GlÃ¼koosi metabolismigeenide osalus Pseudomonas putida colR ...

Tartu Ülikool 

Loodus- ja Tehnoloogiateaduskond 

Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituut 

Geneetika õppetool 

Olga Šapran 

Glükoosi metabolismigeenide osalus Pseudomonas putida colR 

mutandi glükoos-sõltuvas lüüsumises 

Magistritöö 

Juhendaja: 

Rita Hõrak, PhD 

Tartu 2010

Sisukord 

Sisukord......................................................................................................................................2 

Kasutatud lühendid.....................................................................................................................4 

Sissejuhatus ................................................................................................................................6 

Kirjanduse ülevaade ...................................................................................................................7 

I. Glükoosi metabolism bakterites..........................................................................................7 

1. Embden-Meyerhof-Parnase rada ....................................................................................7 

2. Entner-Doudoroffi rada ..................................................................................................9 

3. Glükoosi metabolismis osalevate geenide organisatsioon ja regulatsioon P.putida-s .11 

II. Kahekomponentne signaalsüsteem ColRS ja glükoosist sõltuv bakterite lüüsumine......14 

1. Kahekomponentne signaalsüsteem ColRS..................................................................15 

2. ColRS-süsteemi defektsusest tingitud rakkude glükoos-sõltuv lüüsumine..................15 

3. OprB1 poriini mõju glükoos-sõltuvale lüüsumisele.....................................................17 

Töö eesmärk..............................................................................................................................19 

Eksperimentaalne osa ...............................................................................................................20 

I. Materjal ja metoodika........................................................................................................20 

1. Töös kasutatud bakteritüved, plasmiidid ja söötmed ...................................................20 

2. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)...............................................................................22 

3. Plasmiidse DNA eraldamine ja restriktsioonanalüüs ...................................................24 

4. Kloneerimine ................................................................................................................25 

5. Kompetentsete bakterirakkude valmistamine ja elektroporatsioon..............................26 

6. Bakteritüvede ristamine................................................................................................26 

7. Kongo punase sidumise testimine ................................................................................27 

8. β-galaktosidaasi test bakterite lüüsumise mõõtmiseks.................................................27 

9. Mutantide antibiootikumi- ja EDTA-tundlikkuse testimine.........................................28 

II. Tulemused........................................................................................................................29 

1. Glükoosi poriini kodeeriva oprB1 geeni üleekspresseerimine suurendab P. putida 

glükoos-sõltuvat lüüsumist...............................................................................................29 

2. Glükoosi metabolismis oluliste geenide katkestamine.................................................32 

3. Glükoosi metabolismigeenide katkestuste mõju glükoos-sõltuvale lüüsumisele.........33 

3.1 Kongo punase sidumine .............................................................................................33 

3.2 Bakterite lüüsumise hindamine β-galaktosidaasi aktiivsuse määramise teel .............34 

III. Arutelu............................................................................................................................38 

2

Kokkuvõte ................................................................................................................................42 

Summary...................................................................................................................................44 

Kasutatud kirjandus ..................................................................................................................46 

3

Kasutatud lühendid 

ABC transporter ATP-d siduv aktiivtransporti vahendav valk (ATP binding cassette 

transporter) 

ADP 

adenosiindifosfaat 

ATP 

adenosiintrifosfaat 

Bp 

bensüülpenitsiliin 

ED rada 

Entner-Doudoroffi rada 

eda 

2-keto-3-deoksü-6-fosfoglükonaadi aldolaas 

edd 

6-fosfoglükonaadi dehüdrataas 

EDTA 

etüleendiamiintetraatsetaat 

EMP rada Embden-Meyerhof-Parnase rada 

fbp 

fruktoos-1,6-difosfataas 

fda 

fruktoos-1,6-difosfaadi aldolaas 

gcd 

glükoosi dehüdrogenaas 

glc 

glükoos 

glk 

glükokinaas 

gn 

glükonaat 

gnuK 

glükonokinaas 

IM 

sisemembraan 

IPTG 

Isopropüül-β-tio-galaktopüranosiid 

Km 

kanamütsiin 

KP 

Kongo punane (bensidiindiaso-bis-1-naftüülamiin-4-sulfoonhape) 

LB 

Luria-Bertani sööde 

LPS 

lipopolüsahhariid 

OM 

välismembraan 

ONPG β-galaktosidaasi substraat, laktoosi struktuuriline analoog (ortonitrofenüül-β-D-galaktopüranosiid) 

PCR 

Polymerase Chain Reaction 

PFK 

fosfofruktokinaas 

PG 

peptidoglükaan 

pgi 

glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaas 

Phe 

fenool 

4

SAP 

SDS 

Sm 

wt 

zwf 

Shrimp alkaline phosphatase - kreveti aluseline fosfataas 

Sodium dodecyl sulphate - naatriumdodetsüülsulfaat 

streptomütsiin 

wild type, metsiktüüp 

glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaas 

5

Sissejuhatus 

Glükoos on üks peamisi süsiniku- ja energiaallikaid kõikides elusorganismides. Eukarüoodid 

kasutavad glükoosi metaboliseerimiseks Embden-Meyerhof-Parnase (EMP) rada. 

Prokarüoodid kasutavad aga lisaks EMP rajale Entner-Doudoroffi (ED) rada. Meie laboris 

uuritav Gram-negatiivne bakter Pseudomonas putida kasutab glükoosi metaboliseerimiseks 

ainult ED rada. 

Bakterid kasutavad kahekomponentseid signaalsüsteeme, et hankida keskkonnas toimunud 

muutuste kohta informatsiooni. Lihtsamal juhul koosneb selline süsteem transmembraansest 

sensorvalgust, mis tunnetab väliskeskkonnas toimunud muutust ja teisendab selle rakusiseseks 

signaaliks, ning vastuse regulaatorist, millele signaal edastatakse. Signaali ülekande 

tulemusena reguleeritakse märklaudgeenide transkriptsiooni või ensüümide aktiivsust (Stock 

et al., 2000). 

Meie laboris uuritakse pseudomonaadides konserveerunud kahekomponentse ColR-ColS 

signaalsüsteemi rolli ning on näidatud, et teatud tingimustel on P. putida ColRS süsteem 

bakterile eluliselt oluline. Nimelt lüüsub osa colR-defektse P. putida rakupopulatsioonist 

glükoosi tardsöötmel kasvades (Putrinš et al., 2008). Antud fenotüüp ei ilmne ühelgi teisel 

süsinikuallikal ning on iseloomulik ainult glükoosil kasvavatele rakkudele. Lisaks sellele viitavad 

ColRS signaaliraja suhtes puuduliku tüve mitmed fenotüübid, et ColRS süsteem on oluline P. 

putida-le rakumembraani stabiilsuse säilitamisel. Üks sellistest viidetest on fakt, et glükoosi 

poriini geeni oprB1 katkestamine colR-defektses tüves elimineerib bakterite glükoos-sõltuva 

lüüsumise (Putrinš et al., 2008). Seetõttu kujunes minu töö ülesandeks OprB1 poriini mõju 

uurimine colR-defektsele tüvele, mis eesmärgil suurendasin OprB1 poriini hulka bakteri 

välismembraanis. Teiseks töö eesmärgiks oli uurida, milline roll on colR mutantsete rakkude 

glükoos-sõltuvas lüüsis glükoosi metabolismiraja geenidel. 

Tänan oma juhendajat Rita Hõrakut innustava ja väga meeldiva juhendamise eest. Samuti 

soovin tänada Marta Putrinšit ja teisi laborikaaslasi abi ja nõuannete eest. 

6

Kirjanduse ülevaade 

I. Glükoosi metabolism bakterites 

Kõik bakterid ammutavad kasvukeskkonnast mitmesuguseid erinevaid energiaallikaid, mille 

lagundamisel on võimalik toota raku ülesehitamiseks vajalikku ATP-d. Üks peamisi 

energiaallikaid on glükoos, mida saadakse keskkonnast kas otse või erinevate 

polüsahhariidide või disahhariidide nagu laktoosi lagundamisel. 

Eukarüoodid kasutavad glükoosi metaboliseerimiseks Embden-Meyerhof-Parnase (EMP) 

rada, milles lagundatakse glükoos püruvaadini ning tekib ATP ja NADH. Selle glükolüüsi 

raja kirjeldasid 1940. aastal Gustav Embden, Otto Meyerhof ja Jacob Parnas (Voet, 2008). Ka 

paljud prokarüoodid kasutavad glükoosi lagundamiseks EMP rada, samas kui teised 

metaboliseerivad glükoosi läbi raja, mida tuntakse kui Entner-Doudoroffi (ED) rada (Entner 

& Doudoroff, 1952). Mõnedel prokarüootidel nagu näiteks termofiilne bakter Thermotoga 

maritima, termofiilne arhe Thermoproteus tenax (Selig et al., 1997) ja halofiilne arhe 

Halococcus saccharolyticus (Johnsen et al., 2001) ekspresseeritakse samaaegselt mõlema raja 

geenid. Escherichia coli metaboliseerib glükoosi EMP raja kaudu ning glükonaati oksüdeerib 

läbi ED rada (Eisenberg & Dobrogosz, 1967). Pseudomonaadidel toimub glükolüüs vaid läbi 

ED raja (Entner & Doudoroff, 1952; Fuhrer et al., 2005). 

1. Embden-Meyerhof-Parnase rada 

Embden-Meyerhof-Parnase (EMP) rada arvati E. coli tõttu enim kasutatavaks rajaks 

prokarüootides, kuid hilisemad uuringud viitavad, et ta võib olla isegi vähemlevinud kui ED 

rada (Fuhrer et al., 2005). Glükolüüs läbi EMP rada kujutab endast rida reaktsioone, millest 

igaühte katalüüsib kindel ensüüm (Joonis 1). Glükolüüsi reaktsioonid algavad bakteris 

glükoosi fosforüleerimisega glükoos-6-fosfaadiks. Seda ATP-d kulutavat reaktsiooni 

katalüüsib heksokinaas (Voet, 2008). 

7

Joonis 1. Glükoosi metabolism Embden-Meyerhof-Parnase raja kaudu. Joonis on tehtud käesoleva töö 

autori poolt. 

Järgnevas etapis muudetakse glükoos-6-fosfaat ensüüm glükoos-6-fosfaadi isomeraasi toimel 

fruktoos-6-fosfaadiks (Voet, 2008). Ning seejärel fosforüleeritakse fruktoos-6-fosfaadi 

fosfofruktokinaasi (PFK) toimel fruktoos-1,6-difosfaadiks. Nii glükoos-6-fosfoisomeraas kui 

ka PFK nõuavad Mg 2+ juuresolekut, kusjuures esimene katalüüsib pöördreaktsiooni teine aga 

mitte. PFK on EMP raja võtmeensüüm ning kui antud ensüüm esineb prokarüoodis, siis võib 

oletada, et see organism kataboliseerib glükoosi EMP raja kaudu (Voet, 2008). 

Järgmises etapis lagundab fruktoos-1,6-difosfaadi aldolaas fruktoos-1,6-difosfaadi kaheks 

trioos-fosfaadi molekuliks: dihüdroksüatsetoonfosfaadiks ja glütseeraldehüüd-3-fosfaadiks 

(Joonis 1), mis saavad isomeriseeruda teineteiseks trioosfosfaadi isomeraasi toimel (Voet, 

2008). Seoses sellega, et dihüdroksüatsetoonfosfaat muudetakse glütseeraldehüüd-3- 

fosfaadiks, oksüdeeritakse järgmistes reaktsioonides mõlemad glütseeraldehüüd-3-fosfaadi 

molekulid glütseeraldehüüd-3-fosfaadi dehüdrogenaasi toimel 1,3-difosfoglütseraadiks. 

Järgmises etapis toimub substraadi tasemel fosforüülimine, kus 1,3-difosfoglütseraadilt 

kantakse fosfaatrühm 3-fosfoglütseraadi kinaasi toimel ADP-le (Voet, 2008). 

8

Seejärel isomeriseeritakse 3-fosfoglütseraat fosfoglütseraadi mutaasi mõjul 2- 

fosfoglütseraadiks (Voet, 2008). Vee molekuli eemaldamise (dehüdreerimise) käigus 

moodustub 2-fosfoglütseraadist enolaasi toimel makroergilist sidet sisaldav 

fosfoenoolpüruvaat, mis püruvaadi kinaasi mõjul annab fosfaatrühma ja energia varu ADP 

molekulile ning moodustub ATP ja enoolpüruvaat. Viimane isomeriseerub püruvaadiks 

(Voet, 2008). Nii moodustub glükoosi lagunemisel püruvaadiks teine makroergiline 

fosfaatside (Voet, 2008). Seega vabaneb kokkuvõttes ühe glükoosi molekuli 

transformatsioonil püruvaadiks EMP raja kaudu energia, millest piisab nelja ATP molekuli 

moodustumiseks: kaks glütseeraldehüüd-3-fosfaadi oksüdatsioonil ja veel kaks 2- 

fosfoglütseraadi dehüdreerimisel (Voet, 2008). Kuna kaks ATP molekuli kulub glükoosi 

kataboliseerimiseks fruktoos-1,6-difosfaadiks, on summaarne ATP saagis kaks molekuli ühe 

glükoosimolekuli kohta. Kõik glükolüüsi etapid toimuvad raku tsütoplasmas. 

2. Entner-Doudoroffi rada 

Lisaks EMP rajale on prokarüootidel olemas veel teinegi laialt levinud glükolüüsi rada. 1952. 

aastal kirjeldasid Nathan Entner ja Michael Doudoroff esmakordselt Pseudomonas 

saccharophila näitel teistsugust, EMP rajast erinevat glükolüüsi rada, mida hakati nimetama 

Entner-Doudoroffi (ED) rajaks (Entner & Doudoroff, 1952). Hiljem selgus, et see on peamine 

glükoosi metabolismi rada prokarüootidel, kellel puuduvad EMP raja ensüümide geenid või 

kellel on ekspresseeritud lisaks EMP raja geenidele ka ED raja geenid. Peale 

pseudomonaadide kasutavad ED rada teisedki Gram-negatiivsed bakterid: Zymomonas, 

Shinorhizobium, Rhodobacter, Paracoccus, Agrobacterium ja Azotobacter (Fuhrer et al., 

2005). Escherichia coli ja mõned teised Gram-negatiivsed baktereid kasutavad glükoosi 

lagundamiseks EMP rada kuid glükonaati lagundavad nad ED raja kaudu (Eisenberg & 

Dobrogosz, 1967). 

Erinevalt EMP rajast, mille kõik etapid toimuvad raku tsütoplasmas, algab ED rada 

periplasmaatilises ruumis – välis- ja sisemembraani vahelises ruumis (Joonis 2). Glükoos 

siseneb periplasmasse välismembraanis asuvate OprB1 või teiste poriinide kaudu (Llamas et 

al., 2000; Saravolac et al., 1991; Trias et al., 1988). 

9

Joonis 2. Glükoosi metabolism Pseudomonas putida-l (del Castillo et al., 2007). OM – 

välismembraan, PG – peptidoglükaan, IM – sisemembraan. 

Periplasmaatilisest ruumist transporditakse glükoos kas ABC transporterite kaudu 

tsütoplasmasse (Cuskey et al., 1985; del Castillo & Ramos, 2007; Higgins et al., 1990) või 

oksüdeeritakse glükonaadiks ja edasi 2-ketoglükonaadiks (del Castillo et al., 2007). Glükoosi 

periplasmaatilises oksüdatsioonis osalevad vastavalt ensüümid glükoosi dehüdrogenaas 

(kodeerib gcd geen) ja glükonaadi dehüdrogenaas (gad) (del Castillo et al., 2007). 

Tsütoplasmasse transporditud glükoos fosforüleeritakse glükokinaasi (glk) toimel ning 

moodustuv glükoos-6-fosfaat muudetakse 6-fosfoglükonaadiks glükoos-6-fosfaadi 

10

dehüdrogenaasi (zwf) abil. Periplasmas olev glükonaat kas 1) transporditakse GntP 

transporteri kaudu tsütoplasmasse, kus ta fosforüleeritakse glükonokinaasi (gnuK) abil 6- 

fosfoglükonaadiks või 2) oksüdeeritakse periplasmas 2-ketoglükonaadiks, mis transporditakse 

KguT transporteri kaudu tsütoplasmasse, kus kguK/kguD geenide produktide toimel 

fosforüleeritakse järjekordselt 6-fosfoglükonaadiks (Joonis 2). Seega konvergeeruvad 

glükoosi metabolismi kolm perifeerset rada 6-fosfoglükonaadi tasemel, mis on ED raja 

peamine vahelüli. 6-fosfoglükonaadi dehüdrataasi (edd) toimel muudetakse 6-fosfoglükonaat 

2-keto-3-deoksü-6-fosfoglükonaadiks, mis 2-keto-3-deoksü-6-fosfoglükonaadi aldolaasi (eda) 

vahendusel laguneb glütseeraldehüüd-3-fosfaadiks ja püruvaadiks (Joonis 2). 

Ühe glükoosimolekuli lagundamisel ED raja kaudu moodustub ainult üks ATP molekul ning 

üks NADPH ja üks NADH molekul (Entner & Doudoroff, 1952). Seega on ED raja kasutegur 

võrreldes EMP rajaga väiksem. 

3. Glükoosi metabolismis osalevate geenide organisatsioon ja regulatsioon P. 

putida-s 

Pseudomonas putida on Gram-negatiivne bakter, mis isoleeriti Jaapani mullast (del Castillo et 

al., 2008). Perekonna Pseudomonas bakterid metaboliseerivad glükoosi läbi ED raja (Entner 

& Doudoroff, 1952; Wang et al., 1959; Vicente & Canovas, 1973a; Vicente & Canovas, 

1973b; Wood & Schwerdt, 1954) ning nagu eelnevalt selgus, toimub see läbi kolme 

paralleelselt töötava perifeerse raja, mis konvergeeruvad 6-fosfo-glükonaadi tasemel (del 

Castillo et al., 2007). Hiljuti näidati, et P. putida-s lagundatakse kuni 40% glükoosist 

glükokinaasi, 40-45% 2-ketoglükonaadi ja 15-20% glükonaadi raja kaudu (del Castillo & 

Ramos, 2007). 

Glükoosi metabolismigeenid on klasterdunud kolme sõltumatusse regiooni, mis on hajutatud 

mööda kromosoomi (Joonis 3) (del Castillo et al., 2007). ED raja geenide ekspressiooni 

reguleerivad kolm transkriptsioonilist repressorit: HexR, GnuR ja PtxS. Glükoosi 

transporterigeenide ekspressiooni kontrollib positiivselt toimiv transkriptsiooni regulaator 

GltR-2 (del Castillo et al., 2008). 

11

Joonis 3. Glükoosi metabolismigeenide organisatsioon P. putida tüves KT2440. (A) 16 geeni, mis 

kodeerivad glükoosi transporterit, glükokinaasi raja ensüüme ja 6-fosfo-glükonaadi lagundamisel 

olulisi Edd ja Eda ensüüme. (B) 9 geeni, millest suurem osa osaleb glükonaadi metabolismis läbi 2- 

ketoglükonaadi. (C) Glükonaadi metabolismiga seotud geenid. Numbrid geenide vahel näitavad 

vahemaad erinevate geenide stop- ja startkoodonite vahel. Negatiivne number viitab geenide 

kattuvusele (del Castillo et al., 2008). 

ED raja funktsioneerimisel hädavajalikud geenid eda ja edd asuvad erinevates operonides, 

kusjuures zwf-1, mis kodeerib glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi (Ma et al., 1998), on 

operonis koos eda geeniga ja glükokinaasi kodeeriv glk geen on samas operonis edd geeniga 

(Joonis 3A). Selline glükokinaasi raja geenide läbisegi paigutus ED raja elutähtsate geenidega 

on intrigeeriv, sest viitab, et ka glükokinaasi rajal, mis iseenesest ei ole P. putida-le kasvuks 

glükoosil hädavajalik, võib olla väga tähtis roll raku metabolismis. OprB1 poriini kodeeriv 

oprB1 geen, mis vahendab glükoosi transporti läbi välismembraani, moodustab operoni 

gtsABCD transporteri geenidega, mis osalevad glükoosi transpordil läbi sisemembraani 

(Joonis 3A). Glükonaadi transporterit (gntP) ja glükonokinaasi (gnuK) kodeerivad geenid 

järgnevad teineteisele kromosoomis, kuid ei moodusta ühtset operoni (Joonis 3C) (del Castillo 

12

et al., 2008). gnuK geenist vastupidises suunas transkribeeritav gnuR on repressor, mis kuulub 

lacI perekonda (Joonis 3C). GnuR represseerib glükonaadi transporteri avaldumist (gntP) ja 

ka glükonokinaasi (gnuK), mis vahendab glükonaadi fosforüleerumist 6-fosfoglükonaadiks 

(del Castillo et al., 2008). 

HexR repressor on transkribeeritav zwf-1 geenile vastupidises suunas (Joonis 3A) ja 

kontrollib geene, mis kodeerivad glükokinaasi (glk) ja glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi 

(zwf-1), mis osalevad 6-fosfoglükonaadi moodustumisel läbi perifeerse glükokinaasi raja (del 

Castillo et al., 2008). Samuti kontrollib HexR ED raja elutähtsaid võtmeensüüme Edd ja Eda, 

mis lagundavad 6-fosfoglükonaadi glütseeraldehüüd-3-fosfaadiks ja püruvaadiks ning gap-1 

geeni, mis kodeerib glütseeraldehüüd-3-fosfaadi dehüdrogenaasi (Daddaoua et al., 2009; del 

Castillo et al., 2008). 

PtxS repressor on samas klastris koos glükonaadi oksüdatsiooni ensüümidega (geenid gadA ja 

gadB) ning kontrollib geene, mis kodeerivad 2-ketoglükonaadi transporterit ja tema edasist 

metabolismi 6-fosfo-glükonaadini (Joonis 3B). Samuti kontrollib PtxS mikrokiip-analüüsi 

põhjal mitmeid geene, mis pole seotud glükoosi metabolismiga (del Castillo et al., 2008). 

GltR-2 on transkriptsiooniline aktivaator, mis moodustab operoni glükokinaasi (glk) ja Edd 

ensüümiga (Joonis 3A) ning kontrollib glükoosi transporti nii läbi välis- kui ka sisemembraani 

(del Castillo et al., 2008). 

Globaalsete transkriptrioonianalüüside põhjal on selgunud, et kõik eelpool mainitud 

kataboolsed geenid ja regulaatorid on indutseeritud glükoosil, välja arvatud hexR geen, mille 

induktsiooniks on vaja 2-keto-3deoksü-6-fosfoglükonaati, mis seondub HexR 

repressorvalguga, mis siis omakorda vabaneb glükoosi metabolismigeenide promootorilt. (del 

Castillo et al., 2007). 

13

II. Kahekomponentne signaalsüsteem ColRS ja glükoosist sõltuv bakterite 

lüüsumine 

Bakterid puutuvad oma elu jooksul kokku mitmesuguste erinevate kasvukeskkonna 

muutustega nagu ulatuslikud temperatuuri kõikumised, toitainete ja vee kättesaadavuse 

ebaühtlus, UV kiirgus ja toksilised ühendid. Bakterid kasutavad erinevad signaalsüsteeme, et 

tunnetada väliskeskonnas toimuvaid muutusi. 

Ühed keskkonna tunnetamise süsteemid on kahekomponentsed signaalirajad. Esimesena 

kirjeldati Escherichia coli NR süsteemi, mis reguleerib geeniekspressiooni vastavalt 

lämmastiku olemasolule keskkonnas (Ninfa & Magasanik, 1986). Tänaseks on kirjeldatud 

mitmeid signaaliradu, mis kõik reguleerivad bakterites erinevaid protsesse. 

Kahekomponentsete signaalsüsteemide arvukus varieerub bakterites vastavalt nende genoomi 

suurusele ja elukohale. Näiteks inimese sooles elaval E. coli bakteril on 30 erinevat 

kahekomponentset signaalsüsteemi (Mizuno, 1997). 

Bakteriaalne kahekomponentne signaalsüsteem koosneb kahest valgust: membraanis 

paiknevast sensorvalgust ehk histidiinkinaasist ja vastuse regulaatorvalgust, mis on enamasti 

transkriptsioonifaktor. Sensorvalgu ülesandeks on vastu võtta väliskeskkonnast saabuvat 

signaali ja kanda see tsütoplasmaatilisele vastuse regulaatorile. Selle tulemusena aktiveerub 

regulaatorvalk ning mõjutab positiivselt või negatiivselt märklaudgeenide transkriptsiooni või 

interakteerub teiste valkudega. Signaali vahendamine toimub valkude pöörduva kovalentse 

fosforüleerimise kaudu (Stock et al., 2000). 

Meie uurimisgrupp on tegelenud pikka aega kahekomponentse signaalsüsteemi ColRS 

uurimisega ning tänaseks on selge, et kui see süsteem P. putida rakkudes puudub, siis lüüsub 

osa glükoosi tardsöötmel kasvavast bakteripopulatsioonist (Putrinš et al., 2008). Samas ei 

toimu bakterite lüüsumist teistel testitud süsinikuallikatel, isegi mitte glükonaadil, mida 

sarnaselt glükoosile metaboliseeritakse ED rajas (vt. eelpool). Seega on colR mutandi 

lüüsumine selgelt glükoos-sõltuv. 

14

1. Kahekomponentne signaalsüsteem ColRS 

ColRS on tüüpiline kahekomponentne signaalsüsteem, mis koosneb sensorvalgust ColS ja 

vastuse regulaatorvalgust ColR ning on kodeeritud geenide poolt, mille ortoloogid on olemas 

kõigis perekonna Pseudomonas seni täielikult sekveneeritud liikide genoomides 

(http://www.pseudomonas.com/). Esmakordselt kirjeldati ColRS süsteem P. fluorescens-is 

kui bakterile oluline taimejuurte kolonisatsiooni määrav komponent. ColRS signaaliraja osa 

kolonisatsioonis ilmnes eelkõige konkurentsi katsetes – segakultuuris koos metsiktüüpi 

bakteritega oli colS-defektne P. fluorescens vähem efektiivne juurte koloniseerija kui algne 

tüvi (Dekkers et al., 1998). ColRS süsteemi osalemisele taimejuurte koloniseerimisel viitab ka 

fakt, et P. putida sensorvalgu ColS ekspressioon on indutseeritud maisi risosfääris (Ramos- 

Gonzalez et al., 2005). Seega on tõenäoline, et ColRS süsteemil on sarnane funktsioon 

mõlemas Pseudomonas-e perekonna mullabakteris, kuigi tema täpne roll bakteri 

kolonisatsioonivõime tagamisel ei ole selgunud. 

Inimese kopse koloniseeriva P. aeruginosa kohta on teada, et vastuse regulaatori ColR 

promootor aktiveeritakse kümnekordselt kasvamisel koos teiste kopsu asustavate bakteritega 

ehk konkurentsitingimustes (Duan et al., 2003). Seega on nii bakteris P. fluorescens kui ka P. 

aeruginosa ColRS süsteemi olulisust täheldatud just konkurentsitingimustes, mis omakorda 

vihjab ColRS signaaliraja osalusele rakkudevahelises kommunikatsioonis. Meie uurimisgrupp 

avastas, et P. putida ColRS süsteem on vajalik transposooni Tn4652 transpositsiooniks 

tingimustes, kus rakud nälgivad fenooli ainsa süsinikuallikana sisaldaval söötmel (Hõrak et al., 

2004). 

2. ColRS-süsteemi defektsusest tingitud rakkude glükoos-sõltuv lüüsumine 

Lisaks eeltoodule näidati meie laboris hiljuti, et colR-defektne P. putida PaW85 kogeb tõsist 

süsinikuallika spetsiifilist stressi, mis viib glükoosil kasvanud rakupopulatsiooni osalise 

lüüsumiseni ning fenooli lisamine söötmesse võimendab seda fenotüüpi veelgi (Putrinš et al., 

2008). Katkestatud colR geeniga P. putida üheks iseloomulikuks tunnuseks on Kongo punase 

(KP) sidumine glükoos-KP-tardsöötmel ning punaste kolooniate moodustamine (Joonis 4A) 

(Putrinš et al., 2008). Kongo punasega võivad rakud värvuda kas sekreteerides KP-d siduvat 

ühendit, näiteks tselluloosi vms (Friedman & Kolter, 2004; Solano et al., 2002) või 

15

membraani defektsusest tingitud rakusisaldise lekke tõttu (Putrinš et al., 2008). colR mutandi 

puhul värvub Kongo punasega ilmselt mingi rakukultuuri osalise lüüsumise tagajärjel 

kasvukeskkonda pääsev valguline või ka suhkruline (nt. peptidoglükaan) komponent. On 

märkimisväärne, et colR mutandi lüüsumine toimub vaid rakkude kasvamisel glükoosi 

sisaldaval tardsöötmel ja mitte ühelgi teisel süsinikuallikal. Kvantitatiivselt on rakkude lüüsi 

võimalik mõõta mingi tsütoplasmaatilise valgu järgi, mis on lüüsunud rakkudest välja 

lekkinud. Meie uurimisrühmas on rakulüüsi markerina kasutatud lihtsalt määratavat β- 

galaktosidaasi ning on näidatud, et ColR-i puudumisel on rakuvälise ensüümi aktiivsus 

tunduvalt kõrgem kui P. putida PaW85 algtüves (Joonis 4B) (Putrinš et al., 2008). 

Joonis 4. colR mutandi glükoos-sõltuvad fenotüübid: (A) Kongo punase (KP) sidumine ja rakkude 

punaseks värvumine, P. putida algtüvi KP-d ei seo. Tasse pildistati 5. päeval. (B) Permeabiliseerimata 

rakkudest määratud suhteline β-galaktosidaasi aktiivus. Bakterid kasvasid 24 tundi glükoosi (glc) või 

glükonaati (gn) sisaldavatel tardsöötmetel. Joonised on tehtud käesoleva töö autori poolt. 

Lisaks eespool kirjeldatud fenotüüpidele erineb colR mutant algsest P. putida tüvest veel 

koloonia morfoloogia poolest. Nimelt on colR-defektse tüve glükoosi tardsöötmel kasvavad 

kolooniad keskelt lohuga ja see fenotüüp korreleerub colR-defektsete bakterite lüüsumisega 

(Joonis 4). P. putida algtüve kolooniad on glükoosil kasvades pehme konsistentsiga ja 

kumerad, kuid ColR-i puudumine põhjustab kleepuvate ja keskelt lohuga kolooniate tekke 

(Putrinš et al., 2008). Kuna seda fenotüüpi teistel testitud süsinikuallikatel ei esine, võib 

järeldada, et lohk koloonia keskmes on tingitud just glükoosist ja ilmselt peegeldab see 

rakkude lüüsumist (Joonis 5). 

16

Joonis 5. Lohuga koloonia colRdefektsel 

tüvel. Katse viidi läbi 

glükoosi tassidel (glc), kuhu ühel 

juhul lisati 1mM fenooli (glc 1mM 

Phe). Enne pildistamist kasvasid 

kolooniad 2 päeva (Putrinš et al., 

2008). 

Bakteripopulatsiooni analüüs üksiku raku tasemel läbivoolutsütomeetriga ehk FACSiga 

näitas, et colR-defektse tüve rakupopulatsioon on pärast 24-tunnist kasvamist glükoosisöötmel 

võrreldes algtüvega oluliselt heterogeensem, sisaldades palju rohkem surnud ning 

kahjustunud membraaniga rakke (Putrinš et al., 2008; Putrinš et al., 2010). Kõik need 

fenotüübid näitavad ühiselt, et ColR-i puudumine põhjustab P. putida glükoosil kasvavatele 

rakkudele suurt stressi, mis viib populatsiooni osalise lüüsumiseni, seega on ColRS süsteem 

P. putida-le oluline normaalseks kasvuks glükoosil. 

3. OprB1 poriini mõju glükoos-sõltuvale lüüsumisele 

Bakteriaalsed poriinid on kas spetsiifilised substraat-selektiivsed või mittespetsiifilised 

transmembraanset kanalit moodustavad valgud, mis asuvad bakteri välismembraanis. Neil on 

nii struktuurne kui ka funktsionaalne roll. Nad vastutavad erinevate molekulide transpordi 

eest läbi välismembraani, säilitavad membraani kuju ja stabiilsuse (Adewoye & Worobec, 

1999). OprB1 poriin, mis asub P. putida välismembraanis on glükoosi-spetsiifiline poriin 

(Hancock, 1980), kuid lisaks sellele läbivad selle poriini kaudu välismembraani ka mitmed 

teised süsivesikud (Wylie & Worobec, 1995). 

Glükoosi poriini OprB1 kodeeriva geeni (oprB1) inaktivatsioon elimineerib colR-defektsele 

tüvele omase rakkude lüüsumise (Putrinš et al., 2008). Nimelt on colRoprB1 topeltmutandi 

glükoos-KP-tardsöötmel kasvavad kolooniad valged, seega võrreldavad P. putida algtüvega 

(Joonis 4A). Samuti on bakterite lüüsumise markerina kasutatava rakuvälise β-galaktosidaasi 

aktiivsus colRoprB1 topeltmutandis sarnane algse P. putida tüvega (Joonis 4B). P. putida 

oprB1-defektne tüvi ei erine mingil moel algtüvest, mis viitab, et P. putida ColRS süsteem on 

seotud membraani funktsioonidega. Kui vähendada OprB1 poriini osakaalu colR mutantses 

17

tüves, siis colR defektsusest tingitud membraani stress väheneb. Nendest tulemustest lähtudes 

võib oletada, et OprB1 poriini kuhjumine membraani destabiliseerib seda ning mõjub 

rakkudele toksiliselt (Putrinš et al., 2008). Teise võimalusena võib OprB1 poriin olla seotud 

glükoosi metabolismiga ning rakkude lüüs võib olla tingitud mõnest glükoosi metaboliidist 

(Putrinš et al., 2008). Glükoosi transpordi katsed näitasid, et võrreldes P. putida-ga on oprB1- 

defektses tüves glükoosi transport rakku vähenenud, kuid seda ainult juhul, kui analüüsida 

transporti madalatel (5 µM) glükoosi kontsentratsioonidel. Ei saa välistada võimalust, et 

bakterite kasvamisel glükoosi tardsöötmel väheneb glükoosi kontsentratsioon kõrgema 

rakutihedusega kasvupiirkondades tasemeni, mille juures glükoosi poriini OprB1 olemasolu 

või puudumine võib mõjutada glükoosi transporti ja metabolismi (Putrinš et al., 2008). 

18

Töö eesmärk 

Meie uurimisgrupis uuritakse P. putida kahekomponentset signaalsüsteemi ColRS ning selle 

süsteemi erinevaid võimalikke funktsioone. colR-defektne P. putida lüüsub glükoosil 

kasvades ja on tähelepanuväärne, et seda ei juhtu ühelgi teisel süsinikuallikal. Seni on leitud, 

et glükoosi poriini kodeeriva oprB1 katkestamine P. putida colR-defektses tüves elimineerib 

glükoosist tingitud lüüsi (Putrinš et al., 2008). Kuna colR-defektse tüve erinevad fenotüübid 

viitavad, et bakteril on tugev membraanistress, siis võib arvata, et glükoosil toimuv OprB1 

kuhjumine colR-defektse P. putida välismembraani võib suurendada membraani 

ebastabiilsust veelgi. Välistada ei saa ka võimalust, et OprB1 poriini ekspressioon mõjutab 

glükoosi metabolismi ning colR mutantsete rakude lüüs on tingitud mõnest glükoosi 

metabolismiraja metaboliidist (Putrinš et al., 2008). Sellest lähtuvalt sai minu töö eesmärgiks 

1) selgitada kuidas mõjutab OprB1 üleekspressioon colR-defektse tüve lüüsumist ja 

kas selle valgu kuhjumine membraani võib põhjustada ka glükonaadil kasvavate bakterite 

lüüsumist 

2) selgitada glükoosi metabolismigeenide osalust colR mutandi glükoos-sõltuvas 

lüüsumises. 

19

Eksperimentaalne osa 

I. Materjal ja metoodika 

1. Töös kasutatud bakteritüved, plasmiidid ja söötmed 

Töös kasutatud bakteritüved ja plasmiidid on toodud Tabelis 1. Söötmena kasutati Luria- 

Bertani (LB) söödet (1% trüptoon, 0,5% pärmiekstrakt, 0,5% NaCl) (Miller, 1972) või M9 

minimaalsöödet (42 mM KH PO , 24 mM Na HPO , 19 mM NH Cl, 9 mM NaCl) (Adams, 

2 4 2 4 4 

1959), millele lisati mikroelementide lahust (667,5 µM MgO, 50 µM CaCO , 40 µM FeSO , 

3 4 

12,5 µM ZnSO , 12,5 µM MnSO , 2,5 µM CuSO , 2,5 µM CoSO , 1,9 µM H BO ) (Bauchop 

4 4 4 4 3 4 

& Elsden, 1960) ning süsinikuallikana naatriumbensoaati, glükoosi või glükonaati (kõiki 10 

mM). 

Bakteritüve või plasmiidi selektsiooniks kasutati antibiootikume: ampitsilliin (Amp, 100 

µg/ml), kanamütsiin (Km, 50 µg/ml), streptomütsiin (Sm, E. coli jaoks 20 µg/ml ja P. putida 

jaoks 300 µg/ml), bensüülpenitsilliin (Bp, 1500 või 3000 µg/ml) ja gentamütsiini (10 µg/ml). 

Escherichia coli rakke kasvatati 37°C juures ja Pseudomonas putida rakke 30°C juures. 

Vedelsöötmes kasvatamisel aereeriti kultuure loksutil. 

E. coli tüve DH5α kasutati kloneerimisel, tüve C118λpir kasutati minitransposooni sisaldava 

plasmiidi doonortüvena ja tüve HB101[pRK2013] kasutati bakterite ristamisel 

minitransposooni sisaldava plasmiidi ülekandmiseks P. putida rakkudesse. 

Tabel 1. Töös kasutatud bakteritüved ja plasmiidid 

Bakteritüved Iseloomustus Viide 

Escherichia coli 

CC118λpir 

∆(ara-leu) araD ∆lacX74 galK phoA20 thi-1 rspE rpo B 

argE (Am) 

(Herrero et al., 

1990) 

DH5α supE44 ∆lacU169 (ϕ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 (Miller, 1992) 

20

gyr A96 thi-1 relA1 

HB101 

subE44 subF58 hsdS3 (rB¯ mB¯ ) recA13 pro∆2 lacY1 

galK2 rps20 xyl-5 mt1-1 

(Boyer & 

Roulland- 

Dussoix, 1969) 

Pseudomonas putida 

PaW85 algne tüvi (Bayley et al., 

1977) 

colR PaW85 colR::Km r (Hõrak et al., 

2004) 

colRoprB1 PaW85 colR::Km r oprB1::Sm r (Kivistik et al., 

2006) 

colR1015 PaW85 colR::Km r PP1015::Tn5Sm r Marta Putrinš 




PaW85tacoprB1 PaW85, mille kromosoomi on viidud P tac promootori Käesolev töö 

kontrolli all olev oprB1 geen (Gm r ) 

colRtacoprB1 colR, mille kromosoomi on viidud P tac promootori Käesolev töö 

kontrolli all olev oprB1 geen (Km r Gm r ) 

colR1015tacoprB1 colR1015, mille kromosoomi on viidud P tac promootori Käesolev töö 

kontrolli all olev oprB1 geen (Km r Sm r Gm r ) 


kontrolli all olev oprB1 geen ( Km r Sm r Gm r ) 





Gcd PaW85 gcd::Sm r Käesolev töö 

Glk PaW85 glk::Sm r Rita Hõrak 

colRgcd PaW85 colR::Km r gcd::Sm r Käesolev töö 

colRglk PaW85 colR::Km r glk::Sm r Rita Hõrak 

Plasmiid 

pBK-miniTn7-ΩGm Gentamütsiiniresistentsust kodeerivat 

(Koch et al., 

minitransposooni sisaldav plasmiid (Amp r Gm r ) 

2001) 

pKTlacZS/C 

Plasmiid, milles lacZ geen on transposoon Tn4652 (Hõrak & 

21

transposaasi promootori kontrolli all (Amp r ) Kivisaar, 1998) 

pBluescript KS E. coli kloneerimisvektor (Amp r ) Stratagene 

pGP704L 

Ülekandeplasmiid homoloogiliseks rekombinatsiooniks 

(Amp r ) 

pKS/Sm pBluescript KS, mis sisaldab Sm resistentsusgeeni (Amp r , 

Sm r ) 

pKS/gcd pBluescript KS, mis sisaldab PCR-ga amplifitseeritud P. 

putida gcd geeni (Amp r ) 

pKS/oprB1 pBluescript KS, mis sisaldab PCR-ga amplifitseeritud P. 

putida oprB1 geeni (Amp r ) 

pKS/gcd::Sm gcd geeni keskmine osa on asendatud Sm 

resistentsusgeeniga plasmiidis pKS/gcd (Amp r , Sm r ) 

pKS/oprB1::Km oprB1 geeni keskmine osa on asendatud Km 

(Pavel et al., 

1994) 

Mariliis Tark 

Käesolev töö 

(Kivistik et al., 

2006) 



pPGP704L/gcd::Sm 

pUCNotKm/lacItacopr 

B1 

resistentsusgeeniga plasmiidis pKS/oprB1 (Amp r , Km r ) 

pGP704L, mis sisaldab gcd::Sm r fragmenti plasmiidist 

pKS/gcd::Sm (Amp r , Sm r ) 

pUCNotKm, millesse on viidud lacI geeni, tac 

promootorit ja oprB1 geeni sisaldav fragment plasmiidist 


Rita Hõrak 

pBRlacItac/oprB1 (Km r ) 

pUTmini-Tn5Km Kanamütsiiniresistentsust kodeerivat minitransposooni 

sisaldav plasmiid (Amp r Km r ) 

pBKminiTn7Gm/tacoprB1 

pBK-miniTn7-ΩGm, mis sisaldab minitransposooni 

koosseisus lacItacoprB1 ekspressioonikassetti (Amp r Gm r 

) 

(de Lorenzo et 

al., 1990) 


2. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) 

PCR-s (ingl. k. Polymerase Chain Reaction) kasutati matriitsina puhastatud plasmiidset või 

kromosomaalset DNA-d või ka bakterirakke. PCR toimus mahus 20 µl. Reaktsioonisegu 

sisaldas: 75 mM Tris-HCl (pH 8,8); 20 mM (NH 4 

) 2 

SO 4 

; 0,01% Tween 20; 2,5 mM MgCl; 0,2 

22

mM dNTP; 0,5 ühikut Taq DNA-polümeraasi ja 10 pmol praimereid. Praimeritena kasutatud 

oligonukleotiidid on toodud Tabelis 2. 

PCR-l toimusid 25 tsüklit enamasti järgmistes tingimustes: 1) DNA denaturatsioon – 1 minut 

96°C juures; 2) praimeri kinnitumine matriitsile – 1 minut 54°C juures; 3) DNA süntees – 1- 

1,5 minutit (sõltuvalt amplifitseeritava DNA-fragmendi pikkusest) 72°C juures. 

Tabel 2. Töös kasutatud oligonukleotiidid. 

Oligon. nimi Oligonukleotiidi järjestus* Kasutamine 

SmSplõpp 

Forward (FW) 

Reverse (Rev) 

gcdCla 

gcdlookus 

gcdXba 

OEvastu 

LuxBlõpp 

oprB1-ylem 

oprB1-all 

oprB1-ees 

5’-GCTGATCCGGTGGATGACCT-3’ 

(Komplementaarne streptomütsiini 

resistentsusgeeni piirava omega elemendi järjestusega 

plasmiidis pUTmini-Tn5Sm/Sp) 

5’-AACAGCTATGACCATG-3’ 

(plasmiidi pBluescript universaalpraimer) 

5’-TGACCGGCAGCAAAATG-3’ 

(plasmiidi pBluescript universaalpraimer) 

5’-CAGATCGATGGCGCCCTGATC-3’ 

(positsioonid -60…-81 gcd geeni startkoodonist 

ülesvoolu) 

5’-GCTGTATTACGGCATTCACT-3’ 

(positsioonid -142…-162 gcd geeni startkoodonist 

ülesvoolu) 

5’-CAGCATTCTAGATCGTTGGG-3’ 

(positsioonid 68…88 gcd geeni stoppkoodonist allavoolu) 

5`-GGAAAGCCTGGTCGGCTGG-3` 

(plasmiidi pGP704L spetsiifiline praimer) 

5`-CGCCAACATCGTCAAATACC-3` 

(plasmiidi pGP704L spetriifiline praimer) 

5’-GAATTCGCAAAGGGATGGAACAG-3’ 

(positsioonid -9…9 oprB1 geeni startkoodonist) 

5’-GAATTCAGAATGACGACTGAATCT-3’ 

(positsioonid 1324…1344 oprB1 geeni startkoodonist 

allavoolu) 

5’-GGCAAGCTTCAAAGGCCGTTGACTCG-3’ 

(positsioonid -37…-63 oprB1 geeni startkoodonist 

ülesvoolu) 

Sm r geeni kloneerimine 

pBluescript-i konstruktide 

kontrollimine 

pBluescript-i konstruktide 

kontrollimine 

mutantsete tüvede 

kontrollimine 

gcd geeni kloneerimine ja 


kontrollimine 

gcd geeni kloneerimine ja 


kontrollimine 

ülekandeplasmiidi 

pGP704L kontrollimiseks 

ülekandeplasmiidi 

pGP704L kontrollimiseks 


kontrollimine 


kontrollimine 

oprB1 geeni kloneerimine 

ja mutantsete tüvede 

kontrollimine 

23

oprB1-lõpp 5’-TGGTCTAGAGCTCTTGTTGTTTGAGAT-3’ 

(positsioonid 93…120 oprB1 geeni stoppkoodonist 

allavoolu) 

oprB1-kesk 5’-GGTTCTGGAAGTCGCAAGGG-3’ 

(positsioonid 515…536 oprB1 geeni startkoodonist 

allavoolu) 

Km0 

5’-GTGCAATGTAACATCAGAGATTTT-3’ 

(positsioonid -68…-92 Km r geeni startkoodonist 

ülesvoolu plasmiidis pUTmini-Tn5Km) 

Km4 

5’-AATTGGTTGTAACACTGGCAGA-3’ 

(positsioonid 12-34 Km r geeni stoppkoodonist allavoolu) 

colRalg 

5’-GCTAAGCTGCCGCGCACCACAGCGAG-3’ 

(positsioonid -22…-48 colR geeni startkoodonist 

ülesvoolu) 

KmSac 

5’-CAGGAGCTCGTTCGATTTATTCAACAAAGCC- 

3’ 

(positsinoonid -109…-140 Km geeni stratkoodonist 

ülesvoolu) 

prtac 

5’-AATTAATCATCGGCTCGTATAA-3’ 

(komplementaarne P tac promootoriga) 

* Oligonukleotiidis leiduvad restriktsioonisaidid on alla joonitud. 

oprB1 geeni kloneerimine 

ja mutantsete tüvede 

kontrollimine 


kontrollimine 


kontrollimine 


kontrollimine 

colR-mutantse tüve 

kontrollimine 

Km r geeni kloneerimine ja 


kontrollimine 

lacI-tac-oprB1 

üleekspressioonikasseti 

kontrollimine 

3. Plasmiidse DNA eraldamine ja restriktsioonanalüüs 

Plasmiidse DNA eraldamiseks tsentrifuugiti (Eppendorf 5415 C, 30 sekundit, 

maksimumpööretel) üleöö 4 ml-s LB-vedelsöötmes kasvanud rakud söötmest välja (kõrge 

koopiaarvuga plasmiidide puhul tsentrifuugiti kokku 3 ml üleöö kasvanud kultuuri) ning 

eraldati plasmiidne DNA, kasutades Axyprep Plasmid Miniprep Kit-i (Axygen Biosciences). 

Saadud DNA lahustati 50-80 µl-s destilleeritud vees ning säilitati -20 0 C juures edasiseks 

kasutamiseks. 

Plasmiidi puhastamise edukust hinnati geelelektroforeesil. DNA-le lisati 0,04% 

broomfenoolsinise lahust 50%-ses glütseroolis, 10 µl proovi kohta 1 µl. Proov kanti 

etiidiumbromiidi sisaldavale 1%-sele agaroosgeelile TAE-puhvris (50 mM Tris-atsetaat; 1 

24

mM EDTA; pH 8,2). Elektroforees toimus toatemperatuuril pingel 120-140 V. Geeli pildistati 

ultraviolettvalguses. 

Plasmiidse DNA restriktsiooniks kasutati firma Fermentas ensüüme. Reaktsioonid viidi läbi 

tingimustel, mis olid ette nähtud Fermentase kataloogis. Analüüsimiseks kasutati 

geelelektroforeesi. 

4. Kloneerimine 

Glükoosi dehüdrogenaasi kodeeriva gcd geeni katkestamiseks P. putida PaW85 algtüves ja 

colR mutandis amplifitseeriti esmalt gcd geen PCR-ga, kasutades oligonukleotiide gcdlookus 

ja gcdXba. Saadud DNA-d lõigati restriktaasidega XbaI ja PstI ning ligeeriti samade 

restriktaasidega avatud plasmiidi pBluescript KS. Kuna vektori DNA puhastamiseks ei 

kasutatud geelelektroforeesi, siis töödeldi avatud vektorit aluselise fosfataasiga SAP (ingl. k. 

shrimp alkaline phosphatase, Fermentas), et vältida hiljem vektori kokkuligeerumist. gcd 

katkestamiseks pKS/gcd plasmiidis asendati 500 aluspaari pikkune Mva1269I-Bpu1102I 

fragment gcd geenist Sm r geeniga, mis saadi plasmiidi pKS/Sm lõikamisel restriktaasiga VspI. 

Konstrueeritud gcd::Sm r järjestus lõigati plasmiidist pKS/gcd::Sm restriktaasidega Acc65I ja 

SacI ning kloneeriti samade restriktaasidega avatud plasmiidi pGP704L. Saadud plasmiidi 

pGP704L/gcd::Sm kasutati ristamises gcd geeni katkestamiseks homoloogilise 

rekombinatsiooni abil. 

oprB1 geeni üleekspressioonitüve konstrueerimiseks viidi lacI-tac-oprB1 kassett NotI 

fragmendina (lõigati vektorist pUCNotKm/lacItacoprB1) minitransposooni koosseisu 

plasmiidis pBK-miniTn7-ΩGm. Saadud plasmiid pBK-miniTn7Gm/tacoprB1 elektroporeeriti 

P. putida PaW85, colR, colR1015, colR1016, colR1018 ja colR1019 mutantide rakkudesse ja 

lacI-tac-oprB1 ekspressioonikasseti sisaldavaid transkonjugante selekteeriti 

gentamütsiini resistentsuse järgi. 

25

5. Kompetentsete bakterirakkude valmistamine ja elektroporatsioon 

Üleöö LB-vedelsöötmes kasvanud Escherichia coli retsipienttüve rakukultuure lahjendati 20- 

kordselt 4 ml-sse YENB söötmesse (0,75% „Bacto yeast extract“; 0,8% „Bacto nutrient 

broth“) ning kasvatati tiheduseni 0,5-0,7 (λ 580 nm). Seejärel tsentrifuugiti rakud söötmest 

välja („Eppendorf” 5415 C, 12045 g, 1 minut), pesti kaks korda 1 ml destilleeritud veega ja 

ühe korra 200 µl 10%-se glütserooliga. Seejärel suspendeeriti rakud 80 µl-s 10% glütseroolis 

ning jaotati 40 µl kaupa Eppendorfi tuubidesse. 

Pseudomonas putida puhul tsentrifuugiti retsipientrakud 250 µl-st üleöö LB-s kasvanud 

kultuurist kokku, pesti kolm korda 300 mM sahharoosiga ning suspendeeriti 40 µl-s 300 mM 

sahharoosis. 40 µl-le kompetentsetele rakkudele lisati ~0,5 µg DNA-d ja hoiti 1 minut jääl. 

Seejärel pipeteeriti rakud eelnevalt jääl jahutatud elektroporatsiooni küvetti. 

Elektroporatsioon toimus BioRad-i elektroporaatoriga pingel 2500 V. Rakud pesti küvetist 

välja 1 ml LB-söötmega ja pandi Eppendorfi tuubiga tunniks ajaks termostaati kasvama. 

Seejärel tsentrifuugiti rakud söötmest välja ja hõõruti selektiivtassile. 

6. Bakteritüvede ristamine 

Ristamiseks kasvatati üleöö 4 ml-s LB-vedelsöötmes vastava antibiootikumi juuresolekul 1) 

doonorina E. coli tüve CC118λpir, kuhu oli viidud soovitud ülekantavat kassetti sisaldav 

plasmiid, 2) retsipienttüvena P. putida tüvesid PaW85, colR, colR1015, colR1016, colR1018, 

colR1019 või gcd, 3) helpertüvena E. coli HB101 [pRK2013]. 

Üleöö kasvanud bakterikultuuridest tehti 20-kordsed lahjendused 4 ml-sse LB-sse ja kasvatati 

ilma antibiootikumita. Ristamissegude jaoks võeti ajapunktidel 1,5; 2,5 ja 3,5 tundi igast 

värskest kultuurist 100 µl, segati kokku ning pipeteeriti sellest 100 µl LB-tassile. Baktereid 

kasvatati üleöö 30°C termostaadis. Seejärel kraabiti ühest valitud ajapunktist 1/3 rakkudest 

tassilt, suspendeeriti 100 µl-s 1 x M9-s ja plaaditi bensoaati sisaldavale 

minimaaltardsöötmele, kuhu oli lisatud selektsiooniks vajalik antibiootikum. 

26

7. Kongo punase sidumise testimine 

Katseks kasvatati P. putida algne tüvi PaW85 ja katkestustüved üleöö 4 ml-s LB-söötmes 

30 o C loksutil. Üleöö kasvanud bakterikultuurid lahjendati 1 x M9 puhvris 10 korda ning 

külvati 5 µl-ste tilkadena (~5x10 5 rakku) minimaaltardsöötmele, mis sisaldas glükoosi (10 

mM) ja Kongo punast (0,0005%). Paralleelkülvid tehti ka söötmele, mis sisaldas lisaks 

eelnevale ka fenooli (1 mM), sest punaste kolooniate teke avaldub selgemalt ja kiiremini fenooli 

juuresolekul. Kuna colR mutandi KP-ga värvumine on glükoos-sõltuv, siis kasutasin 

negatiivse kontrollina tasse, kus süsinikuallikaks oli glükonaat. Rakke inkubeeriti 30°C 

termostaadis 3-5 päeva ja hinnati nende punaseks värvumise intensiivsust. 

8. β-galaktosidaasi test bakterite lüüsumise mõõtmiseks 

β-galaktosidaasi aktiivsused määrati P. putida rakkudest, mis sisaldasid plasmiidi 

pKTlacZS/C, milles lacZ geen ekspresseerub transposoon Tn4652 transposaasi geeni tnpA 

promootorilt (Hõrak & Kivisaar, 1998). 

Bakterite lüüsumise hindamiseks külvati uuritavad kaheksa tüve (P. putida PaW85 algtüvi, 

colR, glk, colRglk, gcd, colRgcd, oprB1, colRoprB1) nii glükoos-bensüülpenitsiliin kui ka 

glükonaat-bensüülpenitsiliin tassidele sektoritesse ja kasvatati 24 tundi 30°C termostaadis. 

Transporteri suhtes mutantseid tüvesid (colR1015, colR1016, colR1018, colR1019) ja oprB1 

üleekspressioonimutante (PaW85tacoprB1, colRtacoprB1, colR1016tacoprB1, 

colR1018tacoprB1, colR1019tacoprB1) kasvatati glükoos-bensüülpenitsiliin ja glükoosbensüülpenitsiliin-IPTG 

(0,5 mM) tassidel. Seejärel kraabiti bakterid kokku ja suspendeeriti 

350 µl-s 1 x M9 puhvris. Rakususpensiooni tihedus mõõdeti spektrofotomeetriliselt 

lainepikkusel 580 nm. 

β-galaktosidaasi aktiivsus mõõdeti igas tüves paralleelselt nii permeabiliseeritud (arvutustes 

võeti see näit 100%-liseks aktiivsuseks) kui permeabiliseerimata rakkudest. β-galaktosidaasi 

koguaktiivsus mõõdeti järgmises reaktsioonisegus: 1,6 ml Z-puhvrit (60 mM Na HPO , 40 

2 4 

mM NaH PO , 10 mM MgSO , 50 mM β-merkaptoetanool, 0,0005% SDS, pH 7), 0,4 ml 

2 4 4 

27

ONGP-lahust (orto-nitrofenüül-β-D-galaktopüranosiid, 4 mg/ml) ja 0,1 ml kloroformi. 

Permeabiliseerimata rakkudest ensüümi mõõtmiseks kasutati ilma SDS-ta Z-puhvrit ning jäeti 

lisamata ka kloroform. Reaktsioonisegule lisati 50-75 µl rakususpensiooni ja fikseeriti aeg 

rakkude lisamisest kuni reaktsiooni peatamiseni, mis toimus 1 ml 1 M Na CO lisamisega. β- 

2 3 

galaktosidaasi aktiivsus määrati spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 420 nm valgust neelava 

produkti o-nitrofenooli tekkimisega ajaühikus rakkude hulga kohta (Miller, 1992). Lüüsumise 

hindamiseks arvutati permeabiliseerimata rakkudest mõõdetud β-galaktosidaasi aktiivsuse 

protsent totaalsest ehk permeabliseeritud rakkudest mõõdetud ensüümi aktiivsusest. 

9. Mutantide antibiootikumi- ja EDTA-tundlikkuse testimine 

Uuritavad tüved kasvatati üleöö 4 ml-s LB-söötmes. Antibiootikumi ja EDTA taluvuse 

katseks tehti kultuuridest 10 4 -, 10 5 - ja 10 6 -kordsed lahjendused 1 x M9 puhvris ning 

pipeteeriti neist 5 µl glükoosi tassile, mis sisaldas 0 mM; 0,6 mM või 1,2 mM 

kontsentratsiooniga EDTA-d või 0 µl/ml; 150 µl/ml ja 350 µl/ml bensüülpenitsiliini. Rakke 

inkubeeriti 30°C termostaadis 4-6 päeva ja hinnati nende suutlikkust erinevatel 

bensüülpenitsiliini ja EDTA kontsentratsioonidel kasvada. 

28

II. Tulemused 

1. Glükoosi poriini kodeeriva oprB1 geeni üleekspresseerimine suurendab P. 

putida glükoos-sõltuvat lüüsumist 

On teada, et ColRS süsteem on P. putida-le vajalik normaalseks kasvuks glükoosil kui ainsal 

süsinikuallikal ja colR geeni katkestamine põhjustab bakteripopulatsiooni osalise lüüsumise 

(Putrinš et al., 2008). Tsitraadil ja glükonaadil kasvades ei avaldu colR-defektsele tüvele 

omane lüüsumine. 

Meie uurimisgrupi varasemad tulemused on näidanud, et glükoosi poriini kodeeriva oprB1- 

geeni katkestamine leevendab glükoosil kasvavatele colR-mutantsetele bakteritele omast 

lüüsumist (Putrinš et al., 2008). Lisaks OprB1 poriinile, mille kaudu toimub glükoosi 

transport läbi välismembraani, on rakul olemas ABC transporteri valgud (Joonis 6A), mis 

transpordivad periplasmasse jõudnud glükoosi tsütoplasmasse (del Castillo et al., 2007). 

Transporterimutandid saadi colR mutandi transposoonmutageneesiga, kui otsiti 

mittelüüsuvaid, KP-ga mittevärvuvaid colR-defektse tüve derivaate (Püvi, 2010). Meie grupi 

varasemad katsed on näidanud, et colR mutandi KP sidumine korreleerub bakterite 

lüüsumisega (Putrinš et al., 2008; Putrinš et al., 2010), Samas on visuaalselt punase värvuse 

intensiivsuse hindamine suhteline ja selle kvantiteerimine keerukas. Selleks, et 

transporterimutantide lüüsumist kvantitatiivselt hinnata, tegin β-galaktosidaasi testi, mida olen 

kirjeldanud Materjali ja metoodika osas. Lüüsunud ja läbilaskva membraaniga rakkudest 

pääseb tsütoplasmaatiline ensüüm β-galaktosidaas väliskeskkonda ja/või ensüümi substraat 

ONPG rakku ning seetõttu on β-galaktosidaasi aktiivsus mõõdetav ka permeabiliseerimata 

rakukultuurist (Putrinš et al., 2008). Terve membraaniga rakkudel on selliselt määratud nn. 

varjestamata β-galaktosidaasi aktiivsus väga väike, umbes 2-4% ensüümi koguaktiivsusest 

(Putrinš et al., 2008). 

29

colR 

B 

%b-galaktosidaasi aktiivsusest 

20 

15 

10 

5 

0 

wt 

colR1015 




Joonis 6. (A) Glükoosi poriini kodeeriva geeni (PP1019) ja ABC transporterigeenide (PP1015- 

PP1018) organisatsioon P. putida genoomis (del Castillo et al., 2008). (B) P. putida colR-mutantse 

tüve ja erinevate ABC transporterigeenide ja oprB1 suhtes mutantsete tüvede lüüsumine, mille 

näitajaks on permeabiliseerimata rakkudest määratud suhteline β-galaktosidaasi aktiivus. Esitatud on 

kolme mõõtmise keskmised ja standardhälbed. Rakud on kasvanud 24 tundi glükoos-tardsöötmel . 

Varjestamata β-galaktosidaasi aktiivuse mõõtmine colR ja transporteri topeltmutantides 

näitas, et sarnaselt oprB1 katkestamisele, likvideerisid ka glükoosi transporterit kodeerivate 

geenide katkestused colR-defektse tüve lüüsumise täielikult (Joonis 6B). Kuna aga 

transporteri geenid on oprB1-ga samas operonis (del Castillo et al., 2007), siis ei saa 

välistada, et transporterit kodeerivate geenide katkestuse efekt on tingitud lihtsalt OprB1 

taseme vähenemisest, kuna oprB1 geen on operonis viimane (Joonis 6A). Seepärast 

otsustasime uurida, kas OprB1 üleekspressioon taastab transporterimutantide lüüsumise või 

mitte. Lisaks sellele tahtsime selgitada, kas OprB1 poriini hulga kunstlik suurendamine võiks 

30

põhjustada bakterite lüüsi ka teistel süsinikuallikatel. Selleks konstrueerisin wttacoprB1, 

colRtacoprB1, colR1015tacoprB1, colR1016tacoprB1, colR1018tacoprB1 ja 

colR1019tacoprB1 mutandid ja testisin neid KP sidumise katses. 

Kui üleekspresseerida oprB1 geeni colR ja transporteri geenide topeltmutantides, siis 

suureneb glükoosil kasvavate bakterite värvumine KP-ga (Joonis 7, punane kast). See tulemus 

viitab, et transporterimutantide colR tüve lüüsumist vähendav mõju tuleneb ilmselt oprB1 

hulga vähenemisest neis tüvedes. Samuti põhjustab OprB1 hulga kunstlik suurendamine 

glükoosil kasvava PaW85 algtüve KP-ga värvumist. Huvitav on see, et OprB1 

üleekspressioon põhjustab colR mutandi ja tema transportermutantide värvumist KP-ga ka 

glükonaadil (Joonis 7, kollane kast). 

Joonis 7. P. putida algse tüve (wt), colR-mutantse tüve (colR), erinevate ABC transporterigeenide 

(PP1015, PP1016 ja PP1018) ja oprB1 (PP1019) suhtes mutantsete tüvede lüüsumine, mille näitajaks 

on bakteripopulatsiooni värvumine Kongo punasega (KP). Bakterid kasvasid glükoosi (glc) ja 

glükonaadi (gn) tassidel, millele oli lisatud KP ja 0,5 mM IPTG. Tasse on pildistatud katse viiendal 

päeval. 

Seega näitavad need tulemused, et colR mutant ei talu liigset OprB1 kogunemist membraani 

ei glükoosil ega glükonaadil kasvades. Siiski on OprB1 kogunemisest põhjustatud 

membraanistress glükoosil kasvavatel bakteritel oluliselt suurem kui glükonaadil kasvavatel 

bakteritel. 

31

2. Glükoosi metabolismis oluliste geenide katkestamine 

Nagu kirjanduse ülevaatest selgus metaboliseerib P. putida glükoosi läbi kolme paralleelselt 

töötava raja, mis konvergeeruvad 6-fosfoglükonaadi tasemel (del Castillo et al., 2007). 

Periplasmaatilisse ruumi sisenenud glükoosi võidakse kas 1) transportida tsütoplasmasse ning 

lagundada glükokinaasi raja kaudu, 2) oksüdeerida periplasmas glükonaadiks ning lagundada 

glükonokinaasi raja kaudu või 3) oksüdeerida glükonaat periplasmas 2-ketoglükonaadiks ning 

lagundada 2-ketoglükonaadi kinaasi raja kaudu. 

Kuna colR-defektne tüvi lüüsub glükoosil kasvades aga mitte glükoosi metabolismi 

vaheproduktil – glükonaadil – kasvades, siis otsustasime kontrollida kas colR mutandi 

lüüsumise põhjus võib peituda glükoosi metabolismis. Tahtsime kontrollida kas glükokinaasi 

raja töötamine (glükoosil) või mittetöötamine (glükonaadil) võiks olla colR mutandi 

lüüsumisega seotud. Hüpoteesi testimiseks analüüsiti glükokinaasi (glk) ja glükoosi 

dehüdrogenaasi (gcd) ensüümi kodeeriva geeni mutantide efekti bakterite lüüsumisele. Katse 

eesmärgiks oli selgitada, kas üks või teine metaboolne rada võib mõjutada colR-defektsete 

rakkude glükoosist sõltuvat lüüsumist. gcd mutant saab glükoosil kasvades lagundada 

glükoosi ainult glükokinaasi raja kaudu ning glk mutant saab lagundada glükoosi 

glükonokinaasi ja 2-ketoglükonaadi kinaasi radade kaudu. Oletasime, et kui rakkude suremise 

signaal tuleb glükokinaasi rajast, siis peaks colRgcd topeltmutant end glükoosil väga halvasti 

tundma. 

32

3. Glükoosi metabolismigeenide katkestuste mõju glükoos-sõltuvale lüüsumisele 

3.1 Kongo punase sidumine 

colR-defektsele tüvele on iseloomulik punaste kolooniate teke glükoos-KP-söötmel kasvades, 

samas kui PaW85 algtüve kolooniad on sellisel söötmel valged. Kuna colR mutandi punaseks 

värvumine toimub ainult glükoosil kasvades ja mitte teistel süsinikuallikatel, testisingi eelpool 

mainitud mutante võrdlevalt nii glükoosil kui ka glükonaadil. Bakterite värvumist KP-ga 

analüüsisin ka söötmetel, millele oli lisatud 1 mM fenooli, sest fenooli juuresolekul ilmneb 

fenotüüp kiiremini ja on selgemini nähtav. 

Katsest ilmnes, et ei glk ega gcd geeni katkestus ei kaotanud colR-defektsete rakkude KP 

sidumist (Joonis 8A). Vastupidi, erinevalt colR mutandist värvus colRgcd-defektne tüvi 

glükoosil kasvades KP-ga isegi tugevamini. Samas ei mõjuta gcd geeni katkestamine PaW85 

algtüves bakterite KP-ga värvumist. Joonisel 8 on välja toodud ka oprB1 mutantsed tüved. 

Kooskõlas varasemate tulemustega (Putrinš et al., 2008) kaotas poriini kodeeriva oprB1 

katkestamine colR-mutantse tüve KP sidumise (Joonis 8A). Glükonaadi söötmel ei värvunud 

KP-ga ükski tüvi (Joonis 8B). 

A 

B 

Joonis 8. P. putida algtüve PaW85 ja erinevate geenide suhtes mutantsete tüvede värvumine Kongo 

punasega nende kasvamisel glükoosi (A) või glükonaati (B) sisaldavatel tardsöötmetel. Tasse on 

pildistatud katse viiendal päeval. 

33

Kokkuvõtvalt võib öelda, et glk- ja gcd-katkestused ei kaota colR-defektse tüve glükoossõltuvast 

lüüsumisest tingitud KP sidumist. Samas suureneb colRgcd topeltmutandi 

lüüsumine, mis viitab sellele, et vaid läbi glükokinaasi raja suunatud glükoosi metabolism 

põhjustab bakterile suuremat stressi. 

3.2 Bakterite lüüsumise hindamine β-galaktosidaasi aktiivsuse määramise teel 

Glükoosi metabolismimutantide lüüsumise kvantiteerimiseks analüüsisin neid tüvesid β- 

galaktosidaasi katses. Erinevate mutantide lüüsumist illustreeriva varjestamata β- 

galaktosidaasi aktiivsuse mõõtmise tulemused näitavad, et colR mutandiga samaväärselt 

lüüsub glükoosil kasvades ka gcd mutant (Joonis 9). colRgcd topeltmutant lüüsub veel 

rohkem kui colR, mida näitab 30%-line varjestamata ensüümi aktiivsus. glk ja colRglk tüvede 

permeabiliseerimata rakkudest mõõdetud β-galaktosidaasi aktiivsuse protsent on võrreldav 

PaW85 algtüvega, seega märgatavat lüüsumist nendel tüvedel glükoosil kasvades ei esine. See 

tulemus on vastuolus KP sidumiskatsega, kus colRglk tüvi värvus KP-ga sarnaselt colR 

mutantse tüvega (Joonis 8). Samas tuleb arvestada asjaolu, et KP sidumise katse kestis 5 

päeva, aga β-galaktosidaasi määrati 24 tundi kasvanud rakkudes. 

%b-galaktosidaasi aktiivsusest 

40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

glk 

Glükoos 

ˇ 

Glükonaat 

gcd 

glk 

gcd 

oprB1 

oprB1 



wt 

wt 

colRglk 

colRglk 

colRgcd 

colRoprB1 

colRoprB1 

colRgcd 

Joonis 9. P. putida algtüve PaW85 ja erinevate glükoosi metabolismigeenide suhtes mutantsete tüvede 

lüüsumine, mille näitajaks on permeabiliseerimata rakkudest määratud suhteline β-galaktosidaasi 

aktiivus. Esitatud on kolme mõõtmise keskmised ja standardhälbed. Joonise vasakul poolel on 

glükoosi tardsöötmel 24 tundi kasvanud rakkudest mõõdetud varjestamata β-galaktosidaasi aktiivus 

ning paremal poolel glükonaadil kasvanud rakkudest mõõdetud β-galaktosidaasi aktiivus. 

34

Kui katkestada colR ja PaW85 tüvedes glk geeni, mis kodeerib glükokinaasi raja ensüümi, siis 

glükoosi metabolism on suunatud läbi glükonaadi ja 2-ketoglükonaadi radade. Selliselt toimiv 

glükoosi metabolism tundub olevat colR-defektsetele bakteritele soodne, sest colRglk 

topeltdefektne tüvi ei lüüsu, vähemalt mitte veel 24 tunni jooksul. Glükoositassil kasvanud 

gcd ja colRgcd defektsete tüvede lüüsumine on aga oluliselt suurem kui nende tüvede algsetel 

variantidel. Seega toetavad ka need tulemused hüpoteesi, et glükoosi metaboliseerimine vaid 

läbi glükokinaasi raja on P. putida-le colR-defektsele tüvele miskipärast ebasobiv ja põhjustab 

populatsiooni osalist lüüsumist. 

Kõigil glükonaaditassil kasvanud tüvedel oli mõõdetav P. putida algtüvega sarnane 

varjestamata β-galaktosidaasi aktiivsus, seega ei lüüsu ükski uuritud tüvi glükonaadil 

kasvades. Kontrolliks on Joonisel 8 esitatud ka oprB1- ja colRoprB1-defektsed tüved, mille 

varjestamata β-galaktosidaasi aktiivsusus on sarnane P. putida algse tüvega ning vastab 

varasematele tulemustele (Putrinš et al., 2008). 

4. Glükoosi metabolismigeenide katkestuste mõju bakterite antibiootikumi- ja EDTAtundlikkusele 

Meie grupi varasemad tulemused viitavad, et colR mutandil on membraani homöostaas 

häiritud ja see võib põhjustada ka bakteripopulatsiooni osalist lüüsumist glükoosil kasvades 

(Kivistik et al., 2009; Putrinš et al., 2008; Püvi, 2010). Seepärast otsustasin uurida, kas ka 

glükoosi metabolismiraja mutantidel võib membraani homöostaas häiritud olla. Selle 

testimiseks analüüsisin kõigi uuritavate tüvede tundlikkust bensüülpenitsiliini suhtes. Kuna on 

teada, et colR-mutantne tüvi on EDTA tundlik (Teesalu, 2008), siis testisin ka uuritavate 

tüvede EDTA-tundlikkust. Bensüülpenitsiliin inhibeerib peptidoglükaani sünteesi ning EDTA 

destabiliseerib välismembraani, kuna seob kahevalentseid metallioone, mis on olulised Gramnegatiivsete 

organismide välismembraani lipopolüsahhariidse kihi stabiliseerimisel. 

35

A 

B 

Joonis 10. P. putida algtüve PaW85 ja erinevate glükoosi metabolismigeenide suhtes mutantsete 

tüvede bensüülpenitsiliini- (A) ja EDTA-taluvus (B). Fotode kohal on toodud tassile külvatud 

bakterite ligikaudne arv. Tasse pildistati viiendal päeval. 

36

gcd katkestus tõstab oluliselt colR mutandis EDTA taluvust (wt tasemele) (Joonis 10B). glk ja 

colRglk mutantide bensüülpenitsiliini taluvus on oluliselt suurem kui PaW85 algtüvel (Joonis 

10A), seega mõjutab glükokinaasi raja puudumine peptidoglükaani metabolismi ning 

suurendab bakteri benüülpenitsiliini-taluvust. Samas on glükokinaasi suhtes defektsetel 

tüvedel selgelt vähenenud EDTA-taluvus – kui teised tüved suudavad EDTA 0,6 mM 

kontsentratsioonil veel kasvada, siis glk ja colRglk mutandid enam mitte (Joonis 10B). Need 

tulemused viitavad, et glk-defektsel P. putidal on häiritud välismembraani stabiilsus ja 

tõenäoliselt LPS metabolism. 

Kokkuvõtteks võib öelda, et glükokinaasi raja katkestamine mõjutab oluliselt membraani 

homöostaasi ning annab bakterile uusi omadusi, mida pole ei PaW85 algtüvel ega ka colR 

mutandil. 

Testisin ka OprB1 poriini kodeeriva geeni katkestusega mutante ja selgus, et nii oprB1 kui ka 

colRoprB1 mutantide bensüülpenitsilliini- kui ka EDTA-taluvus on sarnane P. putida algsele 

tüvele. 

37

III. Arutelu 

Kahekomponentse signaalsüsteemi ColRS puudumine põhjustab Pseudomonas putida 

glükoosil kasvava populatsiooni osalise lüüsumise, millega kaasneb rakusisaldise lekkimine 

keskkonda, Kongo punase (KP) sidumine ja seetõttu punakate kolooniate moodustamine 

glükoosi tardsöötmel (Putrinš et al., 2008). Glükoosi poriini geeni oprB1 katkestamine colRdefektses 

tüves elimineerib kõik need glükoosi söötmel ilmnevad fenotüübid (Putrinš et al., 

2008). 

Hiljuti näidati meie uurimisgrupis, et ka oprB1-ga samas operonis olevate ABC transporteri 

geenide katkestamine elimineerib colR mutantsele tüvele iseloomuliku KP-ga värvumise, mis 

viitas, et ka need geenid on lüüsiga seotud (Marta Putrinš, avaldamata andmed). Lüüsuvatest 

rakkudest väljalekkiva β-galaktosidaasi aktiivsuse mõõtmine colR ja transporteri 

topeltmutantides näitas, et nad tõepoolest ei lüüsunud glükoosil kasvades (Joonis 6B). Selline 

fenotüüp võib olla tingitud geenide paigutusest operonis (Joonis 3A, 6A). Nimelt 

moodustavad ABC transporteri geenid ühtse operoni OprB1 poriini kodeeriva geeniga, 

kusjuures oprB1 on operoni viimane geen (del Castillo et al., 2007). Seetõttu oli võimalik, et 

operonis eespool asetsevate transporterigeenide katkestamine võib vähendada oprB1 

ekspressiooni, järelikult võib transporterimutantide colR tüve komplementeeriv efekt olla 

tegelikult põhjustatud OprB1 hulga vähenemisest. Selle võimaluse kontrollimiseks 

komplementeerisin transporterimutante OprB1-ga. 

KP sidumise katsest selgus, et kõik OprB1-te üleekspresseerivad transporterimutandid 

lüüsuvad glükoosil kasvades (Joonis 6). See viitab, et tõepoolest, colR mutandile omase 

glükoos-sõltuva lüüsumise elimineerib nii OprB1 poriini geeni otsene katkestamine kui ka 

tema ekspressioonitaseme vähenemine transporterimutantides. Otseselt kinnitasid seda meie 

uurimigrupi hiljutised tulemused, kus välismembraani valkude puhastamine näitas, et 

võrreldes algse tüve ja colR mutandiga on transporterimutantides OprB1 hulk väga madal 

(Andres Ainelo, Rita Hõrak, avaldamata andmed). 

Saravolac et al. näitasid, et OprB1 on indutseeritud glükoosist ja praktiliselt puudub 

glükonaadil kasvavates rakkudes (Saravolac et al., 1991). Seega, kui OprB1 on peamine lüüsi 

38

põhjus, siis peaks tema üleekspressioon glükonaadil samuti colR mutantsed rakud lüüsuma 

ajama. Minu katsed näitasid, et OprB1 üleekspressioon põhjustas tõepoolest ka glükonaadil 

kasvavate rakkude värvumise KP-ga (Joonis 7), mis viitab sellele, et OprB1 poriini kuhjumine 

membraani destabiliseerib seda ning mõjub rakkudele toksiliselt ka glükonaadil. Samas on 

tähelepanuväärne, et glükonaadil nähtav KP-ga värvumine ja seega ka bakterite lüüs on 

ilmselgelt väiksem kui glükoosil toimuv lüüs. Seega peab lisaks glükoosil kasvavates 

rakkudes indutseeritud OprB1-le ka mingi muu faktor lüüsile kaasa aitama. Kuna glükoosil ja 

glükonaadil kasvavate rakkude metabolism erineb eelkõige selle poolest, et glükoosil töötab 

ka glükokinaasi rada, siis tekkiski kahtlus, et selle raja töötamine võib tekitada colR mutandi 

lüüsi põhjustavat faktorit. Selle hüpoteesi kontrollimiseks konstrueerisin mutandid, kus ühel 

juhul oli katkestatud glükokinaasi (glk) rada ja teisel juhul glükonaadi (gcd) rada, et 

analüüsida kummagi raja potentsiaalset osalust glükoosil kasvavate bakterirakkude lüüsis. 

Konstrueeritud katkestustüvedega (glk, colRglk, gcd ja colRgcd) tegin esmalt KP sidumise 

testi glükoosi ja glükonaadi tassidel (Joonis 8). Katsest ilmnes, et colR mutandile omane 

lüüsumine ei kadunud kummalgi colR-i ja glükoosi metabolismigeeni topeltmutandil. 

Vastupidi, colRgcd topeltmutant, mille glükoosi metabolism on suunatud vaid läbi 

glükokinaasi raja, värvus KP-d sisaldaval glükoosi tassil intensiivsemalt punaseks kui colR 

(Joonis 8A). Selline tulemus viitab sellele, et glükokinaasi raja võimendamine suurendab selle 

raja metaboliitide hulka ja põhjustab bakteripopulatsiooni suurema lüüsi. glk ja gcd geenide 

katkestamine P. putida PaW85 algtüves ei põhjustanud rakkude märgatavat KP-ga värvumist 

(Joonis 8). 

Selleks, et hinnata kvantitatiivselt antud mutantide lüüsumist, mõõtsin rakkudest välja lekkiva 

β-galaktosidaasi aktiivsust (Joonis 9). Selgus, et colRglk topeltmutandil oli väiksem 

varjestamata β-galaktosidaasi aktiivsus kui colR-defektsel tüvel olles võrreldav algsest tüvest 

mõõdetud ensüümi aktiivsusega. colRglk mutandiga tehtud KP-ga värvumise ja β- 

galaktosidaasi aktiivsuse katsete tulemused lahknevad ning selle põhjuseks võib olla asjaolu, 

et β-galaktosidaasi katse kestis vaid 24 tundi, aga KP-ga värvumist jälgisin kokkuvõttes viie 

päeva jooksul. See tähendab, et kui glk katkestus ka leevendab colR mutandi lüüsumist, mida 

saab järeldada β-galaktosidaasi katse järgi, siis ta ei kaota seda täielikult. Samuti võib selliseid 

tulemusi põhjendada tüvede erineva kasvukiiruse mõjuga. Nimelt näitasid del Castillo et al. 

39

hiljuti, et glk mutandi kasvukiirus on aeglasem kui P. putida algtüvel (del Castillo et al., 

2007). Aeglaselt kasvav colRglk mutant võib nö. lüüsumisfaasi jõuda hiljem kui colR 

mutantne tüvi, mis tähendab, et 24. tunnil, kui β-galaktosidaasi katset tegin, pole ta veel sinna 

faasi jõudnud. Küll aga lüüsub ta pikema aja jooksul, mis seletaks colRglk mutandi värvumise 

KP-ga 5-ks päevaks. 

gcd katkestamise efekt oli aga vastupidine glk geeni katkestuse efektile. Kooskõlas KP 

katsega näitas ka β-galaktosidaasi aktiivsuse mõõtmine, et võrreldes colR üksikmutandiga 

lüüsub glükoosil kasvav colRgcd topeltmutant oluliselt rohkem. Veel huvitavam oli aga see, 

et ka gcd üksikmutant lüüsub ja seda võrreldavalt colR mutantse tüvega. Need tulemused 

viitavad, et vaid läbi glükokinaasi raja toimuv glükoosi metabolism põhjustab bakteritele 

stressi, mis kulmineerub populatsiooni osalise lüüsumisega. 

Meie uurimisgrupi varasemad tulemused näitasid, et colR-defektne tüvi on EDTA tundlik 

(Teesalu, 2008). EDTA seob raku välismembraanist kahevalentseid metalliioone ja 

destabiliseerib sellega raku välismembraani lipopolüsahhariidset (LPS) kihti. Seega viitab 

colR mutandi vähenenud EDTA-taluvus, et tal on probleeme välismembraani homöostaasi 

säilitamisel. Ka meie uurimisgrupi teised tulemused viitavad colR mutandi 

membraanihäiretele (Püvi, 2010). Et uurida glükoosi metabolismigeenide katkestuste mõju 

raku membraani seisundile, testisin eespool kirjeldatud mutante EDTA ja bensüülpenitsiliini 

tundlikkuse suhtes (Joonis 10). 

Üllatuslikult selgus, et gcd ja colRgcd mutant käitusid neis katsetes sarnaselt algtüvele, 

järelikult ei ole neil suuri membraanidefekte ning meie hüpotees, et gcd mutandi suurenenud 

lüüsumise põhjuseks on membraani defektsus, ei leidnud tõestust. Samas viitasid 

tundlikkuskatsed, et hoopis glükokinaasi mutantidel on membraani homöostaas häiritud, sest 

nemad olid võrreldes P. putida algse tüve ja colR mutantse tüvega oluliselt resistentsemad 

bensüülpenitsiliinile (Joonis 10A) ja samas tundlikumad EDTA-le (Joomis 10B). Nagu 

katsetest selgus glükokinaasi raja puudumine häirib membraani homoöstaasi ja vastupidi selle 

raja töötamine gcd mutandis põhjustab glükoosil kasvavate bakterite lüüsi. Seega näitavad 

mõlema mutandiga saadud tulemused, et glükokinaasi rada on suure regulatoorse tähtsusega. 

Kirjanduses ei leidu otseseid viiteid sellele, et glükokinaasi raja töötamine võiks olla seotud 

40

akteri membraani stabiilsuse säilitamisega. Samas on mitmeid võimalusi, kuidas 

glükokinaasi rada võib membraanikomponentide sünteesi mõjutada. Nii peptidoglükaani kui 

ka välismembraani LPS-de sünteesirajal on ühine vaheühend – UDP-N-atsetüülglükoosamiin 

(Barreteau et al., 2008; Raetz & Whitfield, 2002). Kuna viimase süntees lähtub glükoos-6- 

fosfaadist, mis tekib glükokinaasi reaktsioonis, siis on täiesti selge, et glükokinaasi raja 

puudumine mõjutab rakus olevat glükoos-6-fosfaadi hulka ja see omakorda võib mõjutada 

UDP-N-atsetüülglükoosamiini hulka. Viimase koguse muutus võib muuta ka peptidoglükaani 

ja LPS-i sünteesini viivate radade tasakaalu, mida me näeme bensüülpenitsiliini ja EDTA 

tolerantsuse vastandsuunalise mõjuna. Kui see nii on, siis on järelikult glükokinaasi rada 

väga oluline membraani sünteesil tähtsate metaboliitide õige balansi hoidmisel. Minu 

tulemustest lähtudes võib ka oletada, et peptidoglükaani ja LPS-i süntees võib olla nö. 

lõivsuhtes, mis tähendab, et ühe sünteesiraja võimendamine mõjub teisele rajale pärssivalt 

(Sebkova et al., 2008). 

Glükokinaasi rada on indutseeritud nii glükoosil kui ka glükonaadil, sest need geenid on 

klasterdunud koos ED raja geenidega ja need operonid on indutseeritud kui ED raja 

vaheühend 2-keto-3-deoksü-6-fosfoglükonaat seondub repressori HexR-iga ja vabastab nende 

operonide ekspressiooni (Kim et al., 2008). Glükokinaasi raja indutseerumine glükonaadil 

kasvavates bakterites tundub mittevajalik, sest glükonaadi metaboliseerimiseks teda vaja pole. 

Samas pole välistatud, et glükokinaas pole rakule tähtis mitte ainult glükokinaasi raja 

funktsioneeerimisel vaid tal võib olla ka mõni muu tähtis funktsioon raku elutegevuses. 

41

Kokkuvõte 

Pseudomonas putida ColRS signaaliraja suhtes defektse tüve üheks iseloomulikumaks 

tunnuseks on rakupopulatsiooni osaline lüüsumine glükoosil kasvades, kusjuures teistel 

süsinukuallikatel sellist fenotüüpi ei esine. Glükoosi poriini OprB1 ja transporterigeenide 

katkestamine colR-mutantses tüves elimineerib glükoos-sõltuva lüüsumise (Putrinš et al., 

2008; Putrinš et al., 2010). Kuna aga glükoosil ja glükonaadil kasvavate rakkude metabolism 

erineb eelkõige selle poolest, et glükoosil töötab ka glükokinaasi rada, siis tekkiski kahtlus, et 

selle raja töötamine võib tekitada colR mutandi lüüsi põhjustavat faktorit. 

Käesoleva töö eesmärgiks oli selgitada OprB1 poriini ja glükoosi metabolismigeenide rolli 

colR-mutantse tüve glükoos-sõltuvas lüüsumises. Selleks üleekspresseerisin oprB1 geeni colR 

ja colR-transporteri topeltmutantides, ning konstrueerisin P. putida algtüvest PaW85 ja colRdefektsest 

tüvest glükokinaasi (glk) ja glükoosi dehüdrogenaasi (gcd) suhtes defektsed tüved. 

Töö tulemused võib kokku võtta järgmiselt: 

 

 

 

Käesoleva töö tulemused näitavad, et glükoosi poriin OprB1 on seotud colR-defektse 

tüve glükoos-sõltuva lüüsumisega. Ka glükoosi transporteri geenide katkestused 

komplementeerivad colR-defektsust kõikides testitud tingimustes täielikult. Minu töö 

tulemused viitavad, et transporterigeenide katkestamine kaotab bakterite lüüsumise 

tänu nende geenidega samas operonis oleva oprB1 geeni madalamale ekspressioonile. 

Glükoosi metabolismigeenide katkestamine näitas, et glükoosi metaboliseerimine vaid 

läbi glükokinaasi raja (gcd mutandi korral) suurendab bakterite lüüsi nii PaW85 

algtüves kui ka colR mutandis. Samuti selgus, et glükokinaasi raja katkestamine (glk 

mutant) komplementeerib colR mutanti vähendades glükoos-sõltuvaid fenotüüpe, kuid 

antud mõju on lühiajaline. Pikemat aega glükoosil kasvavad colRglk topeltmutantsed 

bakterid värvusid Kongo punase sidumise katses siiski punaseks. 

gcd mutandi lüüsumise põhjuseks pole ilmselt membraanidefekt, sest ta käitub 

bensüülpenitsilliini- ja EDTA-tolerantsuse katses nagu PaW85 algtüvi. Samas on glkmutantne 

tüvi resistentne bensüülpenitsilliinile, kuid tundlik EDTA-le, mis viitab, et 

42

glükokinaasi rada on tähtis membraani homöostaasi tagamisel bakterite kasvamisel 

glükoosil. 

43

Involvement of glucose metabolism genes in glucose-dependent lysis of 

colR-deficient Pseudomonas putida 

Olga Šapran 

Summary 

Bacteria in the environment are exposed to multiple factors, including the presence of toxic 

molecules. Survival in this changing environment requires a wide range of adaptive 

responses. Many bacterial adaptive responses to environmental changes are controlled by the 

two-component signal transduction systems (Stock et al., 2000). Typical two-component 

system consists of two proteins. Transmembrane histidine sensor kinase first detects an 

environmental stimulus and autophosphorylates. This triggers the transfer of the phosphate to 

the other protein, response regulator, which activates and regulates the life of the bacterium. 

Pseudomonas putida two-component system ColRS protects bacteria against phenol (Kivistik 

et al., 2006; Putrinš et al., 2008). It has also been shown that P. putida deficient in ColRS 

signal transduction system experiences serious carbon source-specific stress, that leads to the 

lysis of a subpopulation of bacteria growing on solid glucose medium (Putrinš et al., 2008). 

Disruption of oprB1 (Putrinš et al., 2008) and ABC transporter genes (Putrinš, Hõrak 

unpublished results, current study) completely abolishes glucose sensitivity-related 

phenotypes of colR-deficient strain. Glucose metabolism of cells growing on glucose differs 

from the cells growing on gluconate only in their different use of peripheral glycolysis 

pathways – while in glucose growing cells glycokinase pathway is working then on gluconate 

this pathway is inactive. Because of that we supposed that the glucose-dependent lysis of the 

colR-deficient strain is coursed by the glucokinase pathway metabolites. 

The aim of the current study was to detect the role of OprB1 porin and glycose metabolism 

genes in glucose-dependent lysis of the colR-deficient strain. To achieve this goal I 

overexpressed oprB1 gene in colR as well as in colR-transporter double mutants and also 

constructed P. putida and colR strains deficient in glucokinase (glk) and glucose 

dehydrogenase (gcd) genes. 

44

The results of the research can be summarised as follows: 

• Glucose porin OprB1 is directly involved in the glucose-dependent lysis of the 

colR-deficient strain. Also, all colR mutant derivatives deficient in ABC 

transporter genes complement fully colR defect. The results of my work indicate 

that interruption of transporter genes prevents colR-deficient strain glucosedependent 

lysis due to localisation of oprB1 and ABC tranporter genes that are in 

the same operon where oprB1 is last. Because of that the expression of oprB1 is 

decreased in transporter mutants. 

• Interruption of glucose metabolism genes showed that glucose metabolised only 

through the glucokinase pathway (in case of gcd mutant) increases the lysis of 

bacteria in P. putida PaW85 initial strain and also in colR mutants. It also showed 

that the interruption of gluconate pathway (glk mutant) complements colR glucosedependent 

phenotypes but the effect is short term because prolonged growth of 

colRglk double mutants in glucose coloured red in Congo red binding test. 

• gcd mutants lysis is not caused by membrane effect because it behaves in 

antibiotic and EDTA-tolerance test as P. Putida PaW85 initial strain. However, glk 

mutant strain is resistant to benzylpenitsillin but sensitive to EDTA, indicating that 

glucokinase pathway is important in ensuring membrane homeostasis in growth of 

bacteria in glucose. 

45

Kasutatud kirjandus 

Pseudomonas Genome Database: A database for Pseudomonas aeruginosa and other 

Pseudomonas species genomes (http://www.pseudomonas.com) 

Adams, M. H. (1959). Bacteriophages. Interscience Publishers Inc., New York. 

Adewoye, L. O.Worobec, E. A. (1999). Multiple environmental factors regulate the 

expression of the carbohydrate-selective OprB porin of Pseudomonas aeruginosa. Can 

J Microbiol 45, 1033-42. 

Barreteau, H., Kovac, A., Boniface, A., Sova, M., Gobec, S. &Blanot, D. (2008). Cytoplasmic 

steps of peptidoglycan biosynthesis. FEMS Microbiol Rev 32, 168-207. 

Bauchop, T.Elsden, S. R. (1960). The growth of micro-organisms in relation to their energy 

supply. J Gen Microbiol 23, 457-69. 

Bayley, S. A., Duggleby, C. J., Worsey, M. J., Williams, P. A., Hardy, K. G. &Broda, P. 

(1977). Two modes of loss of the Tol function from Pseudomonas putida mt-2. Mol 

Gen Genet 154, 203-4. 

Boyer, H. W.Roulland-Dussoix, D. (1969). A complementation analysis of the restriction and 

modification of DNA in Escherichia coli. J Mol Biol 41, 459-72. 

Cuskey, S. M., Wolff, J. A., Phibbs, P. V., Jr. &Olsen, R. H. (1985). Cloning of genes 

specifying carbohydrate catabolism in Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas 

putida. J Bacteriol 162, 865-71. 

Daddaoua, A., Krell, T. &Ramos, J. L. (2009). Regulation of glucose metabolism in 

pseudomonas: the phosphorylative branch and entner-doudoroff enzymes are 

regulated by a repressor containing a sugar isomerase domain. J Biol Chem 284, 

21360-8. 

de Lorenzo, V., Herrero, M., Jakubzik, U. &Timmis, K. N. (1990). Mini-Tn5 transposon 

derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of 

cloned DNA in gram-negative eubacteria. J Bacteriol 172, 6568-72. 

Dekkers, L. C., Bloemendaal, C. J., de Weger, L. A., Wijffelman, C. A., Spaink, H. P. 

&Lugtenberg, B. J. (1998). A two-component system plays an important role in the 

root-colonizing ability of Pseudomonas fluorescens strain WCS365. Mol Plant 

Microbe Interact 11, 45-56. 

46

del Castillo, T., Duque, E. &Ramos, J. L. (2008). A set of activators and repressors control 

peripheral glucose pathways in Pseudomonas putida to yield a common central 

intermediate. J Bacteriol 190, 2331-9. 

del Castillo, T.Ramos, J. L. (2007). Simultaneous catabolite repression between glucose and 

toluene metabolism in Pseudomonas putida is channeled through different signaling 

pathways. J Bacteriol 189, 6602-10. 

del Castillo, T., Ramos, J. L., Rodriguez-Herva, J. J., Fuhrer, T., Sauer, U. &Duque, E. 

(2007). Convergent peripheral pathways catalyze initial glucose catabolism in 

Pseudomonas putida: genomic and flux analysis. J Bacteriol 189, 5142-52. 

Duan, K., Dammel, C., Stein, J., Rabin, H. &Surette, M. G. (2003). Modulation of 

Pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies 

communication. Mol Microbiol 50, 1477-91. 

Eisenberg, R. C.Dobrogosz, W. J. (1967). Gluconate metabolism in Escherichia coli. J 

Bacteriol 93, 941-9. 

Entner, N.Doudoroff, M. (1952). Glucose and gluconic acid oxidation of Pseudomonas 

saccharophila. J Biol Chem 196, 853-62. 

Friedman, L.Kolter, R. (2004). Genes involved in matrix formation in Pseudomonas 

aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol 51, 675-90. 

Fuhrer, T., Fischer, E. &Sauer, U. (2005). Experimental identification and quantification of 

glucose metabolism in seven bacterial species. J Bacteriol 187, 1581-90. 

Hancock, R. E., Carey, A. M. (1980). Protein D1-A glucose inducible, pore-forming protein 

from the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Mikrobiol. Lett. 8, 105- 

109. 

Herrero, M., de Lorenzo, V. &Timmis, K. N. (1990). Transposon vectors containing nonantibiotic 

resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of 

foreign genes in gram-negative bacteria. J Bacteriol 172, 6557-67. 

Higgins, C. F., Hyde, S. C., Mimmack, M. M., Gileadi, U., Gill, D. R. &Gallagher, M. P. 

(1990). Binding protein-dependent transport systems. J Bioenerg Biomembr 22, 571- 

92. 

Hõrak, R., Ilves, H., Pruunsild, P., Kuljus, M. &Kivisaar, M. (2004). The ColR-ColS twocomponent 

signal transduction system is involved in regulation of Tn4652 

47

transposition in Pseudomonas putida under starvation conditions. Mol Microbiol 54, 

795-807. 

Hõrak, R.Kivisaar, M. (1998). Expression of the transposase gene tnpA of Tn4652 is 

positively affected by integration host factor. J Bacteriol 180, 2822-9. 

Johnsen, U., Selig, M., Xavier, K. B., Santos, H. &Schonheit, P. (2001). Different glycolytic 

pathways for glucose and fructose in the halophilic archaeon Halococcus 

saccharolyticus. Arch Microbiol 175, 52-61. 

Kim, J., Jeon, C. O. &Park, W. (2008). Dual regulation of zwf-1 by both 2-keto-3-deoxy-6- 

phosphogluconate and oxidative stress in Pseudomonas putida. Microbiology 154, 

3905-16. 

Kivistik, P. A., Kivi, R., Kivisaar, M. &Horak, R. (2009). Identification of ColR binding 

consensus and prediction of regulon of ColRS two-component system. BMC Mol Biol 

10, 46. 

Kivistik, P. A., Putrinš, M., Püvi, K., Ilves, H., Kivisaar, M. &Hõrak, R. (2006). The ColRS 

two-component system regulates membrane functions and protects Pseudomonas 

putida against phenol. J Bacteriol 188, 8109-17. 

Koch, B., Jensen, L. E. &Nybroe, O. (2001). A panel of Tn7-based vectors for insertion of the 

gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a 

neutral chromosomal site. J Microbiol Methods 45, 187-95. 

Llamas, M. A., Ramos, J. L. &Rodriguez-Herva, J. J. (2000). Mutations in each of the tol 

genes of Pseudomonas putida reveal that they are critical for maintenance of outer 

membrane stability. J Bacteriol 182, 4764-72. 

Ma, J. F., Hager, P. W., Howell, M. L., Phibbs, P. V. &Hassett, D. J. (1998). Cloning and 

characterization of the Pseudomonas aeruginosa zwf gene encoding glucose-6- 

phosphate dehydrogenase, an enzyme important in resistance to methyl viologen 

(paraquat). J Bacteriol 180, 1741-9. 

Miller, J. H. (1972). Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbour Laboratory 

Press, Cold Spring Harbour, NY. 

Miller, J. H. (1992). A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook 

for Echerichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold 

Spring Harbour, NY. 

48

Mizuno, T. (1997). Compilation of all genes encoding two-component phosphotransfer signal 

transducers in the genome of Escherichia coli. DNA Res 4, 161-8. 

Ninfa, A. J.Magasanik, B. (1986). Covalent modification of the glnG product, NRI, by the 

glnL product, NRII, regulates the transcription of the glnALG operon in Escherichia 

coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 5909-13. 

Pavel, H., Forsman, M. &Shingler, V. (1994). An aromatic effector specificity mutant of the 

transcriptional regulator DmpR overcomes the growth constraints of Pseudomonas sp. 

strain CF600 on para-substituted methylphenols. J Bacteriol 176, 7550-7. 

Putrinš, M., Ilves, H., Kivisaar, M. &Hõrak, R. (2008). ColRS two-component system 

prevents lysis of subpopulation of glucose-grown Pseudomonas putida. Environ 

Microbiol 10, 2886-2893. 

Putrinš, M., Ilves, H., Lilje, L., Kivisaar, M. &Horak, R. (2010). The impact of ColRS twocomponent 

system and TtgABC efflux pump on phenol tolerance of Pseudomonas 

putida becomes evident only in growing bacteria. BMC Microbiol 10, 110. 

Püvi, K. (2010). Magistritöö "Pseudomonas putida glükoosist sõltuvat autolüüsi mõjutavad 

geenid" Tartu Ülikool. 

Raetz, C. R.Whitfield, C. (2002). Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev Biochem 71, 635- 

700. 

Ramos-Gonzalez, M. I., Campos, M. J. &Ramos, J. L. (2005). Analysis of Pseudomonas 

putida KT2440 gene expression in the maize rhizosphere: in vitro expression 

technology capture and identification of root-activated promoters. J Bacteriol 187, 

4033-4041. 

Saravolac, E. G., Taylor, N. F., Benz, R. &Hancock, R. E. (1991). Purification of glucoseinducible 

outer membrane protein OprB of Pseudomonas putida and reconstitution of 

glucose-specific pores. J Bacteriol. 173, 4970-6. 

Sebkova, A., Karasova, D., Crhanova, M., Budinska, E. &Rychlik, I. (2008). aro mutations in 

Salmonella enterica cause defects in cell wall and outer membrane integrity. J 

Bacteriol 190, 3155-60. 

Selig, M., Xavier, K. B., Santos, H. &Schonheit, P. (1997). Comparative analysis of Embden- 

Meyerhof and Entner-Doudoroff glycolytic pathways in hyperthermophilic archaea 

and the bacterium Thermotoga. Arch Microbiol 167, 217-32. 

49

Solano, C., Garcia, B., Valle, J., Berasain, C., Ghigo, J. M., Gamazo, C., et al. (2002). 

Genetic analysis of Salmonella enteritidis biofilm formation: critical role of cellulose. 

Mol Microbiol 43, 793-808. 

Stock, A. M., Robinson, V. L. &Goudreau, P. N. (2000). Two-component signal transduction. 

Annu Rev Biochem 69, 183-215. 

Teesalu, M. (2008). Bakalaureusetöö "Kahekomponentne signaalsüsteem ColRS on vajalik 

Pseudomonas putida kasvamisel magneesiumivaeses glükoosi söötmes". Tartu 

Ülikool. 

Trias, J., Rosenberg, E. Y. &Nikaido, H. (1988). Specificity of the glucose channel formed by 

protein D1 of Pseudomonas aeruginosa. Biochim Biophys Acta 938, 493-6. 

Wang, C. H., Stern, I. J. &Gilmour, C. M. (1959). The catabolism of glucose and gluconate in 

Pseudomonas species. Arch Biochem Biophys 81, 489-92. 

Vicente, M.Canovas, J. L. (1973a). Glucolysis in Pseudomonas putida: physiological role of 

alternative routes from the analysis of defective mutants. J Bacteriol 116, 908-14. 

Vicente, M.Canovas, J. L. (1973b). Regulation of the glucolytic enzymes in Pseudomonas 

putida. Arch Mikrobiol 93, 53-64. 

Voet, D., Voet, J., Pratt, C. (2008). Principles of Biochemistry, 3e, International Student 

Version. 

Wood, W. A.Schwerdt, R. F. (1954). Carbohydrate oxidation by Pseudomonas fluorescens. II. 

Mechanism of hexose phosphate oxidation. J Biol Chem 206, 625-35. 

Wylie, J. L.Worobec, E. A. (1995). The OprB porin plays a central role in carbohydrate 

uptake in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 177, 3021-3026. 

50

GlÃ¼koosi metabolismigeenide osalus Pseudomonas putida colR ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?