 

informatsiooni kogumiseks, neist üks tähtsamaid on J. Craig Venteri juhitav Sorcerer II 

ekspeditsioon. Kogutud on juba üle 7,7 miljoni järjestuse, mille analüüsimisel on 

kindlaks tehtud umbes 4000 valku kodeerivate geenide klastrit, kuid millest 1700-l 

puudub homoloogia teadaolevate geenidega. 

Joonis 2. Erinevad uurimismeetodid mikrobioloogias moodustavad integreeritud 

süsteemi, milles nad teineteist toetavad (Giovannoni ja Stingl, 2007). 

Praeguseks on olemas juba kogu genoomi järjestused, mis on kokku pandud ainult 

metagenoomiliseste andmete põhjal (Glöckner et al, 2003). Selline lähenemine on 

võimalik väikese liigilise mitmekesisusega proovide puhul ja kõige usaldusväärsem viis 

on siiski terve genoomi sekveneerimiseks lähtuda DNA-st, mis on ekstraheeritud 

bakterite puhaskultuurist (Giovannoni ja Stingl, 2007). 

Metagenoomilise informatsiooni abil metaboolsete võrgustike modelleerimist on hakatud 

kasutama, et komponeerida söötmeid vastavate mikroobide kultiveerimiseks (Renesto et 

8

al, 2003). Samas, metagenoomiliste järjestuste analüüsimiseks võrreldakse neid 

kultiveeritud bakterite genoomidega. Eraldiseisvate meetodite kitsaskohtadest aitab üle 

saada integreeritud lähenemine (joonis 2). 

Kuigi kultiveerimis-põhised meetodid on vanemad, tunduvalt aeganõudvamad ja 

vähemefektiivsed mikroobimaailma liigilise mitmekesisuse uurimiseks, siis bakterite 

füsioloogia uurimiseks on need siiski möödapääsmatud. 

Heterotroofne bakterplankton 

Arvuliselt bakterid domineerivad vesikeskkonda. Meie planeedil elab osadel hinnangutel 

umbes 4 – 6 x 10 30 prokarüootset organismi, neist 1,2 x 10 29 avaookeanis ning 2,312 x 

10 26 jõgedes ja järvedes (Whitman et al, 1998). Maailmamere liigiliseks mitmekesisuseks 

on hinnatud kuni 2 x 10 6 erinevat prokarüoodi liiki (Curtis ja Sloan, 2004). 

Bakterplankton (joonis 3) on planktoni ehk hõljumi osa, mis koosneb hetero-, auto-, ja 

miksotroofsetest bakteritest. Suurem osa heterotroofsetest bakteritest on 

kemoheterotroofsed, nad kasutavad energia saamiseks keemilisi ühendeid ja 

süsinukuallikana teiste organismide poolt toodetud orgaanilisi aineid, sellised mikroobid 

on universaalselt levinud: erinevates vesikeskkondades, toidus, mullas ja õhus. 

Heterotroofsed bakterid mängivad globaalses aineringluses tähtsat rolli omastades 

lahustunud orgaanilist ainet ja seda tagasi toiduahelasse lülitades. Sellesse gruppi 

kuuluvad ka kõik primaarsed ja oportunistlikud patogeenid nagu näiteks kolibakterid 

(Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia) ja Pseudomonas 

aeruginosa (Bitton, 2005). 

Kuna ookeanid on madala toitainetesisaldusega, siis heterotroofset bakterplanktonit 

domineerivad aeglase kasvuga oligotroofsed bakterid. Paljud neist on obligatoorsed 

oligotroofid, ehk ainult toitainevaeses keskkonnas kasvada suutvad bakterid. Need 

mikroobid ei moodusta traditsioonilistel toitainerikastel agarsöötmetel kolooniaid (Rappe 

et al, 2002). 

9

Joonis 3. Planktonisse kuuluvate levinumate arhede ja bakterite fülogeneetilised klastrid. 

(Giovannoni ja Stingl, 2005). 

Heterotroofne plaadiloend 

Saksa teadlast H. H. R. Kochi (1843 – 1910) loetakse üheks kaasaegse mikrobioloogia 

rajajaks. Ta isoleeris esimese bakteri puhaskultuuri (Bacillus anthracis) ning tõestas selle 

abil, et siberi katku (nagu ka paljusid teisi nakkushaigusi) põhjustavad mikroorganismid. 

Lisaks avaldas ta 1883. aastal artikli (“About Detection Methods for Microorganisms in 

Water”, eesti k. “Vee mikroorganismide detekteerimise meetoditest“), kus ta tutvustas 

esmakordselt meetodeid, millega läbi viia vee mikrobioloogilist seiret ja hinnata vee 

puhastusprotsesse (WHO, 2003). 

20. sajandi jooksul võeti kasutusele palju erinevaid “standardseid” plaadimeetodeid 

veeproovide mikrobioloogiliseks analüüsimiseks. Üheks oluliseks selleteemaliseks 

10

väljaandeks oli “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater “(eesti 

k. “Standardsed meetodid vee ja reovee uurimiseks”) 1. väljaanne, mis ilmus 1905 aastal 

(APHA et al,1985). 

1985. aastal võeti kasutusele uus termin “heterotrophic plate count” (HPC, eesti k. 

heterotroofne plaadiloend), mis ühendab endas aastate jooksul veemikrobiloogide 

kasutusele võetud agarsöötme-põhiseid meetodeid, mis erinevad omavahel söötmete 

koostise, inokuleerimise tehnika, inkubeerimise tingimuste (temperatuur, aereeritus) ja 

inkubeerimise ajalise kestvuse poolest (APHA et al,1985). 

Kõik HPC meetodid põhinevad eeldusel, et igast tardsöötmele sattunud elusrakust areneb 

üks koloonia. See eeldus ei ole alati tagatud, sest bakterid võivad olla agregeerunud või 

sattuda juhuslikult lähestikku ja koos moodustada ühe koloonia. Sellepärast väljendatakse 

arvukuse tulemused kolooniaid moodustavate ühikutena (CFU, ingl. k. colony forming 

unit) ml kohta. Loendamiseks kõige sobivam CFU-de arvukus Petri tassil jääb vahemikku 

30 kuni 300, selle saavutamiseks tuleb teha vajadusel proovidest lahjendused. 

HPC-i bakterid on see osa mikroobikooslustest, mis on nende meetoditega 

kultiveeritavad. Samas puudub üks universaalne meetod (tingimuste kombinatsioon), 

millega oleks võimalik kultiveerida korraga kõiki HPC baktereid (Reasoner, 1990). 

Standardsed külvitehnikad 

Süviskülvi (SK) puhul pipeteeritakse väike kogus inokulumi (tavaliselt kuni 1 ml) tühja 

Petri tassi põhja, seejärel valatakse sellele soe (44 – 46 ˚C) agarsööde peale (joonis 4) ja 

segatakse ettevaatlikult (APHA et al, 1985; Bitton, 2005). SK-le on iseloomulikud 

väikesed ja kergesti eristatavad kolooniad, mis ei kasva nii kiiresti kokku kui pindkülvi 

(PK) meetodiga. Samas paiknevad kolooniad kogu söötme maatriksis laiali, ka üksteise 

kohal, mis raskendab loendamist ja üksikkolooniate isoleerimist söötmelt. Teiseks 

miinuseks on loetud kuumašokki sooja agari pealevalamisel, mis võib baktereid 

inaktiveerida. Vähendatud on obligatoorsete aeroobide kolooniate loend, sest tassi põhjas 

on nende kasv inhibeeritud (Heritage et al 1998). 

PK tehnika puhul pipeteeritakse inokulum (tavaliselt kuni 0,5 ml) agarsöötme pinnale ja 

hõõrutakse steriilse spaatliga söötme pinnakihti. Seal on kolooniate morfoloogia selgesti 

11

eristatav ja neid on kerge puhaskultuuri isoleerida. Miinuseks on asjaolu, et inokulum 

peab söötmesse imenduma ja see piirab oluliselt selle mahtu (APHA et al, 1985). 

Mitmetes HPC katsetes on PK andnud keskmiselt rohkem kolooniaid kui SK (Reasoner 

ja Geldreich, 1985; Gibbs ja Hayes 1988; Massa et al, 1998) 

Membraanfiltri (MF) külvitehnika puhul imetakse proov (joogivee puhul tavaliselt 100 

ml) vaakumpumbaga läbi filtri, kuhu bakterirakud kinni jäävad, mis seejärel asetatakse 

agarsöötmele. See külvitehnika sobib madala bakterite arvukusega proovide külvamiseks 

(WHO, 2003). 

Joonis 4. Kolm standardset agarsöötme inokuleerimise tehnikat. A. Pindkülv. B. 

Süviskülv. C. Membraanfiltrikülv. 

Ülevaade töös kasutatavatest söötmetest: LB, R2A, ZB 

Kasutusele on võetud tuhandeid erinevaid söötmeid (Atlas, 2005), mis varieeruvad 

omavahel olekufaasi, koostise ja kasutusotstarbe poolest. Olekufaas on määratud 

geelistava ühendi olemasolu ja kontsentratsiooni poolest. 

LB (Luria-Bertani, koostis tabelis 2) on toitainerikas sööde, mida kasutatakse tavaliselt 

mudelorganismi Escherichia coli kasvatamiseks ja seetõttu on väga laialdaselt kasutusel 

laboritingimustes. 2009. aastal Oh ja kolleegid isoleerisid antibiootikumidele resistentseid 

baktereid kasutades LB ja R2A söötmeid. LB söötmest tehti ka 10, 10 2 , 10 3 ja 10 4 

kordsed lahjendused, et parandada oligotroofide detekteerimist. Keskmiselt saadi suurim 

12

akteriarvukus R2A söötmel. Joogivee ja jõevee proovide puhul andsid LB lahjendused 

suuremad arvukused, kui originaalkoostis. Sigade väljaheidetest võetud proovide puhul 

oli parem lahjendamata LB. 

R2A ja R3A söötmed võeti kasutusele aastal 1985 alternatiivina PCA (plate count agar, 

eesti k. plaadilt loendamise agar) söötmele, et parandada oligotroofsete bakterite 

kultiveeritavust. R3A sisaldab samu komponente kaks korda rohkem kui R2A (v. a. 

agar), mis on välja toodud tabelis 2. PCA, R2A ja R3A söötmeid võrreldi kasutades 

erinevaid külvitehnikaid (PK, SK ja MF). Kõige kõrgemad CFU arvukused saadi R2A 

söötmelt PK tehnikaga. Kõige vähem kolooniaid kasvas erinevate külvidega PCA 

söötmel. Võrreldi ka erinevaid kasvutemperatuure: 20, 28 ja 35 ˚C. Tunduvalt paremaks 

osutusid madalamad temperatuurid, 20 ˚C juures kasvatades saadi umbes 10 korda 

rohkem CFU-d kui 35 ˚C juures (Reasoner ja Geldreich, 1985). 

Gibbs ja Hayes (1988) võrdlesid R2A söödet YEA (pärmiekstrakti agar, ingl. k. yeast 

extract agar) söötmega, mida kasutati Inglismaal standardmeetodina (süviskülv, 20 – 22 

˚C, 3 päeva) joogivee bakterite arvukuse määramiseks. Mõlemad söötmed inokuleeriti 

SK ja PK külvimeetoditega. Kolooniate arvukused loendati 3 ja 7 päeva pärast külvi. 

R2A söötmel kasvas keskmiselt 4 korda rohkem kolooniaid 3-ndal päeval ja 8 korda 

enam kolooniaid 7-ndal päeval võrreldes YEA söötmega. 

Massa ja kolleegid (1998) kultiveerisid mineraalvee proove R2A ja PCA söötmetel 

kasutades PK ja SK külvitehnikat. Nagu ka Reasoner ja Geldrich (1985), said nad 

suuremad kolooniate arvukused R2A söötmel. Suurema liigilise mitmekesisusega 

Pseudomonas, Comamonas ja Acinetobacter perekondade esindajaid isoleeriti nii PCA 

kui ka R2A söötmetelt. Flavobacterium ja Arthrobacter perekondade esindajaid isoleeriti 

vaid R2A söötmelt. CFU-de arvukuselt andis parima tulemuse R2A sööde süviskülvi 

tehnikaga, mis oli 3,43 korda parem kui standardne meetod (Mass et al, 1998). 

ZoBell 2216E sööde (ZB, Oppenheimer ja ZoBell, 1952; koostis tabelis 2) on 

edasiarendus ZB 2216 söötmest (ZoBell, 1941), millele on täiendavalt lisatud 1 g 

pärmiekstrakti. ZB on põhiline meremikrobioloogias kasutatav sööde. Katsed ZB 

koostisainete kontsentratsioonide muutmisega ei andnud oluliselt paremaid tulemusi 

(Park et al, 2002). 

13

Inkubeerimise tingimused ja kestus. 

Kuigi paljud söötmed pole otseselt defineeritud kui selektiivsöötmed, on nad igal juhul 

selekteerivad vastavalt koostisele ning tingimustele, mille juures neid inkubeeritakse. 

Kõrgemal temperatuuril (35 – 37 ˚C) ja lühiajaline (34- 48 tundi) inkubeerimine sobib 

inimestelt ja loomadelt võetud proovide jaoks. Madalamatel temperatuuridel (20 – 28 ˚C) 

ja pikaajalisem inkubeerimine (5 – 7 päeva) sobib looduslikest veeproovidest võetud 

proovidele (Reasoner, 1990). 

Pseudomonas spp. 

Pseudomonaadid on looduses väga laialdaselt levinud heterotroofsete 

gammaproteobakterite selts, kuhu kuulub perekond Pseudomonas, mis kirjeldati esimest 

korda juba 19. sajandi lõpus (Migula, 1894). Nimi Pseudomonas tuleneb kreeka 

keelsetest sõnadest “ψευδο” ja “µονος”, mis tähendavad vastavalt “vale” ja “ühik”. Selle 

perekonna esindajad on Gram-negatiivsed kepikujulised polaarse viburiga bakterid. 

Perekonda Pseudomonas kuulub mitmekülgne rühm laialtlevinud γ-proteobaktereid, mis 

asustavad mulda, veekogusid, taimi ja loomi ning on tuntud oma metaboolse ning 

geneetilise mitmekülgsuse poolest (Clarke ja Richmond, 1975, Clarke, 1982). Nad 

kasvavad kiiresti ning on võimelised metaboliseerima väga laia spektrit toitaineid, sh. 

toksilisi orgaanilisi ühendeid nagu näiteks alifaatsed ja aromaatsed süsivesinikke 

(Reineke, 1998; Timmis and Pieper, 1999). 

Pseudomonas perekonna liigid ja tüved on tihti tolerantsed või resistentsed 

antibiootikumidele, desinfektsioonivahenditele, detergentidele, raskemetallidele ning 

orgaanilistele lahustitele. Sellest tulenevalt ka selle töö huvi Pseudomonase vastu 

Süsinikuallikate metabolism ja resistentsus kahjulikele ühenditele on tihtilugu plasmiidi 

või transposooni peal kodeeritud tunnused, kusjuures tavaliselt sisaldavad Pseudomonas 

perekonna esindajad mitut konjugatiivset või edasikanduvat plasmiidi ja transposooni. 

Mõned liigid toodavad aineid, mis stimuleerivad taimede kasvu või inhibeerivad 

taimekahjureid. Teised on taimede või loomade oportunistlikud patogeenid (Ramos 

et al., 1987; Gilbert et al ., 2003). 

14

Praktiline osa 

Materjal ja metoodika 

Lühiülevaade Võrtsjärvest 

Pindalaga 270 km 2 on Võrtsjärv Eestis suuruselt teine järv. Võrtsjärv asub Lõuna-Eestis 

ning moodustab koos Emajõe ja Peipsi järvega hüdroloogiliselt ühtse süsteemi. 

Võrtsjärve alamvesikonna moodustab Võrtsjärve valgala koos järvega. Võrtsjärve 

maksimaalne sügavus on 6 m, keskmine sügavus 2,8 m. Järve maht on umbes 0,8 km 3 , 

pikkus on 34,8 km ja laius põhjaosas 14,8 km, kaldajoone pikkus on 96 km (Järvet, 

2003). 

Võrtsjärv on tugevalt eutroofne järv. Üldlämmastiku (üld-N) keskmine kontsentratsioon 

on umbes 2 mg/l ja üldfosfori (üld-P) 50 µg/l. Vesi on vähese läbipaistvusega; vee 

läbipaistvus jäävabal ajal on kuni 1 meetrit (Kisand ja Nõges, 2004). Rakkude otsesel 

loendamisel on saadud bakterplanktoni arvukuseks 1 - 6 x 10 6 rakku ml kohta (Kisand ja 

Nõges, 1998). 

Võrtsjärve valgala on Eesti keskmisest madalama rahvastiku tihedusega (21 inimest km 2 

kohta). 2000. aasta andmetel elab seal 80 000 inimest, neist 10 000 Läti Vabariigi 

territooriumil. Kuigi Viljandi jääb ainult osaliselt valgala territooriumile, aga kuna kogu 

linna reovesi puhastatakse Võrtsjärve alamvesikonna territooriumil ja heitvesi juhitakse 

Tänassilma jõkke, siis arvestatakse Viljandi elanikkond tinglikult Võrtsjärve 

alamvesikonda kuuluvaks (Keskkonnaministeerium, 2008). Põllumajandusmaad on 

Võrtsjärve alamvesikonnas 1130 km 2 (36,5%) (Järvet, 2003). Üle 1000 loomühikuga 

loomakasvatushooneid on Võrtsjärve alamvesikonnas 4. Kokku on loomakasvatusest 

tulenev koormus umbes 28 000 loomühikut (Keskkonnaministeerium, 2008). Võrtsjärve 

keskkonnale avaldab mõju ka 15 000 loomühikuga Viiratsi Seakombinaat, mis paikneb 

küll Pärnu alamvesikonnas, kuid millest pärinevat sõnnikut laotatakse ka Võrtsjärve 

alamvesikonnas (Keskkonnaministeerium, 2008). 

15

Lühiülevaade Suur-Emajõest 

Suur-Emajõgi on 101 km pikk ja omab 9 740 km 2 suurust valgala. Keskmine äravool on 

70 m 3 /s. Jõe lähe asub Võrtsjärve kirdenurgas 33,0 m kõrgusel merepinnast. Jõe suue 

asub Peipsi järve edelanurgas 29,3 m kõrgusel merepinnast. See teeb jõe languks ainult 4 

cm/km (Keskkonnaministeerium, 2002). 

Lühiülevaade Tartu reoveepuhastusseadmest 

Reovesi suunatakse puhastusseadmesse kahe kollektori kaudu. Neist ühes on vesi 

Tammelinna ja Tähe tänava piirkonnast ( ca 25%) ja teises ülejäänud Tartu linnast (75%). 

Puhastusseade kuulub Tartu Veevärk AS-le, heitvesi juhitakse sellest Emajõkke. 

Reovee mehhaaniline puhastus toimub võrede, liivapüüniste ja eelsetitite abil. Võrepraht 

viiakse prügimäele, liivapüünistes eraldunud liiva kasutatakse puhasti territooriumil 

täitematerjalina. Eelsetiteid on kaks, orgaanika vähesuse tõttu juhitakse enamus veest 

(80%) otse biopuhastuse. Ülejäänud reovesi läbib enne veel ka mehhaanilise osa 

kolmanda etapi ehk eelsetid. Eelsetititest väljuv vesi juhitakse biopuhastusse, sete 

mudatihendajasse. (AS Tartu Veevärk) 

Esimeseks biopuhastuse astmeks on anaeroobsed kambrid. Need on vajalikud reovees 

leiduva fosfori bioloogiliseks eraldamiseks. Järgmiseks astmeks on anoksilised kambrid, 

kuhu juhitakse lisaks puhastatavale veele ka aerotankide lõpust nitraadirikast vee ja 

aktiivmuda segu. Bakterid taandavad nitraadid gaasiliseks lämmastikuks ja tarbivad ära 

nitraadis oleva hapniku. Lämmastik lendub protsessist. Kui orgaanikat on reovees liiga 

vähe, siis protsessi tõhususe suurendamiseks doseeritakse vette metanooli. Edasi tulevad 

aerotankid, kus toimub lõplik bioloogiline puhastus. Need on varustatud 

peenmullaeraatoritega, mille aeratsiooni intensiivsust reguleeritakse automaatika abil nii, 

et lahustunud hapniku kontsentratsioon püsiks 1,0-1,5 mg/l piires. (AS Tartu Veevärk) 

Fosfori täiendavaks ärastamiseks on võimalik vette lisada raud(III)sulfaati, kuid 

bioloogilise fosforiärastuse kõrge efektiivsuse tõttu reeglina seda ei tehta. Aktiivmuda 

eraldatakse veest järelsetitites. Osa sellest tagastatakse biopuhastuse algusetappi 

(anaeroobsesse kambrisse), teine osa eelsetititesse ja ülejäänu suunatakse 

mudatihendajasse. Peale tihendamist muda pressitakse lintfilterpressiga, kasutades 

16

orgaanilist flokulanti. Pressitud muda viiakse kompostimise väljakutele, kus ta segatakse 

puukoorega ja kääritatakse aeroobselt kompostiks. (AS Tartu Veevärk) 

Peale puhasti rekonstrueerimist 2003. aastal oli Tartu puhastusseadme hüdrauliliseks 

jõudluseks kuni 25000 m 3 /d. 2009. aasta rekonstrueerimise järel on võimalik lühiajaliselt 

töötada kuni 75000 m3/d jõudlusega. Veeloa alusel võib puhastist jõkke juhtida heitvett 

mille reoainete maksimaalne sisaldus võib olla järgmine: hõljuvained 15 mg/l, BHT 7 

(bioloogiline hapnikutarve) 15 mg/l, KHT (keemiline hapnikutarve) 125 mg/l, N-üld 10 

mg/l, P-üld 1,0 mg/l. 

Tegeliku koormuse vastavust jõudlusele ja väljavoolava heitvee vastavust veeloa nõuetele 

jälgib AS Tartu Veevärk omaseire käigus. Vooluhulka mõõdetakse puhasti sissevoolus 

pidevalt. Vee proovide võtmiseks on puhasti sisse- ja väljavoolus statsionaarsed 

proovivõtjad. Üldnäitajaid ja naftaprodukte analüüsitakse vähemalt 1 kord nädalas, 

raskemetalle 1 kord kvartalis. 

Proovide võtmine 

Veeproovid Võrtsjärvest ja Suurest-Emajõest koguti standardse batomeetri abil umbes 1 

meetri sügavuselt. Proovid Tartu reoveepuhastist võeti sisse- ja väljavoolust 

statsionaarsete proovivõtjate abil, mis määratud intervalliga kindla koguse proovi 

koguvad. Käesoleva töö jaoks koguti proovi integreeritult 24 tundi jooksul et ühtlustada 

reovee koguste ning allikate ööpäevast varieeruvust. Vesi koguti steriilsetesse nõudesse ja 

transporditi tunni aja jooksul laborisse ja hoiti +4 ˚C juures kuni edasiste protseduurideni 

(kuni 4 tundi). 

17

Joonis 5. Proovide võtmise kohad: Võrtsjärvest Tondisaare lähedusest (A) ja Suur- 

Emajõest Käravere sillalt (B), ja Suur-Emajõest Ihastest (C) umbes 120 m allavoolu 

kohast, kus Tartu reovesi jõkke voolab. 

Bakterite kultiveerimine ja isoleerimine puhaskultuuri 

Käesoleva töö käigus kasutati heterotroofseks plaadiloenduseks kolme söödet: LB, 10% 

LB (kõikide komponentide v. a. agar kontsentratsioon 10 x väiksem), R2A ja ZB (viited 

ja koostis toodud tabelis 1). Ülevaade söötmete taustast on kirjanduse ülevaates. Proovide 

E3, E4 ja T1 – T4 plaadiloendamise kasutati Pseudomonas sp. selekteeriva ühendina 

tsetrimiidi (CTAB; N,N,N-trimetüül-1-heksadekaanamiiniumbromiidi, Applichem; 

Brown ja Lowbury, 1965). 

Söötmed autoklaaviti (Sanyo Labo Autoclave MLS-3780) enne kasutamist 15 minutit 

121 °C juures. 

2. Tabel 1. Eksperimentides kasutatud söötmed. 

Söötme nimi Koostis ja pH temperatuuril 25 ˚C Allikas 

18

(tootja) 

LB Agar, Lennox’i Trüptoon .................................. 10 g/l Lennox, 1955 

järgi 

(Difco) 

Pärmi ekstrakt ............................ 5 g/l 

NaCl ........................................... 5 g/l 

Agar .......................................... 15 g/l 

pH .........................................7,0 ± 0,2 

R2A 

Peptoon .................................... 0,5 g/l Reasoner ja Geldreich, 1985 

(Fluca) 

Pärmi ekstrakt .......................... 0,5 g/l 

Dekstroos ................................. 0,5 g/l 

Tärklis ...................................... 0,5 g/l 

Kaseiini hüdrolüsaat ................ 0,5 g/l 

K 2 PO 4 .......................................0,3 g/l 

Naatriumpüruvaat .................... 0,3 g/l 

MgSO 4 ................................. 0,024 g/l 

Agar .......................................... 15 g/l 

pH ........................................7,2 ± 0,2 

ZoBell 2216E* Peptoon (Bacto TM ) ....................... 5 g/l 

Pärmi ekstrakt (Amresco TM )......... 1 g/l 

Oppenheimer ja ZoBell 

(1952) 

Agar (Bacto TM ) .......................... 15 g/l 

pH** 

* - 1 liitri söötme valmistamiseks kasutatakse 800 ml GF/F (Whatman) filtreeritud 

proovivett ja 200 ml destilleeritud vett. 

** - Söötme pH väärtus sõltub proovist, mida kasutatakse valmistamiseks. 

Proovide söötmele kandmiseks kasutati kahte meetodit: PK ja SK, detailsemalt 

kirjeldatud kirjanduse ülevaates. Esimesel juhul kanti proov juba tardunud agarsöötmega 

Petri tassidele ning hõõruti spaatliga sisse. Süviskülvi puhul lasti agarsöötmel jahtuda 

temperatuurini 40 – 45 °C, seejärel kanti proov Petri tassi põhja ja valati jahutatud sööde 

proovile peale, samal ajal tassi ettevaatlikult loksutades, et toimuks ühtlane segunemine. 

Inokuleerimine toimus hiljemalt kuue tunni möödumisel proovi võtmisest. E4 (tabel 2) 

19

proovi kultiveerimisel kasutati tardsöötme saamiseks paralleelselt madalal temperatuuril 

(~ 17 ˚C) geelistuvat agaroosi (Low Melt S, Applichem). 

Võrtsjärvest võetud proovide külve (V1 – V9, vt. tabel 2) inkubeeriti temperatuuril 17 °C, 

ülejäänud juhtudel toatemperatuuril (20 – 22 °C). Kolooniad loendati kahe nädala 

möödudes ja arvutati proovide CFU arvukus ml kohta. 

Puhaskultuuri isoleerimine 

Järgmise etapina valiti tassidelt kolooniad, mida hakata puhaskultuuri isoleerima. 

Valitavate kolooniate arv varieerus erinevate proovide tasside vahel 1 – 4. Kolooniate 

valik toimus koloonia morfoloogia alusel, isoleeriti võimalikult erinevaid, aga eelistati 

kõige arvukamaid. Ümberkülv toimus samale söötmele uuele Petri tassile, mida 

inkubeeriti toatemperatuuril 20 - 22 °C kuni piisava rakumassi kasvamiseni. Seejärel tehti 

uus ümberkülv üksikkoloonia (puhaskultuuri) saamiseks. 

Puhaskultuurist tehti ümberkülv 3 ml vedelsöötmega (sama, millelt isoleeriti) katseklaasi 

ja kasvatati baktereid eksponentsiaalse faasi lõppjärku (kultuur muutus silmaga nähtavalt 

häguseks). Seejärel pipeteeriti 900 µl kultuuri suspensiooni kolme 1.5 ml tuubi 

(Eppendorf). Kahest tehti genoomse DNA eraldamiseks pelletid (tsentriuugiti 5 minutit 

8000 g juures, et rakud tuubi põhja suruda, suspensioon eemaldati) ja ühele lisati 50% 

(v/v) filter-steriliseeritud glütserooli (lõppkontsentratsioon 15%) ja pandi külmutuskappi 

( - 85 °C) pikaajaliseks säilitamiseks. 

Genoomse DNA ekstraheerimine 

Puhaskultuurist saadud bakterite pelletitest DNA eraldamiseks kasutati meetodit, mille 

puhul nukleiinhapped seonduvad ränile kaotroopsete ühendite juuresolekul (GuSCN - 

guanidiinium tiotsüanaat; Boom et al, 1990). Ekstraheerimise etapid olid järgmised: 

1. Bakterirakud suspendeeriti 50 µl mQ (milli Q)vees. 

2. Lisati 900 µl lüüsipuhvrit L6 (120 g GuSCN + 100 ml 0,1M Tris HCl pH 6,4 + 22 

ml 0,1M EDTA (etüleendiamiintetraatsetaat; pH 8,0 + 2,6 g Triton), segati. 

20

3. Lisati 20 µl räni suspensiooni (segati eelnevalt Vortexil), suspendeeriti, 

inkubeeriti toa-temperatuuril 5 minutit. Lahust tsentrifuugiti 2300 g juures 10 

sekundit (Eppendorf Centrifuge 5415R) 

4. vedelik eemaldati. 

5. Lisati 1 ml pesupuhvrit L2 (5M GuSCN), suspendeeriti, tsentrifuugiti 2300 g 

juures 10 sekundit, vedelik eemaldati. 

6. Lisati 1 ml 50% etanooli, suspendeeriti, tsentrifuugiti 10 000 g juures 30 sekundit, 

vedelik eemaldati. 

7. Inkubeeriti lahtiselt 5 minutit 37 °C juures. 

8. Lisati 50 L mQ vett, inkubeeriti 37 °C juures 5 minutit. 

9. Tsentrifuugiti 16 000 g juures 1 minut. 

10. Saadud DNA lahus pipeteeriti uude puhtasse Eppendorfi 1,5 ml tuubi. 

Ekstraheerimise õnnestumine tehti kindlaks geelelektroforeesiga 1% agaroosgeelil 1X 

TAE puhvris (50 mM Tris-atsetaat, 1 mM EDTA, pH 8,2). Kasutati 4 µl DNA lahust, mis 

värviti 1 µl broomfenoolsinisega. Geelelektroforees toimus toatemperatuuril ja pingel 90 

– 100 V (EPS 301, GE Healthcare). DNA säilitati külmutuskapis temperatuuril – 20 °C. 

Joonis 6. Kasutatud praimerite 16S rRNA geenile kinnitumise skeem konserveerunud 

aladega ja kasutatud paimerite kinnitumise positsioonid E. coli 16S rRNA geenis (Lane, 

1991). 

21

16S rRNA geeni amplifitseerimine 

Isolaatidest ekstraheeritud DNA-ga viidi läbi PCR-i, selleks kasutati Bacteria domeeni 

16S rRNA geenile universaalseid praimereid: 27F (5' AGAGTTGATCATGGCTCAG 3'; 

kinnitub positsioonidele 8 kuni 27 Escherichia coli 16S rRNA geenis) ja 1492R (5' 

TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'; kinnitub positsioonidele 1492 kuni 1507 E. coli 

16S rRNA geenis; Lane 1991). Joonisel 6 on esitatud bakterite rRNA väikse subühiku 

skeem ja praimerite kinnitumiskohad. Praimeri lõppkontsentratsioon PCR-i segus oli 10 

µM. PCR toimus järgmise programmi järgi: 

• 96 °C 5 min; 

• 94 °C 1 min, 47 °C 1 min, 72 °C 2 min (29X); 

• 72 °C 5 min; 

• 4 °C ∞. 

PCR viidi läbi aparaadiga GenAmp PCR Syctem 2700 (Applied Biosystems) ja 25 µl 

reaktsioonisegude valmistamiseks kasutati PCR Master Mix 2X (Fermentas). Reaktsiooni 

õnnestumist 

PCRi segust puhastati DNA, milleks kasutati Quantum MSB® Spin PCRapace kitti 

(Invitek) vastavalt tootja etteantud antud protokollile. Lahuse DNA sisaldus mõõdeti 

spetrofotomeetri abil (NanoDrop ND-1000). Sekveneerimisreaktsiooniks valmistati 

lahus, mis sisaldas 20-40 ng DNA-d, 1,6 pmol 27F praimerit (Lane, 1991). 

Sekveneerimine viidi läbi Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudi 

tuumiklabori sekvenaatoril ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems). 

Järjestused joondati ja korrastati kromatogrammi alusel programmiga Sequencher 4.9 

(Gene Codes Corporation kodulehekülg). Seejärel joondatud järjestused ekspoditi 

FASTA failiformaadis ja laaditi Ribosomal Database Project (RDP-II; ingl. k. 

ribosomaalse andmebaasi projekt) töökanalisse (Cole et al, 2009). RDP-II pakub kiiret ja 

usaldusväärset 16S RNA geenijärjestuse analüüsimise tarkvara (sekundaarstruktuure 

arvestav joondamine) ja andmebaasi (rohkem kui 600 000 järjestust), mida uuendatakse 

ja kontrollitakse igakuiselt (Cole et al, 2009). Fülogeneetiliste puude koostamiseks 

kasutati programmi MEGA4 (Tamura et al 2007). 

22

3. Tabel 2. Proovide võtmise kuupäevad ja asukohad. 

Lühend Kuupäev Proovi võtmise koht Kasutatud söötmed 

V1 20.07.2007 Võrtsjärv LB, R2A ja ZB 









E1 31.10.2009 Emajõgi R2A, R2A + CTAB, LB + CTAB, 

ZB + CTAB 

E2 12.11.2009 Emajõgi R2A, R2A + CTAB, LB + CTAB, 

ZB + CTAB 

T1 11.12.2009 Tartu reoveepuhasti LB, R2A ja ZB; 

LB + CTAB, R2A + CTAB, ZB + CTAB 







23

Tulemused 

Võrtsjärv 

Proovid Võrtsjärvest võeti tabelis 2 toodud kuupäevadel. Kasutati kahte külvitehnikat 

(PK ja SK) kombinatsioonis kolme söötmega (tabel 2) ehk kuus erinevat kombinatsiooni, 

mis kõik külvati kolmes korduses. Külvid tehti lahjendamata järveveest (150 µl) 

Kolooniad loendati korduvalt kuni 10 päeva möödudes ja arvutati CFU ml -1 (toodud 

joonisel 7). 

16 

14 

CFU/ml X 1000 

12 

10 

8 

6 

4 

ZB PK 

ZB SK 

R2A PK 

R2A SK 

LB PK 

LB SK 

2 

0 

20.07.2007 

08.08.2007 

22.08.2007 

26.09.2007 

31.10.07 

14.01.08 

12.02.08 

05.03.08 

14.06.08 

Joonis 7. Üheksa Võrtsjärve proovi (kuupäev antud) keskmised CFU-d ml -1 saadud kolme 

erineva söötme (LB, R2A ja ZB) ja kahe külvitehnikaga (PK - pindkülv, SK - süviskülv). 

Kõik kombinatsioonid külvati kolmes korduses, standardhälve antud tulbal. 

Kõikidel söötmetel kasvas SK tehnikaga keskmiselt rohkem kolooniaid, kui PK tehnikaga 

inokuleeritud tassidel: 1,8 ± 1,2 (LB), 1,5 ± 0,98 puudu (R2A) ja 3,3 ± 1,5 (ZB) korda 

rohkem. Erinevaid kombinatsioonide võrreldi standardse R2A SK suhtes (joonis 8). 

24

Statistiliselt usaldusväärselt erinesid (p

Tabel 3. Süvis- ja pindkülvi meetodite tulemuste korrelatsioon erinevatel söötmetel. 

Paaris T-test N r p 

ZB ZB PK ja ZB SK 9 ,921 ,000 

LB LB PK ja LB SK 9 ,797 ,010 

R2A R2 PK ja R2 SK 9 ,667 ,050 

Joonis 9. 75 isoleeritud tüve jaotusid 5 hõimkonna vahel (eraldatud paksema 

punase joonega). Peenema punase joonega on eraldatud α-, β- ja γ- 

Proteobacteria klassid. Liiginimed on alla joonitud vastavalt söötmele, millelt see 

isoleeriti: LB-lt (kollane), R2A-lt (sinine), ZB (roheline) ja mitmelt (hall). Puu 

26

vamistamiseks kasutati WWNJ (Weighbor weighted neighbor-joining) 

algoritmiga. 

Suur-Emajõgi 

Suurest-Emajõest võeti proovid koodiga E1 ja E2 (tabel 2). E1 proovi üldarvukuse 

loendiks (ilma CTAB-ta) külvid tehti R2A SK kombinatsiooniga (inokulum 150 µl 

lahjendamata jõevett). Saadud keskmised CFU-d on toodud joonisel 10. CTAB-ga (0,3 

gl -1 ) tehti samati kõik külvid SK tehnikaga ja LB, R2A ja ZB söötmetele. Kõigi plaatide 

peale kokku kasvas ainult üks koloonia (enne Tartu linna, R2A söötmega), 16S rDNA 

järjestus andis RDP andmebaasis 100% sarnasuse Pseudomonas fragii-iga. 

12000 

10000 

8000 

CFU/ml 

6000 

4000 

2000 

0 

SK PK SK PK 

Enne Tartut 

Pärast Tartut 

Joonis 10. Suure-Emajõe proovi (E1) R2A söötme ning PK ja SK tehnika saadud 

kolooniate arv ml kohta enne (Käravere sild) ja pärast Tartu linna (Ihaste). Studenti t- 

testid andis tulemuseks, et keskmiste erinevus enne ja pärast linna pole kummagi tehnika 

puhul statistiliselt oluline (Student t, p>0,05). 

E2 proovi (tabel 2) külvid tehti sarnaselt E1 proovi külvidele, v. a. inokulumi mahuks 300 

µl ja üldarvukuse loendamiseks kasutati ainult R2A süviskülvi. Keskmiselt oli CFU-de 

arvukus ml kohta (± standardhälve) 7765 ± 820 (enne Tartut) ja 7277 ± 501 (pärast 

Tartut), statistiliselt oluline erinevus puudus (Student t, p=0,85). CTAB-ga 

selektiivsöötmetel kasvas kõigi plaatide peale kokku 3 kolooniat (enne Tartu linna, 

R2A). 16S rDNA järjestuse järgi sarnanes ta kõige enam Azospirillum brasilense-ga. 

27

Tartu Reoveepuhasti 

Proovid Tartu reoveepuhastist võeti tabelis 2 näidatud kuupäevadel Tartu 

reoveepuhastusjaama sissevoolust ja väljavoolust. Kõik külvid tehti SK tehnikaga. 

Inokumina kasutati kuni 1000 kordset sissevoolu ja kuni 10 kordset väljavoolu 

lahjendust, mille valmistamiseks kasutati steriilset fosfaatpuhvrit (pH 7,2). Söötmetena 

kasutati LB, R2A ja ZB söötmeid ilma ja 0,3 gl -1 (CTAB tsetrimiidiga). Tassid loeti kahe 

nädala möödudes ja arvutati CFU ml kohta. Keskmised CFU ml -1 on toodud joonisel 11 

(ilma CTAB-ta) ja joonisel B (CTAB-iga). CTAB-ta söötmetel moodustab väljavoolu 

bakterite arvukus sissevoolu omast 0,55 – 8,2%. CTAB-iga jäid need suhted vahemikku 

0,03 – 4,1%. 

HPC sissevoolust (S) ja väljavoolust (V) 

10000,0 

CFU/ml x 1000 

1000,0 

100,0 

10,0 

S LB 

V LB 

S R2A 

V R2A 

S ZB 

V ZB 

1,0 

11.12.2009 20.01.2010 26.02.2010 30.03.2010 

Joonis 11. CFU-de arvukus loetud kolmel erineval söötmel (LB, R2A ja ZB) sissevoolus 

(S) ja väljavoolust (V). Kõik kombinatsioonid (v. a. 11.12.09 tehtud S LB, S R2A ja S ZB) 

tehti kolmes korduses, tulpadele on kantud standardhälve. 

Kokku koguti 204 isolaati, millest 183-st õnnestus saada piisava pikkusega ja 

kvaliteediga 16S rDNA järjestused, mis 99% sarnasuse alusel joondamisel jagunesid 42- 

ks genotüübiks (nimekiri lisas 2; nende jaotumine söötmete ning sissevoolu/väljavoolu 

vahel toodud joonisel 14.) Isolaatide hulgas kõige sagedamini esinevad liigid on välja 

toodud joonisel 13 Kõik 42 tüve kuulusid Proteobacteria hõimkonda. 

28

HPC sissevoolust (S) ja väljavoolust (V) 

tsetrimiidiga selektiivsöötmetel 

100000 

CFU/ml 

10000 

1000 

100 

10 

S LB C 

V LB C 

S R2A C 

V R2A C 

S ZB C 

V ZB C 

1 

11.12.2009 20.01.2010 26.02.2010 30.03.2010 

Joonis 12. CFU-de arvukus loetud kolmel erineval söötmel (LB, R2A ja ZB) sissevoolus 

(S) ja väljavoolust (V).Kõikidele söödetele on lisatud tsetrimiid (0,3 gl -1 ). Tulpadele on 

kantud standardhälve. 

Pseudomonas fluorescens 

Serratia marcescens 

Pseudomonas putida 

Pseudomonas fragi 

Aeromonas salmonicida 

Rhizobium radiobacter 



Aeromonas hydrophila 

Pseudomonas chlororaphis 

Pseudomonas mosselii 


Pseudomonas aeruginosa 

0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 18% 

Joonis 13. Tartu reovee levinumad CTAB-il kasvada suutvad bakterid (% isolaatidest) 

29

Joonis 14. Tartu reoveest isoleeritud 42 tüve jaotus 16S rDNA alusel, välisgrupina 

kasutusel RDP andmebaasist valitud järjestus. Allajoonitus ja kastide märgistus seletatud 

legendis. Number nime järel olev number näitab sarnasust, sulgudes number näitab 

30

antud tüve % esinemissagedust isolaatide hulgas. Ära on märgitud ka sööde ja koht, kus 

antud tüve leiti. Värvid seletatud legenidis. Fülogeneetilise puu välisgrupiks on valitud 

järjestus RDP andmebaasist (Aerococcus christensenii), algoritmina kasutati WWNJ. 

183-st tüvest kasvasid 37 LB söötmel (20,2%), 79 R2A-l (43%), 67 ZB-l (36,6%). 94 

(51%) isolaati koguti sissevoolust ja 89 (49%) väljavoolust. 

31

Arutelu 

Võrtsjärv 

Antud töö käigus bakterite arvukust otseste meetoditega ei hinnatud, võib kirjanduse 

põhjal oletada, et bakterioplanktoni arvukus jääb vahemikku 1 - 6 x 10 6 rakku ml kohta 

(Kisand ja Nõges, 1998), mille alusel võib pakkuda, et kultiveeritavate bakterite osakaal 

jääb alla 1%. 

SK on olnud standardne tehnika joogivee proovide kultiveerimisel. Sellele vastuseisuks 

on ilmunud mitmed artiklid, kus on näidatud, et R2A söötmel kasvab joogivee proovide 

puhul PK tehnikaga rohkem kolooniaid (Gibbs ja Hayes 1988; Massa et al 1998). Kuna 

PK ja SK R2 arvukused olid kõikuvad, siis võib oletada, et seda põhjustab mõni ainult sel 

söötmel kasvav bakter. Joonisel 15. On toodud ainult R2A söötmel kasvanud liigid. 

4. Joonis 15 Võrtsjärve proovidest (V1 – V9) ainult R2A söötmelt isoleeritud 

bakterplanktoni tüved. Sinise alusjoonega on märgitud süviskülvi tehnikaga ja punase 

alusjoonega pindkülvi tehnikaga isoleeritud bakteri. Välisgrupina kasutasin Deinococcus 

aquaticus-t, algoritmina WWNJ. 

32

E1 (tabel 2) võetud proovilt kasvas kõikidel söötmetel keskmiselt mitu korda rohkem 

kolooniaid, kui teistest proovidest. Üheks põhjuseks on sügisene bakterplanktoni 

arvukuse tõus (Kisand ja Nõges, 1998), kuid oktoobri lõpp võib olla selleks juba liiga 

hiline. 31.10.07 isoleeritud tüvide hulgas oli mitu Rhodococcus faciensi (fütopatogeen) ja 

Aeromonas veronii. 

Katsed (külvid E1 ja E2) Emajõest selektiivsöötmega Pseudomonas sp. tüvesid isoleerida 

luhtusid ja kokku isoleeriti ainult üks tüvi, mis 99% sobivusprotsendi alusel joondus 

reoveepuhastusjaamast isoleeritud P. fragii tüvedega. 

Tabel. Tartu reoveepuhastusjaama läbiva heitvee kogus ja keskmine CFU/ml R2A 

söötmel. 

Kuupäev: m 3 /päevas CFU/ml X 1000 Standardhälve 

11.12.2009 41860 400 2,4041631 

19.01.2010 26630 6606 0,8717798 

25.02.2010 23620 5300 11,619954 

30.03.2010 73610 1561 0,9960087 

Tabelis on näha, et elujõuliste bakterite arv sissevoolus sõltub päevasest läbivoolust, mida 

suurem on läbivool, seda lahjem on proov. Läbivoolu hulk sõltub märtsis võetud proovi 

puhul põhiliselt sademetest. 

Lämmastukku fikseeriv Rhizobium radiobacter esines reovees tihti, kekmiselt 7,1% 

kõigidest isolaeeritud bakteritest. Lämmastikku fikseerivale bakterile on kindlasti 

anoksiline kamber kõige sobivam keskkond, kus kasvada, sest vabaneb N 2 ja puudub 

hhapnik, mis enüümile konkureeriks. 

Reoveepuhasti sissevoolust isoleeriti mitmeid patogeene, sealhulgas Salmonella eneterica 

ssb. enterica ja Pseudomonas aeruginosa jt. Väljavoolus neid baktereid ei isoleeritud. 

Sellest võib oletada, et puhastusjaam töötab efektiivselt. 

33

Kokkuvõte 

Käesoleva töö käigus rakendati erinevaid heterotroofsete bakterite 

kultiveerimismeetodeid. 

Võeti proove kolmest erinevast eutroofsest vesikeskkonnast (Võrtsjärv, Suur-Emajõgi ja 

Tartu reoveepuhastusjaam) 15 erineval korral. Heterotroofsete bakterite kultiveerimiseks 

kasutati kolme erinevat söödet: LB, R2A ja ZB ning kahte külvitehnikat. 

Isoleeriti üle kolmesaja bakteritüve, mis jagunesid 117-ks erinevaks tüveks, mis 

omakorda kuulusid viide kultiveeritavate bakterite hõimkonda: Proteobacteria, 

Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, ja Deinococcus-Thermus. 

Süviskülviga tassidel kasvas suurema koloooniate arvukusega poolest kuid erinevaid 

tüvesid isoleeriti rohkem pindkülvi meetodiga. Ükski sööde ei pasitnud teistest otseselt 

välja, sest paljud bakterid kasvasid ainult ühe söötmega tassil ja nii kõikide söötmetega. 

Tartu reovees isoleeriti palju Pseudomonas esindajaid, neist arvukaimad P. Fluorescens ja 

aeruginosa. 

34

Heterotrophic plate count in surface and waste water 

Peetetr Laas 

Summary 

Heterotrophic plate count was performed with euthrophic lake and wastewater samples, 

total 15 different samples. Three different growth media were used (LB, R2A and ZB) 

combined with to different cultivation methods. 

More than 300 different bacterial isolates were collected and 177 different strains were 

identified. They all belonged to five phyla: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, 

Actinobacteria, ja Deinococcus-Thermus. 

More viable bacteria grew when pour plate method was used, spread plate method 

resulted smaller counts. 

No specific media can be highlighted because there were bacterial taxons that would have 

been left out if one of the media would been left out. 

Many different Pseudomonas sp. were isolated from wastewater, the most abundant ones 

were P. Putida and P. Fluorescens. 

35

Kasutatud kirjandus 

Raamatud 

APHA, AWWA ja WPCF (1985). Standard Methods for the Examination of Water and 

Wastewater, 16. väljaanne. American Public Health Association, American Water Works 

Association, Water Environment Federation. 

Atlas, R. M. (2005). Handbook for media for environmental microbiology (teine 

väljaanne). CRC Press. 

Bitton, G. (2005). Wastewater Microbiology, 3rd edition. (Toim.) R. Wiley. 

Heritage, J; E. Glyn, V. Evans ja R. A.. Killington (1998). Introductory microbiology. 

Cambridge University. Press 1998, lk 106 – 111. 

Järvet, A. (2003). Võrtsjärve asend ja valgala loodusolud. (Toim.) Haberman, J., Pihu., 

Raukas, A.. Võrtsjärv lk 11-31. Tallinn: Eesti Entsüklopeediakirjastus. 

Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic Acid Techniques in Bacterial 

Systematics, lk 115–175. (Toim.) E. Stackebrandt ja M. Goodfellow. 

Maier, R. M.; I. L. Pepper ja C. P. Gerba (2009). Environmental microbiology, teine 

väljaanne. Elsevier Inc. 

Migula, N. (1894). Arbeiten aus dem Bakteriologischen Institut der Technischen 

Hochschule zu Karlsruhe 1, lk 235–238. 

Reasoner, D.R., 1990. Monitoring heterotrophic bacteria in potable water. In: McFeters, 

G.A. (Ed.), Drinking Water Microbiology— Progress and Recent Developments. 

Springer-Verlag, New York, lk 452–477. 

36

Reinart, A. ja Nõges, P. (2003). Võrtsjärve valgusolud. (Toim.) Haberman, J., Pihu, E. 

& Raukas, A. Võrtsjärv. Loodus, aeg, inimene. Eesti Entsüklopeediakirjastus. 

WHO. Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safety (2003) . (Toim.) J. 

Bartram, J. Cotruvo, M. Exner, C. Fricker, A. Glasmacher. World Health Organization, 

Geneva. 

Artiklid 

Alain K ja J Querellou (2009). Cultivating the uncultured: limits, advances and future 

challenges. Springer 13, lk 583–594. 

Boom, R.; C. J. Sol; M. M. Salimans; C. L. Jansen; P. M. Wertheim-van Dillen ja J. 

van der Noordaa (1990). Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. 

Journal of Clinical Microbiology, lk 495-503. 

Brown, V. I. ja Lowbury, E. J. L. (1965). Use of improved cetrimide agar medium and 

other culture methods for Pseudomonas aeruginosa. - J. Clin. Pathol., 18; lk 752-756. 

Cole, J. R.; Q. Wang; E. Cardenas; J. Fish; B. Chai; R. J. Farris; A. S. Kulam-Syed- 

Mohideen; D. M. McGarrell; T. Marsh; G. M. Garrity ja J. M. Tiedje (2009). The 

Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. 

Nucleic Acids Res. 37 (Andmebaasi väljaanne), lk 141-145. 

community structure in nature and implications for microbial ecology. Current Opinion 

in Microbiology 7, lk 221–226. 

Curtis, T. P. ja W. T. Sloan (2004). Prokaryotic diversity and its limits: microbial 

Galvez, A.; M. Maqueda; M. Martinez-Bueno; E. Valdivia (1998). Publication rates 

reveal trends in microbiological research. ASM News 64, lk 269–75 

37

Gibbs, R. A. ja C. R. Hayes (1988). The use of R2A medium and the spread plate 

method for the enumeration of heterotrophic bacteria in drinking water. Letters Applied 

Mirrobiology 6, lk 19–21. 

Jannasch, H. W. ja G. E. Jones. (1959). Bacteria populations in sea water as determined 

by different methods of enumeration. Limnol. Oceanogr. 4, lk 128 – 139. 

Kisand V. ja T. Nõges (2004). Abiotic and biotic factors regulating dynamics of 

bacterioplankton in a large shallow lake. Fems Microbiology Ecology 50, lk 51–62. 

Kisand, V. ja T. Nõges (1998). Seasonal dynamics of bacterioand phytoplankton in large 

and shallow eutropic Lake Võrtsjärv, Estonia. Int. Rev. Hydrobiol. 83, lk 205–216. 

Lennox, E. S. (1955). Transduction of linked genetic characters of the host by 

bacteriophage P1. Virology. 1:190. 

M. Achtman and M. Wagner, Microbial diversity and the genetic nature of microbial 

species, Nat. Rev. Microbiol. 6 , 431–440. 

Massa, S.; M. Caruso; F. Trovatelli ja M. Tosques (1998). Comparison of plate count 

agar and R2A medium for enumeration of heterotrophic bacteria in natural mineral water. 

World Journal of Microbiology & Biotechnology, 14, lk 727–730. 

Oh, J.; K. Lee; K. Kim; J. Kim; Y. Choung ja J. Park (2009). A novel laboratory 

cultivation method to examine antibiotic-resistance-related microbial risks in urban water 

environments. Water Science and Technology, Volume: 59, Issue 2, lk 347-352. 

Oppenheimer, C. H. ja C. E. ZoBell (1952). The growth and viability of sixty-three 

species of marine as influenced by hydrostatic pressure. J. Mar. Res. 11, lk 10-18. 

Pace, N. R. (1997). A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 

276, lk 734–40. 

38

Pace, N. R.; D. A. Stahl; D. J. Lane ja G. J. Olsen (1986). The analysis of natural 

microbial-populations by ribosomal-RNA sequences. Adv. Microb. Ecol. 9, 1–55 

Park, S. H.; K. K. Kwon; D. Lee ja H. K. Lee. (2002). Morphological Diversity of 

Marine Microorganisms on Different Isolation Media. The Journal of Microbiology, lk 

161-165. 

Parkes, R. J.; B. A. Cragg; S. J. Bale; J. M. Getlifff; K. Goodman; P. A. Rochelle J. 

C. Fry; A. J. Weightman ja S. M. Harvey (1994). Deep bacterial biosphere in Pacific 

Ocean sediments. Nature 371, lk 410 – 413. 

Rappe M. S.; S. A, Connon; K. L. Vergin; S. J. Giovannoni (2002). Cultivation of the 

ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade . Nature 418, lk 630 – 633. 

Reasoner, D. J. ja E. E. Geldreich (1985). A new medium for the enumeration and 

subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology 49, 

lk 1-7. 

Renesto, P; N. Crapoulet, H. Ogata, B. La Scola, G. Vestris, J-M. Claverie, D. 

Raoult (2003). Genome-based design of a cell-free culture medium for Tropheryma 

whipplei, The Lancet, Volume 362, Issue 9382, lk 447-449. 

Rusch, D B; A. L. Halpern; G. Sutton; K. B. Heidelberg; S. Williamson; S. Yooseph; 

D. Wu; J. A. Eisen; J. M. Hoffman; K. Remington; K. Beeson; B. Tran; H. Smith; 

H. Baden-Tillson; C. Stewart; J. Thorpe; J. Freeman; J; C. Andrews-Pfannkoch; J. 

E. Venter et al (2007). The Sorcerer II Global Ocean sampling expedition: northwest 

Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS Biol, Volume 5, Issue 3, lk 432 – 466. 

39

Staley, J. T. ja A. Konopka (1985). Measurement of in situ activities of 

nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Applied and 

Environmental Microbiology 39, lk 321 - 346. 

Tamura K.; J. Dudley; M. Nei ja S. Kumar (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary 

Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24, 

lk1596-1599. 

Van Eldere, J (2003). Multicentre surveillance of Pseudomonas aeruginosa susceptibility 

patterns in nosocomial infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 51, lk 347- 

352. 

Whitman, W.B.; D. C. Coleman ja W. J. Wiebe (1998). Prokaryotes: the unseen 

majority. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, lk 6578–6583 

Woese, C. R. ja G. E. Fox. (1977). Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the 

primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, lk 5088–5090. 

ZoBell, C. E. (1941). Studies on marine bacteria. I. The cultural requirements of 

heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research 4, lk 42-75. 

Clarke, P. (1982). The metabolic versatility of pseudomonads.Antonie Van 

Leeuwenhoek 48, lk 105–130. 

Clarke, P. ja M. H. Richmond (1975). Genetics and Biochemistry of Pseudomonas. 

New York, USA: John Wiley & Sons. 

Reineke, W. (1998). Development of hybrid strains for the mineralization of 

chloroaromatics by patchwork assembly. Annu Rev Microbiol 52, lk 287–331. 

40

Timmis, K.N. ja D. H. Pieper (1999). Bacteria designed for bioremediation. Trends 

Biotechnol 17, lk 200–204. 

Ramos, J. L.; A. Wasserfallen; K. Rose ja K. N. Timmis (1987). Redesigning 

metabolic routes: manipulation of TOL plasmid pathway for catabolism of 

alkylbenzoates. Science 235, lk 593–596. 

Gilbert, E.S.; A. W. Walker ja J. D. Keasling (2003) A constructed microbial 

consortium for biodegradation of the organophosphorus insecticide parathion. Appl 

Microbiol Biotechnol 61, lk 77–81. 

Internet 

International Lake Environment Committee koduleht - 

http://www.ilec.or.jp/database/eur/eur-47.html 

Gene Codes Corporation koduleht - http://www.genecodes.com/ 

Muud dokumendid 

Keskkonnaministeerium, Tartumaa keskkonnateenistus (2008). Käskiri nr 636. 

Võrtsjärve alamvesikonna veemajanduskava. 

Keskkonnaministeerium. AS Eesti Veevärk (2002). Eestis kuni 2000 ie suuruste 

reostusallikate reovee (sademe-, olme- ja tootmisvee) puhastustehnoloogiate ja 

reoveesette käitlemise soovitusliku juhendmaterjali koostamine parima võimaliku tehnika 

tunnuste määramiseks (Rakenduslik töö). Leping nr 2-15-16/40. 

AS Tartu Veevärk (2010). Üldandmed 

41

Lisad 

Lisa 1 

Perek (S_ab scorre RDP) Isolaate LB R2 Zob SK PK 

% 

kõikidest 

Massilia timonae 0,992 6 2 3 1 3 3 3,9 

Chryseobacterium sp. 0,971 5 3 2 2 3 3,9 

Arthrobacter agilis 0,989 5 4 1 3 2 3,9 

Aeromonas veronii 0,999 5 2 2 1 4 1 3,1 

Paracoccus marcusii 0,991 4 1 1 2 1 3 3,1 

Elizabethkingia meningoseptica 0,998 4 1 3 2 2 3,1 

Brevundimonas vesicularis 0,995 4 1 1 2 1 3 3,1 

Acinetobacter lwoffii 1,000 4 2 2 2 2 2,3 

Rhodococcus fascians 0,998 3 3 1 2 2,3 

Pedobacter cryoconitis 0,975 3 3 1 2 2,3 

Micrococcus luteus 1,000 3 2 1 3 2,3 

Microbacterium trichotecenolyticum 0,999 3 1 2 3 2,3 

Kocuria rosea 0,996 3 1 1 1 1 2 2,3 

Bacillus simplex 1,000 3 2 1 3 2,3 

Bacillus licheniformis 1,000 3 3 2 1 1,6 

Sphingomonas faeni 1,000 2 1 1 1 1 1,6 

Rathayibacter tritici 1,000 2 2 2 1,6 

Oxalobacter sp. 0,996 2 2 2 1,6 

Methylobacterium hispanicum 1,000 2 1 1 1 1 1,6 

Bacillus safensis 1,000 2 2 2 1,6 

Bacillus indicus 0,984 2 2 2 1,6 

Arthrobacter sulfonivorans 1,000 2 2 2 1,6 

Aeromonas sobria 1,000 2 2 2 1,6 

Acinetobacter johnsonii 1,000 2 2 2 1,6 

Acidovorax defluvii 0,994 2 1 1 1 1 0,8 

Variovorax paradoxus 1,000 1 1 1 0,8 

Streptomyces griseus 1,000 1 1 1 0,8 

Stenotrophomonas maltophilia 0,997 1 1 1 0,8 

Sphingobium amiense 0,984 1 1 1 0,8 

Sphingobacterium sp. 0,962 1 1 1 0,8 

Sphingobacterium faecium 0,979 1 1 1 0,8 

Rheinheimera texasensis 0,992 1 1 1 0,8 

Ralstonia pickettii 0,990 1 1 1 0,8 

Pseudomonas veronii 0,999 1 1 1 0,8 

Pseudomonas fluorescens 0,999 1 1 1 0,8 

Pseudomonas alcaligenes 1,000 1 1 1 0,8 

Porphyrobacter sp. 0,999 1 1 1 0,8 

Pedobacter panaciterrae 0,989 1 1 1 0,8 

Paracoccus sp. 1,000 1 1 1 0,8 

42

Paracoccus marcusii 0,986 1 1 1 0,8 

Paenibacillus chondroitinus 0,999 1 1 1 0,8 

Paenibacillus borealis 0,995 1 1 1 0,8 

Paenibacillus amylolyticus 1,000 1 1 1 0,8 

Microbacterium phyllosphaerae 1,993 1 1 1 0,8 

Microbacterium phyllosphaerae 1,000 1 1 1 0,8 

Microbacterium esteraromaticum 0,997 1 1 1 0,8 

Massilia timonae 0,992 1 1 1 0,8 

Massilia brevitalea 0,989 1 1 1 0,8 

Janthinobacterium agaricidamnosum 0,982 1 1 1 0,8 

Janibacter marinus 1,000 1 1 1 0,8 

Haloanella gallinarum 0,979 1 1 1 0,8 

Frigoribacterium faeni 1,000 1 1 1 0,8 

Flavobacterium succinicans 0,991 1 1 1 0,8 

Flavobacterium limicola 0,989 1 1 1 0,8 

Flavobacterium johnsoniae 0,976 1 1 1 0,8 

Flavobacterium columnare 0,994 1 1 1 0,8 

Exiguobacterium undae 0,992 1 1 1 0,8 

Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii 

0,999 1 1 1 0,8 

Deinococcus aquaticus 0,996 1 1 1 0,8 

Clavibacter michiganensis 0,991 1 1 1 0,8 

Chryseobacterium sp. 0,972 1 1 1 0,8 

Chryseobacterium sp. 0,965 1 1 1 0,8 

Caulobacter henricii 0,996 1 1 1 0,8 

Brevundimonas variabilis 0,991 1 1 1 0,8 

Brevundimonas variabilis 0,990 1 1 1 0,8 

Brevundimonas subvibrioides 0,986 1 1 1 0,8 

Brevundimonas sp. 0,992 1 1 1 0,8 

Brevundimonas bullata 1,000 1 1 1 0,8 

Brevundimonas bullata 0,991 1 1 1 0,8 

Bacillus sp.0,984 1 1 1 0,8 

Bacillus mycoides 0,997 1 1 1 0,8 

Bacillus barbaricus 1,000 1 1 1 0,8 

Bacillus barbaricus 1,000 1 1 1 0,8 

Arthrobacter sp. 0,990 1 1 1 0,8 

Aeromonas popoffii 0,997 1 1 1 ### 

Lisa 2 

Esinemis 

sagedus 

(%) Bakter/tüvi Isolaate LB R2 ZB 

0,55 

Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans 

0,991 1 1 

1,09 Acinetobacter haemolyticus 0,983 2 2 

43

0,55 Aeromonas allosaccharophila 1,000 1 1 

4,37 Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila 1,000 8 1 6 1 

5,46 Aeromonas salmonicida 1,000 10 2 6 2 

1,64 Alcaligenes faecalis 0.996 3 1 2 

0,55 Alcaligenes faecalis 1,000 1 1 

1,09 Citrobacter amalonaticus 0,997 2 2 

0,55 Klebsiella oxytoca 0,996 1 1 

1,09 Klebsiella oxytoca 1,000 2 1 1 

0,55 Pantoea sp. 0,997 1 1 

0,55 Providencia alcalifaciens 0,993 1 1 

1,09 Providencia stuartii 0,991 2 2 

2,19 Pseudomonas aeruginosa 1,000 4 1 3 

0,55 Pseudomonas alcaligenes 0,998 1 1 

3,83 Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 0,998 7 3 4 

16,39 Pseudomonas fluorescens 1,000 30 6 10 14 

0,55 Pseudomonas fluorescens 0,995 1 1 



1,09 Pseudomonas fluorescens 1,000 2 1 1 

6,01 Pseudomonas fragi 1,000 11 1 2 8 

1,09 Pseudomonas fragi 1,000 2 1 1 

3,83 Pseudomonas mosselii 1,000 7 2 4 1 

1,64 Pseudomonas nitroreducens 1,000 3 3 

0,55 Pseudomonas nitroreducens 1,000 1 1 

0,55 Pseudomonas pavonaceae 0,998 1 1 

1,09 Pseudomonas putida 0,975 2 2 

4,92 Pseudomonas putida 0,990 9 7 2 

6,56 Pseudomonas putida 0,993 12 2 8 2 




2,19 Pseudomonas putida 1,000 4 1 3 

1,09 Pseudomonas tolaasii 0,993 2 1 1 

1,09 Rhizobium radiobacter 1,000 2 1 1 

1,09 Rhizobium radiobacter 0,908 2 2 

4,92 Rhizobium radiobacter 1,000 9 1 8 

0,55 Salmonella enterica subsp. enterica. 0,988 1 1 

1,09 Serratia marcescens subsp. marcescens 0,991 2 1 1 

9,84 Serratia marcescens subsp. marcescens 0,998 18 8 9 1 

0,55 Stenotrophomonas maltophilia 0,968 1 1 

100,00 Kokku: 183 37 79 67 

44

Heterotrophic plate count in surface and waste water

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?