Indutseeritava AIRE-püsirakuliini valmistamine
Indutseeritava AIRE-püsirakuliini valmistamine
Indutseeritava AIRE-püsirakuliini valmistamine
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
TARTU ÜLIKOOL<br />
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND<br />
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT<br />
Rakubioloogia õppetool<br />
ARSTITEADUSKOND<br />
ÜLD- JA MOLEKULAARPATOLOOGIA INSTITUUT<br />
Molekulaarpatoloogia töörühm<br />
Uku Haljasorg<br />
<strong>Indutseeritava</strong> <strong>AIRE</strong>-püsirakuliini <strong>valmistamine</strong><br />
Magistritöö<br />
Juhendajad<br />
PhD Tõnis Org<br />
PhD Ana Rebane<br />
PhD Arnold Kristjuhan<br />
TARTU 2011
Sisukord<br />
Sisukord................................................................................................................................................... 2<br />
Kasutatud lühendid .................................................................................................................................. 3<br />
Sissejuhatus ............................................................................................................................................. 5<br />
1. Kirjanduse ülevaade ........................................................................................................................ 7<br />
1.1 T-lümfotsüütide küpsemine tüümuses ja avatud geeniekspressioon ....................................... 7<br />
1.2 <strong>AIRE</strong> ....................................................................................................................................... 9<br />
1.3 <strong>AIRE</strong> transkriptsiooni regulaatorina. .................................................................................... 11<br />
1.4 RNA-polümeraas II-e C-terminaalse domeeni roll transkriptsiooni algusetappides ............. 14<br />
1.5 Tetratsükliiniga reguleeritav geeniekspressiooni süsteem .................................................... 17<br />
2. Eksperimentaalosa ......................................................................................................................... 19<br />
2.1 Töö eesmärgid ....................................................................................................................... 19<br />
2.2 Materjalid ja meetodid .......................................................................................................... 19<br />
2.2.1 Rakud ja söötmed .......................................................................................................... 19<br />
2.2.2 Algsed plasmiidid .......................................................................................................... 19<br />
2.2.3 <strong>AIRE</strong> cDNA kloneerimine pTRE-Tight plasmiidi ........................................................ 19<br />
2.2.4 Transformatsioon ja plasmiidse DNA eraldamine ........................................................ 20<br />
2.2.5 Restriktsioonianalüüs ja sekveneerimine kloonide õigsuse kontrollimiseks ................. 21<br />
2.2.6 Eukarüootsete rakkude kasvatamine ............................................................................. 21<br />
2.2.7 Tet-On Advanced-liini transfekteerimine ...................................................................... 21<br />
2.2.8 SDS-polüakrüülamiid-geelelektroforees ja Western blot totaalsest rakulüsaadist ........ 22<br />
2.2.9 Immunofluorestsents (IF) .............................................................................................. 22<br />
2.2.10 Geeniekspressiooni aktivatsiooni analüüs ..................................................................... 23<br />
2.2.11 Kiire ja kvantiseeritav kromatiini immunosadestamine (KrIS) ..................................... 24<br />
2.3 Tulemused ............................................................................................................................. 27<br />
2.3.1 Kloneerimine indutseeritava <strong>AIRE</strong> ekspressiooniga rakuliini valmistamiseks ............. 27<br />
2.3.2 Tet-on Advanced-liini <strong>valmistamine</strong>, <strong>AIRE</strong> ekspressiooni ja lokalisatsiooni kontroll .. 29<br />
2.3.3 <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide ekspressiooni analüüs indutseeritava <strong>AIRE</strong>ga püsiliinis ......... 31<br />
2.3.4 Kromatiini immunosadestamine <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide promootoritel toimuvate<br />
muudatuste detekteerimiseks ......................................................................................................... 33<br />
2.4 Arutelu ................................................................................................................................... 36<br />
Kokkuvõte ............................................................................................................................................. 39<br />
Tänuavaldused ....................................................................................................................................... 40<br />
Kasutatud kirjandus ............................................................................................................................... 40<br />
Generation of a Cell-Line with Doxycycline-Inducible <strong>AIRE</strong> expression............................................ 45<br />
Lisad ...................................................................................................................................................... 46<br />
2
Kasutatud lühendid<br />
AGE avatud geeniekspressioon<br />
<strong>AIRE</strong> autoimmuunsusregulaatori geen<br />
<strong>AIRE</strong> autoimmuunsusregulaatori valk<br />
APECED autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy<br />
APS1 autoimmune polyendocrine syndrom 1<br />
CARD caspase-recruitment domain<br />
CBP CREB-binding protein<br />
CD<br />
cluster of differentiation<br />
Cdk<br />
cycline-dependant kinase<br />
CREB cAMP response element binding<br />
CTD C-terminaalne domeen valgul<br />
cTEC cortical thymic epithelial cell<br />
DNA-PK DNA-activated protein kinase<br />
GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase<br />
H2A.X histoon H2A variant X<br />
HBG hemoglobiin, gamma G<br />
HPRT hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase<br />
IFI16 interferon, gamma-inducible protein 16<br />
INV involucrine<br />
KrIS kromatiini immunosadestamine<br />
KSA koespetsiifiline antigeen<br />
MHC major histocompatibility complex<br />
mTEC medullary thymic epithelial cell<br />
PHD plant homeodomain<br />
PRR proliinirikas regioon<br />
P-TEFb positive transcription elongation factor b<br />
pTK-Hyg hügromütsiini resistentsusgeeni sisaldav plasmiid<br />
pTRE tetratsükliinile reageerivat elementi sisaldav plasmiid<br />
Rpb<br />
RNA polymerase B (II) subunit<br />
RIPA radioimmunoprecipitation assay<br />
3
tTA<br />
S100A8<br />
SAND<br />
TCR<br />
TOA<br />
TRE<br />
tTA<br />
reverse tetracycline-controlled transactivator<br />
S100 calcium binding protein A8<br />
Sp100, <strong>AIRE</strong>, NucP41/75, DEAF-1<br />
T-cell receptor<br />
Tet-off/Tet-on Advanced<br />
tetracycline-responsive promoter elements<br />
tetracycline-controlled transactivator<br />
4
Sissejuhatus<br />
Organismi immunoloogiline kompetents tagatakse mitmete kudede ja rakkude<br />
omavahelise dünaamilise ja süsteemse koostööga. Immuunsüsteemi peamiseks eesmärgiks on<br />
rakkudevaheliste interaktsiooni abil tagada organismile kaitse patogeenide eest. Nagu teiste<br />
organismi süsteemide puhul on ka immunoloogiliselt pädevate kudede korrektne areng<br />
indiviidi elukvaliteedi vaatenurgast kriitilise tähtsusega. Rakulise immuunsuse korrektse<br />
toimimise eest vastutavad primaarsed lümfoidsed organid (luuüdi, tüümus), mis koostöös<br />
tervete sekundaarsete lümfoidsete organitega ja professionaalsete antigeene presenteerivate<br />
rakkudega tagavad organismile toimiva immunoloogilise tasakaalu. Primaarsete lümfoidsete<br />
organite normaalsest hälbiv areng kajastub isegi tervete sekundaarsete kudede korral kogu<br />
immuunsüsteemi talitluses, võides põhjustada immuunpuudulikkust või autoimmuunsust.<br />
Immuunpuudulikkuse korral tekib immuunsüsteemil raskusi organismi tunginud<br />
võõrorganismide kahjutuks tegemisega. Autoimmuunsuse puhul on immuunsüsteem välise<br />
ohu elimineerimises sageli sama pädev kui normaalselt arenenud immuunsüsteem, kuid näeb<br />
ohtu ka mõnedes organismi oma kudedes. Tulemuseks on konkreetse koe osaline või täielik<br />
hävitamine organismi oma immuunsüsteemi poolt ning talitluse kadu (Abbas, 2007).<br />
Levinumate organismi oma kudesid hävitavate autoimmuunhaiguste (esimest tüüpi diabeet,<br />
hulgiskleroos jt) uurimine on nende polügeensest taustast tingituna raskendatud: isegi kui tegu<br />
on haiguse ühesuguste kliiniliste vormidega, ei ole alati võimalik kindlaks teha, millistes<br />
geenides olevad mutatsioonid selle täpsemalt esile kutsusid. Samuti mängivad nende haiguste<br />
kujunemise juures suurt rolli erinevad faktorid indiviidi elukeskkonnas. APS1 (autoimmune<br />
polyendocrine syndrome 1) seevastu avaldub juba ühes geenis <strong>AIRE</strong><br />
(autoimmuunsusregulaator) esinevate valgu funktsioneerimist häirivate mutatsioonide<br />
tagajärjel (Aaltonen jt, 1997; Nagamine jt, 1997). Kuigi ka ühest geenist sõltuva haiguse<br />
uurimine on keeruline, on APS1 sobilik autoimmuunhaiguste mudel, et selle haiguse<br />
uurimisest saadud tulemusi laiendada teiste, laiemalt levinud ning mitmetest faktoritest<br />
sõltuvate haiguste geneetilistele tekkepõhjustele.<br />
Käesoleva magistritöö kirjanduse osas antakse ülevaade T-rakkude küpsemisest<br />
tüümuses ning selle protsessi etappidest. Lähemalt räägitakse tüümuses toimuva T-<br />
lümfotsüütide negatiivses selektsioonis kriitilise rolliga autoimmuunregulaatori geenist<br />
(<strong>AIRE</strong>) ning valgust (<strong>AIRE</strong>). Ühtlasi antakse ülevaade <strong>AIRE</strong>-valgu molekulaarsetest<br />
toimemehhanismidest ning teadaolevatest partneritest immuunsüsteemi tasakaalu säilitamisel.<br />
Lähemalt tuleb juttu RNA-polümeraasII rollist <strong>AIRE</strong>ga seotud transkriptsiooni<br />
5
algusetappides. Samuti tutvustatakse eksperimentaalse osa aluseks olevat tetratsükliini ja selle<br />
derivaatidega indutseeritavat ekspressioonisüsteemi.<br />
Eksperimentaalse osa kirjelduses antakse ülevaade <strong>AIRE</strong>t vaid doksütsükliini<br />
juuresolekul tootva rakuliini loomisprotsessist ja valmistatud liini kontrollimiseks tehtud<br />
katsetest.<br />
6
1. Kirjanduse ülevaade<br />
1.1 T-lümfotsüütide küpsemine tüümuses ja avatud<br />
geeniekspressioon<br />
Imetajate rakulise immuunsuse kujunemise keskseks organiks on tüümus. Selles organis<br />
saavutavad küpsuse keharakkude pinnal võõrvalke ära tundvad T-lümfotsüüdid (Gotter ja<br />
Kyewski, 2004). Sünnijärgselt siseneb hiire tüümusesse iga päev vereringe kaudu 10-100<br />
küpsetele T-rakkudele iseloomulike pinnamarkerite CD (cluster of differentiation) 4 ja CD 8<br />
suhtes topeltnegatiivset eellasrakku (CD4 - CD8 - ). Umbes 2-nädala jooksul paljunevad<br />
topeltnegatiivsed tümotsüüdid ligikaudu 20 korda, mis tähendab umbes 5x10 7 T-raku tootmist<br />
päevas. Neist rakkudest jõuab järgnevate põhjalike kontrollmehhanismide ning apoptoosi<br />
tõttu organismi laiali aga alla 5% (Egerton jt, 1990; Kyewski ja Klein, 2006). Esimene<br />
kontrollpunkt küpsemises on rekombinatsioon TCRi (T-cell receptor) β-ahela lookuses, mille<br />
järel küpsevad lümfotsüüdid omandavad CD4 + CD8 + -fenotüübi. Sellele järgneb rakkude<br />
proliferatsioon ja seejärel rekombinatsioon TCRi α-ahela lookuses. Juhuslike<br />
ümberkorraldustega TCRi α- ja β-ahelate lookustes saavutatakse olukord, kui organismis on<br />
väga suur valik kindla spetsiifikaga TCRi omavaid T-rakke, millest igaüks tunneb ära vaid<br />
ühe kindla järjestusega MHC (major histocompatibility complex) poolt esitletava peptiidi.<br />
Juhuslike ümberkorralduste käigus tekib hulgaliselt selliste TCRga rakke, mis ei interakteeru<br />
MHC ja esitletava peptiidi kompleksiga üldse ja vältimatult ka selliseid mis tunnevad ära<br />
MHC-peptiidi kompleksis organismile omastest valkudest pärinevaid peptiide (Cheng jt,<br />
2007). Sellise TCRiga rakud käituvad tüümusest väljudes kõigis aspektides täpselt nagu<br />
nende immunoloogiliselt kompetentsed, võõrvalkudega reageerivad T-rakud, v.a ühes<br />
punktis: autoreaktiivsed T-rakud aktiveeruvad ja hakkavad prolifereeruma kokku puutudes<br />
kehaomase valguga (nt insuliin), põhjustades koostöös antikehi tootvate B-rakkudega häireid<br />
konkreetset valku ekspresseeriva koe funktsioonis. Nende, nn autoreaktiivsete lümfotsüütide<br />
perifeeriasse sattumise vältimiseks on tüümuses täiendavad kontrollmehhanismid. T-rakkude<br />
valimise esimeseks sammuks tüümuses on cTECide (cortical thymic epithelial cells) poolt<br />
läbi viidav positiivne selektsioon, mille käigus elimineeritakse kõik T-rakud, mille TCR ei<br />
seondu MHC-valgu kompleksiga (joonis 1).<br />
Edasi migreeruvad küpsevad lümfotsüüdid tüümuse kortikomedullaarsesse piirkonda ja<br />
läbivad järgmise kontrollpunkti, negatiivse selektsiooni, mille käigus suunatakse apoptoosi<br />
need lümfotsüüdid, millel on kõrge afiinsus neile tüümuse medulla epiteeli rakkude (mTEC)<br />
7
ja dendriitrakkude pinnal esitletavate MHC-autoantigeenkomplekside suhtes. Negatiivse<br />
selektsiooni läbinud T-rakud jagunevad suures osas kaheks, olenevalt sellest, kas negatiivse<br />
selektsiooni käigus toimus interaktsioon MHCI või MHCII-ga. Vastavalt siis CD4 - CD8 +<br />
(tsütotoksilisteks) ja CD4 + CD8 - (abistavateks) T-rakkudeks. Negatiivse selektsiooni<br />
iseärasuseks on see, et lümfotsüütidele esitletakse kompleksis MHCga väga suurt valikut<br />
autoantigeene, mis kuuluvad vaid kindlates kudedes ekspresseeritavate valkude koosseisu<br />
(Abbas, 2007; Marrella jt, 2008; Nagamine jt, 1997; Peterson, 2008). Lisaks erinevate<br />
organite spetsiifilistele antigeenidele esitletakse lümfotsüütidele ka ajalisel skaalal koos mitteekspresseeritavaid<br />
s.o organismi eri arenguetappidel vajatavatest valkudest pärinevaid<br />
autoantigeene (Gäbler jt, 2007; Kyewski ja Klein, 2006). Nähtust, mille korral neid geene<br />
tüümuse epiteelis erandkorras ekspresseeritakse, nimetatakse avatud geeniekspressiooniks<br />
(AGE) (Cheng jt, 2007). Suure osa mTECdes ekspresseeritavate koespetsiifiliste antigeenide<br />
transkriptsiooni aktivatsiooni eest vastutavaks valguks on <strong>AIRE</strong> (autoimmuunsuse regulaator)<br />
(Anderson jt, 2002; Derbinski jt, 2001). <strong>AIRE</strong> rolli AGE läbiviimisel näidati <strong>AIRE</strong>-puudulike<br />
hiirtega, kelle tüümuse medullaarsed epiteelirakud ei ekspresseeri paljusid metsiktüüpi<br />
organismis esinevaid koespetsiifilisi antigeene (KSA) (Anderson jt, 2002). <strong>AIRE</strong> vastutab<br />
küll paljude, kuid mitte kõigi KSAde ekspressiooni eest. Suure hulga <strong>AIRE</strong>-sõltuvate KSAde<br />
sh α-kaseiini, γ-hemoglobiini, insuliini jne kõrval ekspresseeritakse mTECides ka <strong>AIRE</strong>sõltumatuid<br />
koespetsiifilisi antigeene, nt CRP (C-reactive protein) ja GAD 67 (glutamic acid<br />
decarboxylase isoform 67), mille ekspressioonitase <strong>AIRE</strong>-puudulikes hiirtes oluliselt ei lange<br />
(Anderson jt, 2002).<br />
On huvitav, et erinevate metsiktüüpi hiireliinide tüümustes ekspresseeruvad <strong>AIRE</strong>sõltuvad<br />
KSAd erineval tasemel (Venanzi jt, 2008). Lisaks on nn ühe raku PCRi alusel, kus<br />
uuritakse geenide ekspressiooni üksikutes rakkudes, näidatud, et mTECdes esinevad olulised<br />
erinevused ka juba kahe <strong>AIRE</strong>-positiivse mTECi poolt ekspresseeritavate KSAde koosseisus<br />
(Derbinski jt, 2008; Venanzi jt, 2008). Need tulemused viitavad sellele, et <strong>AIRE</strong> olemasolust<br />
sõltuvate antigeenide ekspressioon rakus on juhuslik ja iga konkreetse geeni aktivatsioon<br />
rakus ei pruugi olla pidev, vaid on pigem ajutine (Derbinski jt, 2008; Venanzi jt, 2008).<br />
8
Joonis 1. Tümotsüütide areng tüümuses (Marrella jt, 2008). Topeltpositiivsed (DP – CD4 + CD8 + ) rakud<br />
interakteeruvad positiivse selektsiooni käigus cTEC (cortical thymic epithelial cell) pinnal asuva MHCga (major<br />
histocompatibility complex). MHCd mitte ära tundvad rakud kõrvaldatakse. Interakteerunud tümotsüüdid<br />
liiguvad tüümuse medullaarsesse piirkonda, kus mTECde (medullary thymic epithelial cells) pinnal esitletakse<br />
neile MHCga kompleksis koespetsiifilisi antigeene (TRA – tissue restricted antigen). Selle kompleksiga<br />
seondunud tümotsüütidest suunatakse apoptoosi need rakud, mille seondumine kompleksiga on liiga kõrge<br />
afiinsusega. Madalama afiinsusega seonduvad rakud omandavad positiivsuse ühe pinnamarkeri (CD4 + või CD8 + )<br />
suhtes (SP) ja liiguvad perifeeriasse<br />
1.2 <strong>AIRE</strong><br />
Inimese <strong>AIRE</strong> on 14 eksoniks jaotatud 11,9 kb pikkune geen, mis asub 21. kromosoomi<br />
piirkonnas q22.3, ja sellelt kodeeritav <strong>AIRE</strong>-valk on 545 aminohappejääki pikk. <strong>AIRE</strong>-geenis<br />
esinevad <strong>AIRE</strong>-valgu funktsioneerimist häirivad mutatsioonid põhjustavad haruldast<br />
autosomaalset retsessiivset autoimmuunhaigust APS1 (autoimmune polyendocrinopathy<br />
syndrome 1) ehk APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal<br />
dystrophy) (Aaltonen jt, 1997; Nagamine jt, 1997)<br />
APS1 on oma monogeense etioloogia tõttu suurepärane mudelhaigus, mille uurimisest<br />
saadud tulemusi loodetakse laiendada ka komplekssemate, mitmest geenist põhjustatud<br />
haiguste uurimiseks (Peterson, 2008). Haigus diagnoositakse kliinilise triaadi korral –<br />
krooniline limaskestade kandidoos ning kõrvalkilpnäärmete ja neerupealiste alatalitlus<br />
9
(DeVoss ja Anderson, 2007). Lisaks esineb väiksema sagedusega esimest tüüpi diabeeti,<br />
allopeetsiat, hepatiiti, türoidiiti jm. Samas ei pruugi teisesed nähud kattuda isegi sama tüüpi<br />
<strong>AIRE</strong>-mutatsiooni puhul (nt õed-vennad) (Mathis ja Benoist, 2009).<br />
<strong>AIRE</strong> on ekspresseerunud peamiselt tüümuse medulla epiteelirakkudes (mTEC) (Heino<br />
jt, 1999). Teistest kudedest on teated <strong>AIRE</strong> leidmisest vastuolulised – on väidetud, et <strong>AIRE</strong><br />
ekspresseerub hiirte puhul nii mitmetes immuunsüsteemi rakkudes (Kogawa jt, 2002),<br />
spermatotsüütides (Schaller jt, 2008) kui lümfisõlmedes ning põrna stroomarakkudes<br />
(Gardner jt, 2008). Samas esineb ka töid, kus <strong>AIRE</strong>t väljaspool mTECe ei tuvastatud (Hubert<br />
jt, 2008). Inimesel on <strong>AIRE</strong>-ekspressiooni tuvastatud lisaks mTECidele lümfisõlmedes,<br />
mandlites ja ka soolestikuga seotud lümfoidsest koest (Poliani jt, 2010).<br />
Tüümuse epiteeli rakutuumades esineb <strong>AIRE</strong> peamiselt selgelt eristatavate<br />
tuumakehakestena (Björses jt, 1999), kuid ka hajusalt üle kogu tuuma (Pitkanen ja Peterson,<br />
2003), tsütoplasmas esineb <strong>AIRE</strong> immunofluorestsentsi katsete põhjal enamasti aga<br />
fibrillidena (Rinderle jt, 1999).<br />
Tüümuses on <strong>AIRE</strong>-positiivseid rakke ~0,005% (Hubert jt, 2008). Kuid vaatamata väga<br />
piiratud ekspressioonile on selle valgu olemasolu inimese immuunsüsteemi tasakaalu<br />
hoidmise vaatepunktist hädavajalik (Anderson jt, 2002). <strong>AIRE</strong>-valgu peamiseks ülesandeks<br />
tüümuses peetakse selles koes mitteekspresseeritavate koespetsiifiliste geenide<br />
transkriptsiooni aktiveerimist (Anderson jt, 2002) ning seeläbi tüümuse medullas toimuva T-<br />
rakkude negatiivse selektsiooni korraldamist (Liston jt, 2003).<br />
Joonis 2. Aire funktsionaalsed domeenid ning nende ülesanded. Lühendid: CARD (caspase‐recruitment domain)<br />
NLS (nuclear localisation signal), SAND (Sp100, <strong>AIRE</strong>, NucP41/75, DEAF-1), PHD (plant homeodomain),<br />
PRR (proliinirikas regioon), L (LXXLL tuumaretseptorit siduv motiiv). Domeenide nimede kohal olevas kastis<br />
on graafiliselt ära toodud patsientidel esinevad APS1-te põhjustavate mutatsioonide asukohad. Retsessiivsete<br />
mutatsioonide kõrval on tumedana eraldi välja toodud SAND-domeenis paiknev ainus dominantselt edasi<br />
kanduv mutatsioon G228W (muudatustega Peterson jt, 2008)<br />
<strong>AIRE</strong>-valgus esinevate struktuursete domeenide põhjal peetakse teda juba geeni<br />
tuvastamisest saadik transkriptsiooni regulaatoriks (Nagamine jt, 1997) ning lõviosa ~60st<br />
leitud APECEDi põhjustavast mutatsioonist (Mathis ja Benoist, 2009) asub just<br />
transaktivatsiooni eest vastutavates piirkondades (joonis 2). <strong>AIRE</strong>-valgu N-terminuses asub<br />
10
CARD (caspase‐recruitment domain), mis on vajalik <strong>AIRE</strong> oligomeriseerumises (Pitkanen jt,<br />
2001). Teistes valkudes DNA-seoselise domeenina tuvastatud SANDis (SP100, <strong>AIRE</strong>1,<br />
nucP41/P75 ja DEAF1) asub ainus teadaolev APECEDi põhjustav dominantne mutatsioon<br />
G228W. Selle mutatsiooni korral on muutunud <strong>AIRE</strong> lokalisatsioon ning valgu<br />
transaktiveeriv võime kaob (Ilmarinen jt, 2005).<br />
Lisaks esineb <strong>AIRE</strong>s transkriptsioonifaktoritele omane PRR (proliinirikas regioon), neli<br />
tuumaretseptorit siduvat LXXLL-motiivi (L tähistab konserveerunud leutsiini ja X suvalist<br />
aminohapet) ja tuuma lokalisatsiooni signaal NLS. Teine teisel pool PRRi esineb <strong>AIRE</strong>l ka<br />
kaks PHD-tsinksõrme (plant homeodomain). PHD-sõrmed on kromatiini siduvate valkude<br />
hulgas laialt levinud. Tegemist on umbes 60 aminohapet pika, kahte Zn 2+ iooni siduva<br />
domeeniga, mille vahendusel valgud suudavad eristada teineteisest nii erinevaid<br />
metüleeritavaid aminohappejääke kui ka selle modifikatsiooni astmeid. PHD-tsinksõrmi<br />
sisadavate valkude osalust on näidatud geeniekspressiooni repressioonis, transkriptsiooni<br />
aktivatsioonis (Org jt, 2008; Taverna jt, 2006), DNA metülatsioonis (Ooi jt, 2007) ja<br />
histoonide demetülatsioonis (Lan jt, 2007). <strong>AIRE</strong> esimese PHD-sõrme olulisust rõhutab<br />
asjaolu, et CARDi kõrval on just selles transaktiveerivas domeenis enim APECEDi<br />
põhjustavaid mutatsioone.<br />
1.3 <strong>AIRE</strong> transkriptsiooni regulaatorina.<br />
Inimese umbes 24000st valku kodeerivast geenist moodustavad transkriptsioonifaktorid<br />
ligikaudu 6% (Vaquerizas jt, 2009). <strong>AIRE</strong> on sama töö andmetel üheks 123st n-ö<br />
koespetsiifilisest faktorist, mida ekspresseeritakse ühes koes oluliselt kõrgemal tasemel kui<br />
mujal. <strong>AIRE</strong> (ja ka teised koespetsiifilised faktorid) osalevad transkriptsioonis osana<br />
suuremast kompleksist ning on üldlevinud transkriptsioonifaktoritele abiks geenide<br />
aktiveerimisel või mahasurumisel (Peterson jt, 2008; Vaquerizas jt, 2009). On näidatud, et<br />
<strong>AIRE</strong> osaleb vähemalt ühes
signaaliks (Kalkhoven, 2004). <strong>AIRE</strong>-negatiivsetes rakkudes on CBP tsütoplasmaatilise<br />
paigutusega, kuid positiivsetes rakkudes liigub CBP tuuma, kolokaliseerub seal <strong>AIRE</strong>ga<br />
(Ferguson jt, 2008) ning omavahelises koostöös aktiveerivad nad nii reporter- kui ka<br />
endogeenseid geene (Ferguson jt, 2008; Pitkänen jt, 2005).<br />
P-TEFb (positive transcription elongation factor b) on samuti üks valk, mille puhul on<br />
näidatud interaktsiooni <strong>AIRE</strong>ga (Oven jt, 2007). P-TEFb on Cdk9 (cyclin dependent kinase 9)<br />
ja kinaasi aktiveeriva T-tsükliini heterodimeer, mida on transkriptsiooni initsiatsiooni<br />
üleminekul elongatsiooni vaja N-TEFi (negative transcription elongation factor), DSIFi ning<br />
RNA-polümeraas II-e (polII) CTD (C-terminaalne domeen) fosforüülimiseks (Saunders jt,<br />
2006). Et selle artikli tulemusena osaleb <strong>AIRE</strong> kompleksis P-TEFbga polII C-terminaalse<br />
domeeni (CTD) heptapeptiidse korduse teises positsioonis oleva seriini fosforüülimises,<br />
pakkus Peterlini töögrupp välja, et <strong>AIRE</strong> ei ole mitte transkriptsiooni initsieeriv, vaid<br />
elongatsiooni soodustav transkriptsioonifaktor (Oven jt, 2007).<br />
<strong>AIRE</strong> interaktsioonipartneriks on ka DNA-PK (DNA-activated protein kinase). Tegu<br />
on seriini/treoniini kinaasiga, mis in vitro-katsetes fosforüülib <strong>AIRE</strong>-valku positsioonidest<br />
T68 ja S156 (Liiv jt, 2008). Nende aminohapete vahetamine alaniinide vastu takistab <strong>AIRE</strong><br />
oligomeeride teket ning ka transkriptsiooni aktivatsiooni.<br />
<strong>AIRE</strong> kahest PHD-sõrmest esimene interakteerub <strong>AIRE</strong>-reguleeritavate<br />
nukleosoomides leiduva histooni H3 N-terminusega, ning in vivo seondub <strong>AIRE</strong> ka<br />
kromatiinile, sealhulgas ka <strong>AIRE</strong> poolt reguleeritavate geenide promootoritele (Koh jt, 2008;<br />
Org jt, 2008). Histoon H3 N-terminuse posttranslatsioonilised modifikatsioonid on heaks<br />
indikaatoriteks transkriptsiooniliselt aktiivsete piirkondade kindlakstegemisel. Nii leidub H3<br />
neljandas positsioonis asuva lüsiini trimetüleeritud vormi rohkelt just aktiivselt<br />
transkribeeritavate geenide promootoritel (Bannister ja Kouzarides, 2005) (nt GAPDH –<br />
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), samas kui konkreetses koes<br />
mitteekspresseeritud koespetsiifiliste geenide promootoritel on sama lüsiini metüleerimata<br />
vorm (H3K4me0) (Noma jt, 2001). Arvatakse, et <strong>AIRE</strong> on võimeline oma esimese PHDsõrmega<br />
seonduma tuhandete selliste modifitseerimata H3K4 omavate geenide<br />
promootoritega ning indutseerima nende geenide ekspressiooni (Koh jt, 2008; Org jt, 2008).<br />
Katsed ekspressioonikiipidega on näidanud, et <strong>AIRE</strong> aktiveerib erinevates kudedes ja ka<br />
rakuliinides erinevaid geene (Gardner jt, 2008; Guerau-de-Arellano jt, 2008; Org jt, 2009).<br />
<strong>AIRE</strong> poolt aktiveeritavate geenide puhul on leitud siiski ka teatud ühisjooni: nad on<br />
koespetsiifilise ekspressioonimustriga, algselt madala ekspressiooniga ja nende promootoritel<br />
on madal H3K4me3 tase (Org jt, 2009).<br />
12
<strong>AIRE</strong>ga interakteeruvate valkude kindlakstegemiseks kombineerisid Abramson jt<br />
(2010) immunosadestamist mass-spektromeetria ja RNA-interferentsiga ning leidsid 21 valku,<br />
millega <strong>AIRE</strong> otsesel või kaudsel teel on seotud (Abramson jt, 2010). Nende mudeli kohaselt<br />
osaleb üks kompleks, kus lisaks <strong>AIRE</strong>le ja DNA-PKle on veel TOP2 (topisomeraas 2),<br />
PARP-1 (poly-ADP ribose polymerase 1), FACT (facilitates chromatin transcription) ja Ku<br />
(kaheahelalise DNA-katkeid siduv valk), transkriptsiooni elongatsiooni käigus DNAsse<br />
tekkivate pingete leevendamiseks kaheahelaliste lõigete tekitamises ja ligeerimises<br />
(Abramson jt, 2010). Samasse kompleksi kuulus ka histooni H2A variant H2A.X, mida<br />
lisatakse kaheahelalisse DNAsse tehtavate lõigete piirkonda. Teise kompleksi moodustavad<br />
<strong>AIRE</strong> ning pre-mRNA protsessimises osalevad valgud. Leiti, et <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide<br />
protsessitud mRNA tase on <strong>AIRE</strong>-positiivsetes rakkudes oluliselt kõrgem kui kontroll-liinis,<br />
samas kui pre-mRNA taset <strong>AIRE</strong> olemasolu ei mõjutanud.<br />
Teatud tingimustes võib <strong>AIRE</strong> käituda ka geeni ekspressiooni repressorina.<br />
Kotransfekteeritud <strong>AIRE</strong> ja PIAS1 (protein inhibitor of activated STAT1 (signal transducers<br />
and activators of transcription 1) aktiveerivad insuliini promootorile järgnevat reportergeeni.<br />
Samas surus <strong>AIRE</strong> transfektsioon maha (kotransfektsioon PIAS1ga võimendas efekti) kõrgelt<br />
ekspresseeritava koduhoidjageeni CSTB (cystatin B) promootorile järgneva reporteri<br />
ekspressiooni (Ilmarinen jt, 2008).<br />
Kõigi nende interaktsioonide tõttu on pakutud, et <strong>AIRE</strong> võib mõjutada erinevaid<br />
varajase geeni ekspressiooni regulatsiooni etappe, alustades transkriptsiooni initsiatsioonist<br />
ning lõpetades mRNA protsessimisega. Tegemist ei ole üksteist välistavate protsessidega,<br />
kuid üheselt selget pilti <strong>AIRE</strong> rollist pole veel moodustunud. Peamiseks põhjuseks, miks<br />
<strong>AIRE</strong> täpse funktsiooni ning temaga seonduvate valkude uurimine viibib, on see, et <strong>AIRE</strong><br />
interaktsioone teiste valkudega peetakse suhteliselt nõrgaks, lühiajaliseks ning seetõttu ka<br />
raskesti tuvastatavaks. Tulemusi hägustab ka asjaolu, et viimase ajani ei ole olnud võimalik<br />
määrata suurtes dünaamilistes kompleksides asuvate valkude täpset asukohta ning otseseid<br />
interaktsioonipartnereid. Abramsoni jt (2010) töö pakub välja nimekirja <strong>AIRE</strong><br />
potentsiaalsetest partneritest, kuid otseseid interaktsioone ei ole nad suutnud näidata. Lisaks<br />
raskendab <strong>AIRE</strong> proteoomilisi uuringuid ka kompleksi suurus, kus valk osaleb (Halonen jt,<br />
2004). Kuni 2010. aastani oli suurimaks peptiidi tasemel tuvastatud valgukompleksiks mitoosi<br />
kääviniidistiku moodustumiseks vajalik 176 kDa Ndc80 (e HEC1 – highly expressed in<br />
cancer cells) kompleks (Maiolica jt, 2007). 2010. aasta alguses avaldati töö, kus suudeti<br />
ristseotud valke ja mass-spektromeertiat kasutades kindlaks teha promootorile seonduva<br />
TFIIFi täpne asukoht 670 kilodaltonilises polII kompleksis (Chen jt, 2010). Selle grupi<br />
tulemused langevad kokku ka samal ajal ilmunud teise preinitsiatsioonikompleksi uuriva<br />
13
tööga, kus uuriti TFIIF ja polII struktuuri kasutades in vitro-transkriptsiooni süsteemi<br />
(Eichner jt, 2010). Nendes töödes kasutatavate meetodite rakendamine <strong>AIRE</strong> uurimises võiks<br />
tuua selgust ka selle, tervikliku tüümuse ning rakulise immuunsüsteemi arengu eest vastutava<br />
valgu funktsioonides.<br />
1.4 RNA-polümeraas II-e C-terminaalse domeeni roll<br />
transkriptsiooni algusetappides<br />
<strong>AIRE</strong> kui transkriptsioonifaktor osaleb praeguste tulemuste põhjal peaasjalikult<br />
transkriptsiooni initsiatsioonis ning elongatsioonis. Initsiatsiooniga seotusele viitavad tema<br />
interaktsioonid vaigistatud kromatiinile omase histoon H3 neljandas positsioonis oleva lüsiini<br />
metüleerimata vormiga ning sellele järgneva transkriptsiooni aktiveerimisega (Koh jt, 2008;<br />
Org jt, 2008). Elongatsiooniga, või vähemalt selle algusetapiga seob <strong>AIRE</strong>t kompleks P-<br />
TEFiga, mis on Peterlini grupi andmetel vajalik RNA-polümeraasi C-terminaalse domeeni<br />
fosforüleerimiseks (Oven jt, 2007). Seetõttu on vaja siinkohal kirjeldada ka eukarüootses<br />
transkriptsioonis keskset rolli mängivat RNA-polümeraasi.<br />
Praeguseks on eukarüootsetel organismidel teada kolm DNA-sõltuvat RNApolümeraasi<br />
(pol). polI on keskeks valgukompleksiks rRNA, polII mRNA ja väikeste tuuma-<br />
RNAde ning polIII tRNAde ning mõnede teiste väikeste RNAde transkriptsioonis (Cramer jt,<br />
2008; Egloff ja Murphy, 2008). Transkriptsiooni initsieerimiseks on vaja pol ning üldiste<br />
transkriptsioonifaktorite tihedat koostööd. Kõigi kolme mainitud polümeraasi transkriptsiooni<br />
initsieerimise mehhanismid on põhimõtteliselt ühesugused (Hahn, 2009): moodustub<br />
preinitsiatsioonikompleks, DNA-ahelad lahutatakse helikaasi abil teineteisest ja<br />
transkribeeritav ahel seondub ensüümi aktiivtsentrisse ja järgneb initsiatsioon (Hahn, 2009;<br />
Kornberg, 2007). Käesolevas töös käsitletakse lähemalt kõigi valku kodeerivate (sh ka <strong>AIRE</strong>reguleeritavate)<br />
geenide mRNAde transkriptsiooni eest vastutava polII CTDd ning<br />
transkriptsiooni initsiatsioonil ning elongatsiooni algusjärgus osalevaid valgukomplekse.<br />
polII keskne kompleks koosneb 10 alaühikust, millest Rpb5, 6, 8, 10 ja 12 (RNA<br />
polymerase B (II) subunit) alaühikud on kõigil kolmel polümeraasil ühised. Lisaks on<br />
kompleksis veel Rpb4/7 heterodimeer (Cramer jt, 2008), nii moodustub kokku ~0.5 MDa<br />
kompleks. polII iseloomulikuks ning kriitilise tähtsusega osaks on Rpb1 C-terminaalne<br />
domeen (CTD), mis imetajate puhul koosneb 52st heptapeptiidsest kordusest YSPTSPS. CTD<br />
peptiidide korduste järgi oletatakse, et kehtib seos CTD korduste arvu ning konkreetse<br />
organismi genoomse keerukuse vahel. Eukarüootsetest organismidest „lihtsaimas“<br />
14
mudelorganismis pärmis on sama peptiidi kordusi 26, nematoodis 32 ja Drosophila’s 45<br />
(Egloff ja Murphy, 2008). Kuigi in vitro on transkriptsioon võimalik ka ilma CTD<br />
järjestuseta, on selle domeeni deletsioon in vivo, olenemata organismist, letaalne.<br />
CTD moodustab ülejäänud kompleksi taha omamoodi saba, milles paiknevaid<br />
aminohappeid modifitseeritakse sõltuvalt polümeraasi liikumisest (Cramer jt, 2008). CTD<br />
posttranslatsioonilised modifikatsioonid mängivad olulist rolli interaktsioonides<br />
transkriptsiooni eri etappides polII kompleksiga liituvate valkudega. Kõige põhjalikumalt on<br />
uuritud CTD-koodi aluseks peetavat teises ning viiendas positsioonis asuvate seriinide (Ser2<br />
ja Ser5) fosforüülimist (P) (Egloff ja Murphy, 2008). Kuigi transkriptsiooni initsiatsioon ning<br />
elongatsioon saab toimuda ka seriine fosforüülimata, on need posttranslatsioonilised<br />
modifikatsioonid hädavajalikud interaktsioonideks kotranskriptsioonilisi protsesse (RNA<br />
splaissimine, 5’-otsa katmine, 3’-otsa polüadenüleerumine) läbiviivate valkudega (Wade ja<br />
Struhl, 2008). Samuti on seriinide modifitseerimine vajalik transkriptsiooni initsiatsioonis<br />
kasutatavate, kuid elongatsioonis tarbetute valkude eemaldamiseks kompleksist (Peterlin ja<br />
Price, 2006).<br />
polII/TFIIF (Transcription factor IIF) kompleksi seondumisel kromatiiinil paikneva<br />
preinitsiatsioonilise kompleksiga seondumisel on CTD korduse teine ja viies seriin mõlemad<br />
modifitseerimata (joonis 3). Ser5 fosforüülimise eest vastutab viimasena<br />
preinitsiatsioonikompleksi lisanduva TFIIH alaühik Cdk7 (cyclin-dependent kinase 7). Ser5<br />
fosforüülimine on initsieeriva kompleksi moodustumise tunnuseks. Sellest positsioonist<br />
modifitseeritud polII leidub eelkõige geenide 5' otsas. Transkriptsiooni initsieerudes jõuab<br />
SeR5P-polII liikuda 20–50 aluspaari allavoolu, kus kogu kompleks sunnitakse pausi tegema<br />
(Hager jt, 2009). Edasi on kolm võimalust: transkriptsioon termineerub ja kogu kompleks<br />
lahkub DNAlt, kompleks jääbki ootele või liigub edasi järgmisesse etappi – elongatsiooni.<br />
Teine variant on tavaline transkriptsiooniliselt inaktiivsete geenide promootoritel, kust pärmi<br />
puhul on leitud Ser5P-polII kompleks, kuid mitte küpseid mRNA transkripte (Wade ja Struhl,<br />
2008).<br />
15
Joonis 3. polII CTD heptapeptdiidi aminohappeline järjestus. Eraldi on välja toodud CTD-koodi aluseks<br />
peetavate seriinidega (Ser2 ja Ser5) toimuvad fosforüülimised, transkriptsiooni initsiatsioonil (B), elongatsioonil<br />
geeni keskosas (C), defosforüülimine geeni 3’ otsas (D). Ser5 fosforüülimist vahendab TFIIH subühik Cdk7 ning<br />
Ser2 puhul P-TEFi subühik Cdk9, mis mTECides võiks Oven jt (2007) mudeli põhjal töötada koos <strong>AIRE</strong>ga.<br />
Geeni 3’-otsa poole liikudes toimub Ser5 järk-järguline defosforüülimine Rtr1 ja Ssu72 poolt (D)<br />
Selleks, et transkriptsioon võiks jõuda järgmisesse, elongatsioonietappi, peab<br />
transkribeeriv polII kompleks vabanema tema ning transkriptiga kohe peale initsiatsiooni<br />
seonduva fosforüülimata N-TEFi (negative elongation factor) ja DSIFi (DRB sensitivityinducing<br />
factor) mõju alt. N-TEFi kinaasiks ning kompleksist eemaldajaks on selles etapis P-<br />
TEFb, mille alaühik Cdk9 fosforüülib lisaks negatiivsele regulaatorile ka polII CTD Ser2te,<br />
mis on signaaliks elongeeriva kompleksi moodustumisest (Peterlin ja Price, 2006). Oven jt<br />
(2007) poolt väljapakutud mudeli kohaselt käib see mTECides <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenidel<br />
koostöös <strong>AIRE</strong>ga. Ser2 fosforüülimise järel eemaldatakse transkriptsioonikompleksist<br />
initsiatsiooniks tarvilikud, kuid elongatsiooniks mittevajalikud valgud (üldised<br />
transkriptsioonifaktorid, mediaatorkompleks jt) ning suureneb kompleksi afiinsus mRNAd<br />
protsessivate valkude suhtes. Pärmis on näidatud, et varajases elongatsioonis algab CTD<br />
kordusjärjestustel ka Ser5P järkjärguline defosforüülimine Rtr1 (regulator of transcription 1)<br />
poolt (Mosley jt, 2009) ning geeni 3’ otsa jõudes eemaldab Ssu72 fosfaatrühmad viimastelt<br />
CTD kordustelt (Krishnamurthy jt, 2004).<br />
Elongatsioonini jõuab kõigist pausi teinud polümeraasidest vaid ligikaudu 9% polII<br />
molekulidest (Darzacq jt, 2007) ning ideaaljuhul lahkub polII kromatiinilt alles geeni läbimise<br />
järel ning on seejärel võimeline uuesti transkriptsiooni algatama (Fuda jt, 2009).<br />
Kui kromatiini üldine struktuur välja jätta, siis selle, millal ja mis koguses mingit kindlat<br />
geeni transkribeeritakse, määravad geeni promootori järjestus, temaga piirnevad alad ning<br />
kaugemad ekspressiooni võimendavad järjestused. Kuigi aktivaatorid ja repressorid võivad<br />
promootoril asuvate komponentidega ka otse suhelda, toimub tegelik regulatsioon siiski<br />
enamasti koregulaatorite kaudu. Mõned viimatimainitutest interakteeruvad polII ja üldiste<br />
transkriptsioonifaktoritega otse, teised tunnevad ära transkriptsiooni algusega seotud<br />
nukleosoome ja toimivad kromatiini kovalentsete modifitseerijatena, muutes geenialasse jääva<br />
kromatiini tertsiaarstruktuuri.<br />
16
1.5 Tetratsükliiniga reguleeritav geeniekspressiooni süsteem<br />
Et uurida geeni ekspressiooni regulatsiooni ajas, on abiks, kui selles osalevate valkude<br />
enda ekspressioon on täpsemalt moduleeritav. Imetejate rakkudes on üheks selliseks<br />
võimaluseks tetratsükliiniga reguleeritavate promootorsüsteemide kasutamine.<br />
Tetratsükliiniga reguleeritavaid rakuliine on nende ligi 20-aastase ajaloo jooksul edukalt<br />
kasutatud nii ravimiarenduses, haigusmudelite, RNAi kui ka paljude geenide funktsioonide<br />
uurimises (Freundlieb, 2007) ning ka indutseeritud pluripotentsete rakkude loomiseks<br />
(Woltjen jt, 2009). Rakuliinid jagunevad kaheks: liinid, millel saab tetratsükliini või tema<br />
derivaatide (doksütsükliin) lisamisega uuritava geeni ekspressiooni maha suruda (Tet-Off),<br />
ning liinid, millele sama antibiootikumi lisamine söötmesse aktiveerib kindla geeni<br />
ekspressiooni (Tet-On) (Freundlieb jt, 1999).<br />
Mõlemas süsteemis on rakuliinid stabiilselt transfekteeritud E.colist pärineva<br />
tetratsükliinile resistentsust tagavast operonist pärineva tetratsükliinist sõltuva<br />
transkriptsioonifaktor tTAd (tetracycline transactivator) ekspresseeriva plasmiidiga. Lisaks<br />
tuleb valmistatavat liini transfekteerida uuritava valgu cDNAd ning TRE-järjestust<br />
(tetracycline-responsive promoter elements) sisaldava vektoriga. tTAst Herpes simplex<br />
viiruse VP16 kolme minimaalse aktivatsioonidomeeniga disainitud liitvalk seondub Tet-Offliinide<br />
puhul raku kromatiini integreerunud plasmiidis asuva TREga, mis on kokku liidetud<br />
CMV minimaalse promootoriga. tTA TRE-elemendile seondumisele on signaaliks CMV<br />
minimaalse promootori järel asuva uuritava geeni transkribeerimise aktiveerimiseks (joonis<br />
4). Tetratsükliini olemasolu korral rakus seondub tTA aga hoopis antibiootikumiga ning<br />
promootoriga seondumist ega transkriptsiooni ei järgne. Tet-On-liini puhul kasutatakse tTAvalgu<br />
mutantset vormi, milles nelja aminohappe vahetamise tagajärjel on valk (rtTA –<br />
(reverse tetracycline transactivator)) võimeline CMV promootori ees olevale TREelemendile<br />
seonduma ja transkriptsiooni aktiveerima vaid tetratsükliini juuresolekul.<br />
Joonisel 4 kujutatud Tet-Off Advanced-ja Tet-on Advanced-rakuliinid (TOA) on Tet-Onliinide<br />
edasiarendus, mis ekspresseerivad valku samadel põhimõtetel kui Tet-On-liinid, kuid<br />
ekspressioon on blokeeritav ja indutseeritav vaid doksütsükliiniga. Ka on neil Tet-on-liinide<br />
ees mõningad eelised: TOA-liinides kasutatav rtTA aktiveerib geeniekspressiooni 10 korda<br />
madalamal doksütsükliini tasemel kui varasemad transaktivaatorid, mistõttu on võimalik<br />
TOA-tehnoloogiat edukalt kasutada ka transgeensete loomade tegemises (Freundlieb, 2007).<br />
Eelnevalt oli see raskendatud doksütsükliini suhteliselt lühikese poolestusaja tõttu mõnedes<br />
kudedes (Urlinger jt, 2000). Samuti suudeti selle modifitseeritud transaktivaatoriga<br />
17
kõrvaldada varasemates tet-tehnoloogiates probleeme põhjustanud negatiivse kontrolli<br />
taustekspressioon.<br />
Joonis 4. Vasakul on kujutatud Tet-Off Advanced-süsteemi, mille puhul transaktiveeriv liitvalk tTA (tetracycline<br />
transactivator) seondub P Tight plasmiidis TRE MOD (modified tetracycline-responsive promoter elements)<br />
promootorile ning indutseerib kõrge ekspressiooni CMV promootorile järgnevalt geenilt (Gene of interest).<br />
Keskkonda lisatav doksütsükliin seondub rtTAga ning ei lase valgu transkriptsiooni initsieerida. Paremal<br />
näidatudTet-On Advanced süsteemis kasutatav muteeritud rtTA (reverse tetracycline transactivator) on aga<br />
võimeline DNAga seonduma ja transkriptsiooni indutseerima vaid doksütsükliiniga (Dox) kompleksis olles<br />
(muudatustega, www.clontech.com).<br />
TOA-liinides on oluliselt tõhusamaks muudetud ka transfekteerimiseks kasutatavat<br />
plasmiidi. pTRE-Tight-plasmiidi (joonisel 4 märgitud P Tight ) (2,6 kb) on CMV minimaalse<br />
promootori ette lisatud doksütsükliiniga indutseeritav järjestus TREMOD (modified tetracyclineresponsive<br />
promoter elements), mis koosneb seitsmest modifitseeritud E.coli tet-operaatori<br />
kordusjärjestusest (www.clontech.com).<br />
TOA-liinide peamisteks eelisteks tavaliste püsiliinide ees on see, et kaob ära vajadus<br />
kasutada kontroll-liini. Ühest ja samast liinist pärit sobivad paralleelselt nii katseks kui ka<br />
negatiivseks kontrolliks olenevalt sellest, kas söötmesse on lisatud uuritava geeni<br />
transkriptsiooni reguleerivat doksütsükliini või mitte. Lisaks, erinevalt püsivalt valku<br />
ekspresseerivatest liinidest, kus ekspressioon esineb sageli piiratud efektiivsusega,<br />
ekspresseerivad TOA-liinid uuritavat valku ühtlaselt kõigis rakkudes ning seda sõltuvalt<br />
lisatava doksütsükliini hulgast (Urlinger jt, 2000;Freundlieb 2007).<br />
18
2. Eksperimentaalosa<br />
2.1 Töö eesmärgid<br />
Käesoleva töö eesmärgiks oli luua doksütsükliiniga indutseeritav <strong>AIRE</strong> ekspressiooniga<br />
rakuliin ning liinis ekspresseeritava <strong>AIRE</strong>-valgu funktsionaalsuse verifitseerimine, mis<br />
võimaldaks kasutada antud rakuliini erinevate <strong>AIRE</strong> funktsiooniga seotud protsesside<br />
uurimiseks molekulaarsel tasemel.<br />
2.2 Materjalid ja meetodid<br />
2.2.1 Rakud ja söötmed<br />
Bakteritüvedest kasutati Escherichia coli tüve Nova XG (Novagen).<br />
Nova XG: F – mcrA Δ(mcrC–mrr) endA1 recA1 φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(araleu)7697<br />
galU galK rpsL nupG λ – tonA<br />
Baktereid kasvatati LB (Lurian-Bertani) vedelsöötmes (trüptoon 10 g/l, pärmiekstrakt 5<br />
g/l, NaCl 10 g/l) ja agartassidel (10 g/l, pärmiekstrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l) 37 °C<br />
juures. Söötmetele oli lisatud ampitsilliini (lõppkontsentratsioon 100 μg/ml).<br />
2.2.2 Algsed plasmiidid<br />
Rakuliini valmistamiseks kasutati pTK-Hyg ja pTRE-Tight plasmiide (mõlemad firmast<br />
Clontech). Esimene tagas rakuliini valmistamisel resistentsuse selektiivse antibiootikumi<br />
hügromütsiini suhtes, teise kloneeriti <strong>AIRE</strong> cDNA, mis saadi PCRi abil GST-<strong>AIRE</strong><br />
plasmiidilt (kingitus K. Sakselalt).<br />
2.2.3 <strong>AIRE</strong> cDNA kloneerimine pTRE-Tight plasmiidi<br />
<strong>AIRE</strong> amplifitseerimiseks viidi 20 ng <strong>AIRE</strong>-GST plasmiidiga läbi polümeraasi<br />
ahelreaktsioon. Praimeritena kasutati:<br />
h<strong>AIRE</strong>_EcoRI_F: 5’ – TTTTGAATTCACCATGGCGACGGACGCGGCGCT – 3’<br />
h<strong>AIRE</strong>_HindIII+stop_R2: 5’ – TATACTAAGCTTTCAGGAGGGGAAGGGGG – 3’<br />
Kõik käesolevas töös kasutatavad praimerid on tellitud firmast TAG Copenhagen A/S.<br />
19
Kasutati Eppendorfi Mastercycler´it ja järgmist programmi:<br />
Algne denaturatsioon<br />
Denaturatsioon<br />
Praimerite seondumine<br />
Süntees<br />
Lõplik süntees<br />
96°C 5minutit<br />
95°C 20 sekundit<br />
63°C 30 sekundit<br />
72°C 3 minutit<br />
72°C 5 minutit<br />
30 tsüklit<br />
Produktide pikkust kontrolliti 1% TAE agaroos-geelelektroforeesil.<br />
PCR produktid puhastati kommertsiaalse DNA puhastamise komplektiga NucleoSpin®<br />
Extract II (Macherey-Nagel) vastavalt tootja protokollile.<br />
0,5-1 μg igat puhastatud PCR produkti ning 2 μg pTRE-Tight plasmiide lõigati 3 ühiku<br />
EcoRI ja HindIII restriktaasidega (Jena Bioscience) 2X Tango puhvris (33 mM Tris-atsetaat<br />
pH 7.9, 10 mM magneesiumatsetaat, 66 mM kaaliumatsetaat, 0.1 mg/ml BSA) (MBI<br />
Fermentas). Rektsioonisegu maht viidi MilliQ veega 20 μl-ni. Restriktsioonireaktsioone<br />
inkubeeriti 1 h 37 °C juures.<br />
Restrikteeritud PCR produktid ja plasmiid pTRE-Tight lahutati 1X TAE puhvris (40<br />
mM Tris-atsetaat, 1 mM EDTA, pH 8,3) tehtud 1 %-lisel preparatiivsel agaroosgeelil,<br />
kasutades horisontaalset agaroos-geelelektroforeesi aparaati (Bio-Rad Laboratories). DNA<br />
tehti UV valguses nähtavaks geelile lisatud etiidiumbromiidiga (lõppkontsentratsioon 0,01<br />
μg/ml) ja DNA fragmentide suurust hinnati 100 bp DNA Ladder (Solis Biodyne). DNA<br />
elueeriti geelist DNA puhastamise komplektiga NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel)<br />
vastavalt tootja protokollile.<br />
Ligatsiooni jaoks võeti lõigatud PCR produkte ja plasmiidi pTRE-Tight ekvimolaarses<br />
suhtes 5:1. Reaktsioonis kasutati 3 ühikut T4 ligaasi ja 1X T4 ligaasipuhvrit (40mM Tris-HCl<br />
pH 7,8, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) (MBI Fermentas). Rektsioonisegu maht<br />
viidi MilliQ veega 20 μl-ni. Ligeerimine kestis 1h toatemperatuuril. Reaktsioon peatati,<br />
kuumutades 65°C juures 10 minutit<br />
2.2.4 Transformatsioon ja plasmiidse DNA eraldamine<br />
Saadud plasmiidiga transformeeriti E. coli tüve Nova XG kompetentseid rakke. 200 μl<br />
rakususpensioonile lisati 5-10 μl ligatsioonisegu. Rakke hoiti 30 minutit jääl, millele järgnes<br />
kuumašokk (2 minutit 37°C juures) ja jahutamine jääl (1 minut). Rakkudele lisati 800 μl LB<br />
söödet ja inkubeeriti 15 minutit 37°C juures. Rakud sadestati tsentrifuugimisega 2 minuti<br />
jooksul 6000 rpm (MiniSpin® tsentrifuug, Eppendorf), suspendeeriti 100 μl LB söötmes ning<br />
plaaditi LB agarsöötmele, mis sisaldas ampitsilliini (100 μg/ml). Plaaditud rakke inkubeeriti<br />
20
üleöö 37°C juures. Plasmiidi paljundamiseks võeti järgmisel päeval plaatidelt üksikkolooniad<br />
ja kasvatati 2 ml LB vedelsöötmes (sisaldas ampitsilliini 100 μg/ml) üleöö 37°C juures .<br />
Üleöö kasvanud rakkudest eraldati plasmiidne DNA Invisorb Spin Plasmid Mini Two<br />
minipreparatsiooni komplektiga (Invitek) vastavalt tootja protokollile.<br />
2.2.5 Restriktsioonianalüüs ja sekveneerimine kloonide õigsuse<br />
kontrollimiseks<br />
0,5-1 μg minipreparatsiooniga saadud plasmiidset DNA-d lõigati 3 ühiku EcoRI ja<br />
HindIII restriktaasidega (Jena Bioscience) 2X Tango puhvris (MBI Fermentas).<br />
Rektsioonisegu maht viidi MilliQ veega 20 μl-ni. Restriktsioonireaktsioone inkubeeriti 1 h 37<br />
°C juures. Markeriks kasutati 1kb DNA ladder (Solis BioDyne).<br />
Mutatsioonide puudumise kindlakstegemiseks sekveneeriti kaks minipreparatsiooniga<br />
saadud ja restriktsioonanalüüsil ennustatud suurusega fragmente andnud plasmiidi.<br />
Sekveneerimised teostati Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudis DNA<br />
genotüpiseerimise ja sekveneerimise tuumiklaboris 3130xl Genetic Analyzer või 3730xl DNA<br />
Analyzer (Applied Biosystems) sekvenaatoritega. Tulemused analüüsiti tarkvaraprogrammiga<br />
BioEdit. Sekveneerimisel kasutati praimereid:<br />
hAireV80L_R: 5’ – TTGAACAGCAACCTCCAGAAG – 3’<br />
<strong>AIRE</strong>praimer2F: 5’ – TATGAATTCCAGCTCCACCAGAAGAATGA – 3’<br />
<strong>AIRE</strong>praimer_3R_2: 5’ – TATGTCGACTTACTGCACCTCCTGGACTGTT – 3’<br />
2.2.6 Eukarüootsete rakkude kasvatamine<br />
Kõikide eksperimentide läbiviimiseks kasutati Tet-On Advanced HEK 293 rakuliini<br />
(Human embryonic kidney) (Clontech). Rakke kasvatati nii rakuliini valmistamise kui ka<br />
järgnevate eksperimentide käigus DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)<br />
vedelsöötmes, millele lisati 10% kontrollitult tetratsükliinivaba veise loote seerumit (mõlemad<br />
firmast PAA), 1% penitsilliini ja streptomütsiini segu (Invitrogen) ning 15 mg/ml G418<br />
antibiootikumi (PAA) 37°C juures 5%-lisel CO 2 kontsentratsioonil koekultuuri inkubaatoris.<br />
Rakuliini valmistamise ajal lisati söötmesse selektiivset antibiootikumi, hügromütsiin b-d<br />
(PAA), kontsentratsiooniga 75 μg/ml. Valmisliinis kasutati rakkude indutseerimiseks<br />
doksütsükliini (Clontech) kontsentratsiooniga 1 μg/ml.<br />
2.2.7 Tet-On Advanced-liini transfekteerimine<br />
Transfekteerimiseks kasutati ExGen 500 (polüetüleenamiin) In vitro Transfection<br />
Reagent (Fermentas AB). Kõik transfekteerimiseks kasutatud segud sisaldasid 10 μg<br />
plasmiidset DNAd ja 35 μl ExGeni ühe ml 150 mM NaCl lahuse kohta. Lisatava<br />
transfektsioonisegu maht moodustas 10% rakkudel oleva söötme mahust. Induktsiooniks<br />
21
kasutatava doksütsükliini koguse optimeerimisel transfekteeriti rakke pTRE vektorisse<br />
kloneeritud inimese <strong>AIRE</strong>-geeni plasmiidi ning pd2EYFP YFP-d (yellow fluorescent protein)<br />
kodeerivat plasmiidi (Clontech). Püsirakuliini valmistamisel kasutati pTRE vektorisse<br />
kloneeritud inimese <strong>AIRE</strong>-geeni plasmiidi ja pTK Hyg (Clontech) suhtes 10:1.<br />
2.2.8 SDS-polüakrüülamiid-geelelektroforees ja Western blot totaalsest<br />
rakulüsaadist<br />
Rakkudelt eemaldati sööde ja pesti PBSiga. Puhver eemaldati ning lisati 1 ml 1-kordset<br />
Laemmli puhvrit. Rakulüsaate kuumutati 5 minutit 96°C juures ja 10 μl neist pipeteeriti 10%<br />
SDS-polüakrüülamiidgeelile ning erineva molekulmassiga valgud lahutati üksteisest<br />
elektroforeesil.<br />
Elektroforeesi käigus üksteisest lahutatud valgud kanti Trans Blot SemiDry süsteemis<br />
(Bio Rad) üle PVDF (polüvinülideenfluoriid) filtrile (Millipore Corporation) (poori suurus<br />
0,45 μm 2 ) vastavalt masina tootja protokollile 25 minuti jooksul. Ülekande käigus valkudest<br />
vabaks jäänud filtripinna blokeerimiseks pandi filter 5% lõssisisaldusega TTBS-lahusesse<br />
(100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150mM NaCl, 0,1% Tween 20) üleöö 4°C juurde loksuma.<br />
<strong>AIRE</strong>-valgu detekteerimiseks kasutati inimese <strong>AIRE</strong>-vastast hiire monoklonaalset<br />
antikeha <strong>AIRE</strong> 6.1 (Heino jt, 1999, puhastajaks E. Juronen) ja kontrolliks GAPDH<br />
(glütseeraldehüüdtrifosfaadi dehüdrogenaasi) vastast hiire monoklonaalset antikeha (Abcam).<br />
Primaarsed antikehad olid 5% lõssisisaldusega TTBS-lahuses lahjendusega vastavalt 1:1500<br />
ning 1:5000. Peale ühetunnist inkubatsiooni primaarse antikeha lahuses pesti filtrit 3x15<br />
minutit TTBSi puhvris ning asetati sekundaarse antikeha (1:10000) 5%lisse lõssisisaldusega<br />
TTBS-lahusesse. Sekundaarse antikehana kasutati hiire IgG-vastast HRPga (horse raddish<br />
peroxidase) konjugeeritud polüklonaalset antikeha (Santa Cruz Biotech). Filtrit pesti 3x15<br />
minutit TTBS-puhvris ja inkubeeriti 5 minuti jooksul Luminogeni (GE Healthcare) lahuses ja<br />
detekteeriti ning kvantiseeriti Image Quant RT-ECL (GE Healthcare) masinaga.<br />
2.2.9 Immunofluorestsents (IF)<br />
Rakke kasvatati kuuekambrilisel alusel katteklaasi peal (24x24 mm). Katteklaasid<br />
tõsteti uude kambrisse ja rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdi PBSi lahuses. Peale 2x5<br />
minutit pesu PBSis, rakud permeabiliseeriti 15 minuti jooksul 0,5% Triton X100/1% NGSi<br />
(Normal Goat Serum) (Dako Cytomation) PBS-lahuses. Rakke pesti 3x10 minutit 1% NGS<br />
PBSis. Järgnes 1 tund inkubatsiooni toatemperatuuril primaarse antikehaga (inimese <strong>AIRE</strong>vastane<br />
hiire monoklonaalne antikeha 6.1). Rakke pesti 2x10 minutit 1% NGS PBSis ning<br />
inkubeeriti sekundaarsete, fluorestseeruva värviga konjugeeritud hiire IgG-vastase antikehaga<br />
(Abcam) 1 tunni jooksul toatemperatuuril, mille järel pesti rakke 4x10 minutit 1% NGS-<br />
22
PBSis (kolmas pesu sisaldas tuumade värvimiseks 1:2000 DAPI värvi ) . Katteklaasid pesti<br />
üle destilleeritud veega ning kinnitati alusklaasile sulundusvedelikuga Fluorescent Mounting<br />
Medium (DakoCytomation). Antikehadega märgistatud rakke vaadeldi ja pildistati Tartu<br />
Ülikooli Molekulaarse ja Kliinilise Meditsiini Keskuse visualiseerimise ja skriinigu<br />
tuumiklaboris laserkonfokaalmikroskoobiga LSM5 DUO (Zeiss). Piltide töötlemiseks kasutati<br />
programmi Corel Draw 12.<br />
2.2.10 Geeniekspressiooni aktivatsiooni analüüs<br />
Rakke kasvatati 3,5 Ø cm 6-kambrilistel plaatidel. Rakke pesti PBSiga ning lüüsiti 800<br />
μl TRIZOLiga (Invitrogen) 5 minuti jooksul toatemperatuuril. Tuubi lisati 200 μl kloroformi,<br />
segati vorteksil ja hoiti toatemperatuuril 2 minutit. Seejärel fuugiti lüsaate 15 minutit 12000<br />
rcf 4°C juures. Eraldus vesifaas, millest 600 μl kanti üle uude tuubi ja lisati 420 μl (0,7 vol)<br />
isopropanooli ning 1 μl glükogeeni. Segu hoiti 10 minutit toatemperatuuril ja RNA sadestati<br />
tsentrifuugides 15 minuti jooksul 12000 rcf 4°C juures. Põhja sadenenud RNAd pesti kaks<br />
korda 75%-lise etanooliga ja fuugiti uuesti 7500 rcf 4°C juures ning peale etanooli<br />
eemaldamist võeti üles 12 μl milliQ-s. Rakkudest eraldatud RNA baasil sünteesiti<br />
SuperScript® VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) kasutades cDNA vastavalt<br />
tootjapoolsele protokollile.<br />
Uurimaks, mil määral <strong>AIRE</strong> oma sihtmärkgeene valmistatud liinis aktiveerib, viidi<br />
sünteesitud cDNA baasil läbi Q-RT-PCR (Quantitative real time polymerase chain reaction)<br />
ABI Prism 7900 HT Fast Real-Time PCR System-masinaga (Applied Biosystems).<br />
Töös kasutatud qPCR SYBR Green Core Kit (Eurogentec) põhineb komplektis oleval<br />
spetsiifiliselt kaheahelalise DNAga seonduval värvainel SYBR Green I, mis ergastamisel<br />
fluorestseerub. Fluorestsentsi hulk kasvab võrdeliselt PCRi käigus sünteesitava kaheahelalise<br />
DNAga.<br />
cDNA põhjal teostatava Q-RT-PCRi praimerid on sageli disainitud cDNA põhjal nii, et<br />
praimeri üks ots kuulub ühte ning teine teise eksonisse. Sel viisil on puhul võimalik vältida<br />
genoomse DNA kontaminatsiooni korral ebaspetsiifiliste produktide tekkimist. Igal praimeril<br />
on oma kindel dissotsatsioonitemperatuur, mistõttu lisati programmi lõppu<br />
dissotsiatsioonifaas, millega sai jälgida tekkivate produktide spetsiifilisust.<br />
HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) osaleb puriinide<br />
metabolismis ja on organismis üldise levikuga n-ö koduhoidjageen. <strong>AIRE</strong> kontrollitavate<br />
geenide hulka kuuluvad püsiliinis inimese INV, HBG2, IFI16 ja S100A8 geenidest pärinevad<br />
praimeripaarid (involucrine, hemoglobin gamma g, interferon gamma-inducible protein 16,<br />
S100 calcium binding protein A8).<br />
23
Proovid pipeteeriti 384-augulisele plaadile kolmes korduses 10 μl kaupa.<br />
Programm:<br />
50°C 2 minutit<br />
95°C 10 minutit<br />
95°C 15 sekundit<br />
40 tsüklit<br />
60°C 1 minut<br />
95°C 15 sekundit<br />
dissotsiatsioonifaas<br />
60°C 15 sekundit<br />
95°C 15 sekundit<br />
Saadud tulemusi analüüsiti programmiga SDS 2.2.2 ja kasutades võrdlevat C t meetodilt<br />
(Applied Biosystems). Uuritavate geenide mRNA hulk määrati (involukriini näitel) võrdleval<br />
C t meetodil koduhoidjageeni HPRT mRNA suhtes, kasutades valemit 2 ΔΔCt = 2 (Ct -Ct )<br />
INV HPRT kontroll<br />
– (Ct -Ct )<br />
INV HPRT katse, kus C t on tsüklite arv, millest alates tekib spetsiifiline signaal, ”katse”<br />
tähendab uuritavat cDNA proovi ja ”kontroll” tähistab cDNA proovi, mille suhtes uuritavat<br />
mRNA hulka mõõdetakse.<br />
Ekspressioonianalüüsiks kasutati järgnevaid praimereid:<br />
HPRTexon6: 5’ – GACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG – 3’<br />
HPRTexon7: 5’ – AGTCTGGCTTATATCCAACACTTCG – 3’<br />
hINV FOR: 5’ – GCCTTACTGTGAGTCTGGTTGACA – 3’<br />
hINV REV: 5’ – GGAGGAACAGTCTTGAGGAGCT – 3’<br />
S100A8 FOR: 5’ – CTCAGTATATCAGGAAAAAGGGTGCAGAC – 3’<br />
S100A8 REV: 5’ – CACGCCCATCTTTATCACCAGAATGAG – 3’<br />
hHBG2_exp_F: 5’ – CATAAAGCACCTGGATGATCTC – 3’<br />
hHBG2_exp_R: 5’ – CAGGAGCTTGAAGTTCTCAG – 3’<br />
hIFI16_exp_F: 5’ – CTGTGAGGAAGGAGATAAACTG – 3’<br />
hIFI16_exp_R: 5’ – TCTTGATGACCTTGATGTGAC – 3’<br />
2.2.11 Kiire ja kvantiseeritav kromatiini immunosadestamine (KrIS)<br />
Rakkudelt eemaldati sööde ja PBSiga pesu järel rakud trüpsiinitati ning valkude ja<br />
DNA-vaheliste ristsidemete tekitamiseks lisati formaldehüüdi kuni 1% mahust 10 minuti järel<br />
lisati ristsidumise peatamiseks glütsiini (lõppkontsentratsioon 125 μM) ja inkubeeriti 5 min<br />
toatemperatuuril. Rakke pesti kaks korda PBSiga ja lüüsiti seejärel 540 μl toasooja<br />
lüüsipuhvriga (50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS, proteaaside inhibiitorite<br />
kokteil (1μl/ml)(Sigma-Aldrich)) viie minuti jooksul jääl. 500-1000 aluspaari pikkuste DNA<br />
lõikude saamiseks sonikeeriti kromatiini Diagenode Bioruptor sonikaatoris 10 minutit jääl.<br />
Sonikeerimise järel fuugiti rake 10 min 8000 rcf 4°C juures. Proovid villiti 60 μl kaupa laiali<br />
24
ning lisati 540 μl RIPA puhvrit (radioimmunoprecipitation assay buffer) (10 mM Tris-HCl,<br />
pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 140 mM NaCl), mis<br />
sisaldas ka 1ul/ml proteaaside inhibiitorite kokteili. Sellele segule lisati 15 μl eelnevalt<br />
100µg/ml BSA ja 500µg/ml salmon sperm DNAga blokeeritud G-proteiini sefarooskerasid<br />
(GE Healthcare), 1 μg sadestamiseks kasutatavat antikeha (Tabel 1) ja inkubeeriti üleöö 4°C<br />
juures. Järgmisel homikul pesti DNA-valk-antikeha-sefaroosikera-kompleksi RIPA puhvriga<br />
3x4 minutit pöörleval alusel toatemperatuuril. Seejärel üks kord TE-puhvriga (10 mM Tris-<br />
HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA) ning selle eemaldamise järel lisati keradele 150 μl<br />
elueerimispuhvrit (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1% SDS 50 μg/ml<br />
proteinaas K-d). Tuubid asetati Biosan TS-100 multivorteksile ning kerade küljes olev<br />
kompleks lõhuti järgneva 2 tunni jooksul 1300 rpm ja 68°C juures. Supernatant tõsteti uude<br />
tuubi ning kerasid töödeldi veel 5 minuti jooksul 150 μl elueerimispuhvriga. Saadud 300 μl-le<br />
eluaadile lisati 200 μl RIPA puhvrit ning 500 μl fenooli, kloroformi ja ismoüülalkoholi segu<br />
(suhtes 25:24:1). Segu hoiti vorteksil ~1 min ning seejärel fuugiti 13000 rcf 4°C juures. 460<br />
μl eluaati kanti üle uude tuubi koos sama mahu kloroformiga. Jällegi, segu fuugiti, ning<br />
seekord kanti 400 μl eluaati DNA sadestamiseks uude tuubi koos 1μl glükogeeni (Invitrogen),<br />
40 μl naatrium-atsetaadi ning 1 ml 96%-lise etanooliga. Segu fuugiti 20 minutit 16000 rcf 4°C<br />
juures ja sadenenud DNA-d pesti kaks korda 1 ml 70%-lise etanooliga. Alkohol eemaldati<br />
ning DNA lahustati 40 μl-s milliQ-s.<br />
Et teada saada, milliste piirkondadega uuritavad valgud seondusid, viidi läbi Q-RT PCR<br />
analüüs, mille põhimõtet on selgitatud geeniekspressiooni analüüsi kirjelduses.<br />
Kasutatud praimerid:<br />
GAPDHch2 FOR: 5’ – TGC CCT CCC CAT TCC GTC T – 3’<br />
GAPDHch2 REV: 5’ – AGG CCC CCA GCT ACA GAA AGG – 3’<br />
chSA8_2 FOR: 5’ – GGC CTG ACC ACC AAT GCA GGG – 3’<br />
chSA8_2 REV: 5’ – CTG GGC TGC TGG CAT CCA CT – 3’<br />
chINV_prom FOR: 5’ – TGC TTA AGA TGC CTG TGG TG – 3'<br />
chINV_prom REV: 5’ – TGA AGG TGA TGG ACA GGT TTC – 3'<br />
HBG F: 5’ – TGAGAACTTCAAGCTCCTGG – 3’<br />
HBG2 R 5’ – GACAGGGCACTGGCCACTC – 3’<br />
Neist <strong>AIRE</strong> kontrollitavate geenide promootorite järjestusse kuuluvad koespetsiifiliste<br />
antigeenide praimerid chINV_prom – involukriini promootor, chS100A8_2 inimese S100A8<br />
ja HBG praimerid HBG promootorpiirkonnast. Kontrolliks valitud GAPDH (glyceraldehyde<br />
3-phosphate dehydrogenase) on glükolüüsis osalev ensüüm, mida ekspresseeritakse<br />
25
organismi paljudes kudedes ja HEK-rakkudes <strong>AIRE</strong> tema ekspressiooni ei kontrolli (Org jt,<br />
2008). GAPDH praimer on valitud geeni seest.<br />
Saadud tulemusi analüüsiti programmiga SDS 2.2.2 (Applied Biosystems), sarnaselt<br />
geeniekspressiooni analüüsiga.<br />
Tabel 1. Immunosadestamiseks kasutatud antikehad<br />
Antikeha Liik Mono/polüklonaalne Päritolu Katalooginumber<br />
IgG Jänes polüklonaalne Santa Cruz Biot. sc-2027<br />
α<strong>AIRE</strong> 6.1 Hiir Monoklonaalne Heino jt, 1999 -<br />
αHistoon H3 Jänes Polüklonaalne Abcam ab1791<br />
αH3K4me4 Jänes Polüklonaalne Abcam ab8580<br />
αCTD Ser2P Jänes Polüklonaalne Abcam ab5095<br />
αCTD Ser5P Jänes Polüklonaalne Abcam ab5131-50<br />
αH2A.X Jänes Polüklonaalne Abcam ab10475<br />
26
2.3 Tulemused<br />
2.3.1 Kloneerimine indutseeritava <strong>AIRE</strong> ekspressiooniga rakuliini<br />
valmistamiseks<br />
Doksütsükliiniga indutseeritava <strong>AIRE</strong>t ekspresseeriva rakuliini valmistamises oli<br />
esimeseks sammuks <strong>AIRE</strong>-cDNA järjestuse amplifitseerimine <strong>AIRE</strong>-GST-plasmiidilt. PCRi<br />
produkte töödeldi EcoRI ja HindIII restriktaasidega (vastavalt 5’ ja 3’otstes) ja puhastatud<br />
fragmentide pikkust kontrolliti 1% TAE geeliga elektroforeesil. Joonisel 5 on <strong>AIRE</strong>-GST<br />
kõrval (rida 1) PCRga amplifitseeritud, seejärel lõigatud ning puhastatud produkt, mis vastab<br />
oma geelis liikumisel <strong>AIRE</strong>-cDNA pikkusele (1645 aluspaari). Samu ensüüme kasutati ka<br />
pTRE-Tight plasmiidi lõikamiseks.<br />
Joonis 5. Restrikteeritud ja puhastatud PCRi produktide kontroll. Real 1 on töötlemata <strong>AIRE</strong>-GSTrõngasplasmiid,<br />
real 2 samast plasmiidist välja lõigatud <strong>AIRE</strong>-cDNA (1645 ap). Markerina kasutati 100 bp DNA<br />
Ladder (Solis Biodyne)<br />
Järgnevalt ligeeriti <strong>AIRE</strong>-cDNA ning pTRE-Tight-plasmiid ning saadud plasmiid<br />
pTRE-<strong>AIRE</strong> transformeeriti E. coli Nova Xg tüve rakke. Piisava tiheduse saavutanud rakud<br />
lüüsiti ning neist eraldati Invisorb Spin Plasmid Mini Two-kitti (Invisorb) kasutades pTRE-<br />
<strong>AIRE</strong> plasmiid. Kõigi kolooniatest eraldatud plasmiididega viidi läbi restriktsioonianalüüs ja<br />
nende õigsust kontrolliti kaudselt agaroos-geelelektroforeesiga. Selleks kasutati jällegi<br />
HindIII ja EcoRI restriktaase, millega lõigati pTRE-<strong>AIRE</strong>-plasmiidist välja <strong>AIRE</strong>t kodeeriv<br />
cDNA. Nagu on näidatud joonisel 6, oli viieteistkümnest kolooniast neljateistkümnes tegu<br />
õige pikkusega inserdiga. Ainsa koloonia puhul, millest <strong>AIRE</strong> cDNA inserti ei detekteeritud<br />
(rida 4), on tõenäoliselt tegu tühja pTRE-Tight-vektoriga.<br />
27
Joonis 6. Restriktsioonianalüüs viieteistkümnest (read 1–15 E. coli Nova Xg tüve kolooniast eraldatud<br />
plasmiididele. Restriktsioon viidi läbi ensüümidega EcoRI ja HindIII, mis eraldasid teineteisest pTRE-<strong>AIRE</strong>plasmiidi<br />
(~4,2 kb) kuuluvad pTRE-Tight-plasmiidi (~2,6kb) ja <strong>AIRE</strong> cDNA (~1,65kb). Eraldi on välja toodud<br />
real 4 asuv tühi pTRE-Tight-plasmiid (–) ning kaks sekveneeritud plasmiidi. Real 2 olevas plasmiidis (*)<br />
tuvastati <strong>AIRE</strong>-geenis mutatsioonid, kuid real 12 (+) ei esinenud sekveneerimise andmetel ühtegi mutatsiooni.<br />
Markerina (M) kasutati 1kb DNA Ladder (Solis Biodyne) (rida 16)<br />
Kuigi restriktsioonianalüüsi põhjal võis öelda, et kõigil juhtudel (va rida 4) olid <strong>AIRE</strong>cDNA<br />
ja pTRE-plasmiid ligeerunud, tuli selleks, et vältida võimalike mutatsioonide esinemist<br />
plasmiidis, saadud järjestused ka sekveneerida. Kahest Tartu Ülikooli Molekulaar- ja<br />
Rakubioloogia instituudis kontrollitud järjestusest esimesel (joonis 6, rida 2) olid<br />
sekveneerimise andmetel tekkinud pTRE-plasmiidi ligeeritud <strong>AIRE</strong>-cDNA alguses mõningad<br />
mittesünonüümsed asendused ning seda plasmiidi <strong>AIRE</strong> funktsioonide uurimiseks kasutada ei<br />
saanud. Teise plasmiidi (joonis 6 rida 12) <strong>AIRE</strong>-cDNA järjestus kattus sekventsi põhjal<br />
referentsjärjestusega 100-protsendiliselt ning ka kahe plasmiidi liitumispiirkonnast ei leitud<br />
ühtegi asendust (joonis 7).<br />
Joonis 7. Ära on märgitud EcoRI lõikesait GAAT (ovaal) ning nii pTRE-<strong>AIRE</strong>12-V80L_R praimeriga<br />
kontrollitud pTRE-<strong>AIRE</strong> plasmiidi (rida 1) kui ka <strong>AIRE</strong>-referentsjärjestuse (rida 2) startkoodon ATG (ristkülik).<br />
Real 3 on näidatud pTRE-Tight plasmiidi järjestus. Real 4 on kloneerimiseks kasutatud praimeri järjestus.<br />
28
2.3.2 Tet-on Advanced-liini <strong>valmistamine</strong>, <strong>AIRE</strong> ekspressiooni ja<br />
lokalisatsiooni kontroll<br />
Saadud plasmiidiga võis alustada doksütskliiniga indutseerimisel <strong>AIRE</strong>t ekspresseeriva<br />
rakuliini valmistamist (joonis 8). Tet-On Advanced-rakuliini (Clontech) kotransfekteeriti<br />
pTRE-<strong>AIRE</strong>-konstrukti ning hügromütsiini resistentsusgeeni sisaldava pTK-Hyg-plasmiidiga<br />
(omavahelises suhtes 10:1). 48 tunni pärast lisati söötmesse selektiivset antibiootikumi<br />
hügromütsiin B (75 μg/ml). Rakke kasvatati kaks nädalat ning sel ajal edukalt paljunenud<br />
kolooniad külvati igaüks eraldi kambrisse 96-kambrilisel alusel. Hiljem külvati piisava<br />
tiheduse saavutanud kolooniad edasi 24- ning seejärel 6-kambrilistele alustele.<br />
Joonis 8. Käesolevas töös kasutatava <strong>AIRE</strong>t ekspresseeriva indutseeritava rakuliini tegemise etapid Tet-On<br />
Advanced (Clontech) rakuliini põhjal (muudatustega, www.clontech.com).<br />
Kuigi kõik paljunevad rakud olid arvatavalt omandanud pTK-HYG-plasmiidi, oli vaja<br />
kindlaks teha ka kolooniad, mis olid resistentsusmarkeri kõrval ka pTRE-<strong>AIRE</strong>-plasmiidi<br />
edukalt oma kromatiini sisestanud. Selleks indutseeriti kõiki kolooniaid varem transientse<br />
transfektsiooniga kindlaks määratud optimaalse doksütsükliini kogusega (1ug/ml) (joonis 9 A<br />
ja B) ning <strong>AIRE</strong>-valgu olemasolu kontrolliks viidi kõigi kolooniatega läbi Western Blotanalüüs<br />
(WB). <strong>AIRE</strong> detekteerimiseks selles katses kasutati hiire monoklonaalset antikeha<br />
<strong>AIRE</strong> 6.1.<br />
29
Joonis 9. Paneelil A on kujutatud <strong>AIRE</strong> ekspressiooni analüüs sõltuvalt doksütsükliini doosist enne püsiliini<br />
valmistamist. B-paneel on sama analüüsi graafiline esitus. Kasutatud on erinevaid doksütsükliini doose (Dox<br />
ug/ml) pTRE-<strong>AIRE</strong> ning YFP transientsel transfektsioonil Tet-On Advanced-liini. Paneelidel C ja D on WBanalüüs<br />
hügromütsiinile resistentsete kolooniate analüüs <strong>AIRE</strong> olemasolu kindlakstegemiseks antud liinides.<br />
Doksütsükliiniga indutseeritud proov on +, indutseerimata -. Paneelil C on ära toodud kloonid 4.5–4.7, milledest<br />
esimene <strong>AIRE</strong>t ei ekspresseeri ning kahe viimase puhul on ekspressioon tugev. 4.7(*)valisime hiljem ka edasiste<br />
eksperimentide jaoks. Paneelil D on näha „lekkiva promootoriga“ liinid, mis ekspresseerivad <strong>AIRE</strong>t ka<br />
indutseerimata rakkudes. Kontrollina (K) kasutati <strong>AIRE</strong>5 püsiliini (Org jt, 2009). Detekteerimiseks kasutati<br />
<strong>AIRE</strong> 6.1 antikeha. Kvantiseerimiseks kasutati Image Quant RT-ECL (GE Healthcare) masinat.<br />
WB katsetest selgus, et paljud ellujäänud kolooniad <strong>AIRE</strong>t ei ekspresseeri ning on seega<br />
tõenäoliselt integreerinud ainult hügromütsiini resistentsusgeeni sisaldava markeri või<br />
omandanud resistentsuse mingil muul põhjusel. <strong>AIRE</strong>t stabiilselt ja üldse mitte<br />
ekspresseerivate kloonide kõrval leidus ka liine, millel esines „lekkiv promootor“, mille puhul<br />
on plasmiidi kromatiini inkorporeerimisel tõenäoliselt tekkinud ka ilma doksütsükliinita<br />
transkriptsiooni võimaldavaid mutatsioone (joonis 9 D).<br />
WB analüüside põhjal valitud liinides hinnati <strong>AIRE</strong> rakusisest lokatsiooni<br />
immunofluorestsentsiga (IF). Kõigis liinides, mis WB põhjal <strong>AIRE</strong>t ekspresseerisid, oli valk<br />
ka IFga tuvastatav. Kui induktsioonist 8 tunni möödudes oli <strong>AIRE</strong> tuvastatav umbes pooltes<br />
rakkudes, siis 24 tunni möödudes oli ekspressioon nähtav kõigis indutseeritud rakkudes ning<br />
<strong>AIRE</strong> rakusisene lokalisatsioon vastas varemkirjeldatule (Rinderle jt, 1999). Üheski<br />
kontrollina kasutatud sama liini indutseerimata koloonias <strong>AIRE</strong>t ei tuvastatud. Käesolevas<br />
töös kasutati edasiste eksperimentide tarvis ühte kuuest <strong>AIRE</strong>t stabiilselt ekspresseerivast<br />
liinist 4.7 (joonis 10).<br />
30
Joonis 10. <strong>AIRE</strong> ekspressiooni ja lokalisatsiooni kontroll IFga. <strong>AIRE</strong> ekspressioon ei ole 4.7 rakuliini<br />
doksütsükliiniga indutseerimata (Dox-) rakkudes IFga tuvastatav. Indutseeritud rakkudes (Dox+) on <strong>AIRE</strong><br />
ekspressioon aga ühtlane ja tugev esinedes nii tsütoplasmaatiliste fibrillide kui ka tuumakehakestena. <strong>AIRE</strong><br />
detekteerimiseks kasutati <strong>AIRE</strong> 6.1 ja visualiseerimiseks fluorestseeruva värviga konjugeeritud antikeha ning<br />
rakutuumade visualiseerimiseks DNAga seonduvat fluorestseeruvat värvi DAPI.<br />
2.3.3 <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide ekspressiooni analüüs indutseeritava<br />
<strong>AIRE</strong>ga püsiliinis<br />
Hindamaks valitud liinis ekspresseeritava <strong>AIRE</strong> transaktiveerivaid omadusi, viidi läbi<br />
<strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide geeniekspressiooni analüüs. Ekspressiooni aktivatsiooni analüüsi<br />
jaoks sünteesiti 4.7 liini rakkudest eraldatud RNA baasil cDNA ning <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide<br />
ekspressioonitaset võrreldi indutseeritud (doksütsükliini 1 μg/ml) ja indutseerimata rakkudes.<br />
<strong>AIRE</strong>-reguleeritavate geenide ekspressioonitaset kontrolliti vahemikus 0– 72 tundi peale<br />
induktsiooni. Negatiivse kontrollina kasutati doksütsükliiniga indutseerimata rakke 0-<br />
ajapunktist ning indutseerimisest 72 tunni möödudes lüüsitud rakkudest (neg).<br />
Sihtmärkgeenide ekspressiooni tasemed normaliseeriti <strong>AIRE</strong> poolt mittereguleeritava geeni<br />
HPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) suhtes.<br />
31
Joonis 11. <strong>AIRE</strong>-indutseeritav ekspressioon erineb populatsioonide kaupa. Joonisel on ära toodud <strong>AIRE</strong> poolt<br />
aktiveeritavate geenide ekspressioonid kahe ühel ajal ja ühesugustes tingimustes kasvatatud indutseeritava 4.7-<br />
liini populatsioonis. <strong>AIRE</strong> püsiliinis aktiveeritavatest geenidest aktiveeritakse doksütsükliiniga indutseeritavas<br />
4.7-liinis involukriini (INV), S100A8 ja HBGd, kuid mitte IFI 16st. Aktiveeritavate geenide ekspressioonid<br />
erinevad ka populatsiooniti. Näiteks involukriini ekspressioonitaseme vahe on kahes populatsioonis ligi kuus<br />
korda. Kõik ekspressioonitasemed on normaliseeritud HPRT mRNA koguse suhtes. Negatiivse kontrollina (neg)<br />
kasutati 4.7 liini indutseerimata rakke 72 tunni ajapunktist<br />
Joonisel 11 on kujutatud kahte paralleelselt tehtud katset, kus mõlemas on vaadeldud<br />
<strong>AIRE</strong> mõju neljale teadaolevale sihtmärkgeenile HEK293 <strong>AIRE</strong> püsiliinis: involukriin (INV),<br />
S100A8, IFI16 (interferon gamma-inducible protein 16) ja HBG2 (Org jt, 2009). S100A8,<br />
HBG2 ja INV geenide ekspressiooni aktiveerib <strong>AIRE</strong> 4.7 liinis võrreldes indutseerimata<br />
rakkudega kuni 500 korda, mis on selgeks märgiks <strong>AIRE</strong> transaktiveerivast toimest antud<br />
liinis, samas IFI16 ekspressiooni tase jääb enam-vähem samaks (maksimaalne erinevus ~2x<br />
72h ajapunktis mõlema katse puhul). Katsest johtub ka see, et sama liini homogeensete<br />
rakupopulatsioonide vahel võib esineda erinevusi <strong>AIRE</strong> poolt aktiveeritavate samade geenide<br />
ekspressioonitasemes.<br />
Paralleelselt tehti kõrvale ka WB, milles jälgiti <strong>AIRE</strong>-valgu teket ajas. WBs kasutatud<br />
PVDF-filter lõigati pooleks 40 kDa märgise juures, kõrgema molekulmassiga <strong>AIRE</strong> (~55kDa)<br />
detekteerimiseks kasutati hiire monoklonaalset <strong>AIRE</strong> 6.1-antikeha ning madalama massiga<br />
GAPDH (~36 kDa) detekteerimiseks kasutati hiire monoklonaalset GAPDH-vastast antikeha<br />
(Abcam). GAPDH-d, kui kõigis rakkudes ekspresseeritavat valku, kasutati rakkude<br />
juurdekasvust tuleneva <strong>AIRE</strong>-valgu koguse normaliseerimiseks. Jooniselt 12 on näha, et<br />
<strong>AIRE</strong> on selle meetodiga detekteeritav juba tund aega peale induktsiooni ning kõrvutades WB<br />
pilti geeniekspressiooni analüüsiga selgub, et <strong>AIRE</strong>-valgu koguse kasvades ajas tõuseb ka<br />
<strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide ekspressioon (vt joonis 11).<br />
32
Joonis 12. Aire on WBga detekteeritav juba tund peale induktsiooni doksütsükliiniga. Detekteerimiseks kasutati<br />
GAPDH-vastast ning <strong>AIRE</strong> 6.1 antikehi. Kontrollina (K) kasutati <strong>AIRE</strong> 5 püsiliini rakuekstrakti (Org jt, 2009)<br />
2.3.4 Kromatiini immunosadestamine <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide<br />
promootoritel toimuvate muudatuste detekteerimiseks<br />
Selleks, et uurida <strong>AIRE</strong> seondumist tema aktiveeritavate geenide promootoritele ning<br />
sellest tulenevaid transkriptsiooni käigus toimuvaid muutusi neid piirkondades, kasutati<br />
kromatiini immunosadestamise (KrIS) modifitseeritud Q 2 ChIP ehk Quick and Quantitative<br />
Chromatin Immunoprecipitation-protokolli (www.collaslab.com). Selle meetodi eelisteks<br />
traditsioonilise KrISi ees on esiteks suuresti vähenenud ajakulu ning analüüsiks kulub<br />
oluliselt vähem rakke.<br />
Kõigis ajapunktides kasutati immunosadestamiste jaoks ~3x10 5 rakku. Eri katsetes<br />
kasutati sadestamiseks üldist G-immunoglobuliini (IgG), histoon H3 (H3), trimetüleeritud<br />
histoon H3 neljandas positsioonis oleva lüsiini- (H3K4me3), <strong>AIRE</strong>-, ning polII CTD<br />
fosforüleeritud seriin 2- (Ser2P) ja seriin 5- (Ser5P) spetsiifilist antikeha (Tabel 1, materjalid<br />
ja meetodid), kõiki koguses 1µg. Immunosadestatud kompleksist puhastati välja DNA,<br />
millega viidi läbi Q-RT PCR. Uuriti samade geenide promootorijärjestusi, mida vaadati ka<br />
geeniekspressioonis, välja jäeti vaid IFI16. Kontrolliks võeti praimer <strong>AIRE</strong> poolt<br />
mittereguleeritava geeni GAPDH järjestusest. Kõik andmed on esitatud ajapunktide kaupa ja<br />
iga geeni puhul on näidatud tema promootoril detekteeritud konkreetse valgu hulga suhe<br />
GAPDH promootoril olevasse sama valgu kogusesse. Punktides, mille puhul on kõigis<br />
geenide andmetes toimunud järsk langemine, on DNA puhastamise käigus osa materjali<br />
kaotsi läinud. Negatiivse kontrollina (neg) on kasutatud indutseerimata rakke 72h ajapunktist.<br />
Tegemist on esialgsete tulemustega, mille kontrolliks tuleb kindlasti läbi viia korduskatseid.<br />
33
Joonis 13. Vasakul on kujutatud tausta kontrollimiseks mõeldud immunosadestamine jänese polüklonaalse<br />
üldise IgG-ga, paremal on histoon H3 esinemine uuritavate geenide promootoritel. H3 hulk <strong>AIRE</strong> poolt<br />
aktiveeritavate geenide INV, S100A8 ja HBG promootoritel on umbkaudu sama, mis GAPDH-l. Negatiivse<br />
kontrollina (neg) kasutati 4.7 liini indutseerimata rakke 72 tunni ajapunktist<br />
Joonis 14. Trimetüleeritud histoon H3 neljandas positsioonis oleva lüsiini (vasakul) ja <strong>AIRE</strong> (paremal)<br />
esinemine <strong>AIRE</strong> poolt aktiveeritavate geenide promootoritel. Transkribeeritava kromatiini tunnuseks oleva<br />
H3K4me3 tase tõuseb induktsiooni järel, olenevalt geenist, 0,1%-lt GAPDH promootoril olevast 0,7%-ni. Samal<br />
ajal tõuseb <strong>AIRE</strong>-valgu koguse kasvades ka valgu hulk tema sihtmärkgeenide promootoritel. Negatiivse<br />
kontrollina (neg) kasutati 4.7 liini indutseerimata rakke 72 tunni ajapunktist<br />
Varasemast on teada, et <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenidel on madal H3K4me3 tase (Org jt, 2009).<br />
Ka siinsed tulemused näitavad, et võrreldes aktiivselt transkribeeritava GAPDHga, esineb<br />
kõigi väljatoodud geenide promootoritel H3K4me3 ligi kolme suurusjärgu võrra vähem. Kui<br />
välja arvata kolm punkti (HBG 12 ja 48h ning INV 48 h), siis indutseerimata kontrollproovid<br />
(72 h- ja 0h) näitavad kõigi geenide puhul madalamat taset kui punktides, mille puhul on<br />
sihtmärkgeenide ekspressioon käivitatud (vt joonis 11). Kromatiini immunosadestamisega<br />
uuriti ka <strong>AIRE</strong>-valgu seondumist tema poolt aktiveeritavate geenide promootoritele.<br />
Võrdlusest GAPDH promootoriga selgub (joonis 14), on <strong>AIRE</strong>-valk involukriini ja S100A8<br />
promootoritel detekteeritav juba 1 tunni pärast.<br />
Paljudes kudedes mitteaktiivsete, kuid indutseeritavate geenide promootoritel on leitud<br />
„ootele“ sunnitud initsieerivat polII-e (Hager jt, 2009), mille tunnuseks on tema C-terminuse<br />
heptapeptiidse korduse (YSPTSPS) viiendas positsioonis asuv fosforüülitud seriin (Ser5P).<br />
34
Ka umbes neljandiku <strong>AIRE</strong> poolt aktiveeritavate geenide promootoritel on näidatud polII<br />
olemasolu (Org jt, 2009; Oven jt, 2007), kuid ainult üldiste RNA polümeraasi antikehadega.<br />
Tuvastamaks polII initsieeriva ja ka elongeeriva vormi esinemist (vastavalt Ser5P ja<br />
Ser2P) ja koguste muutumist <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide promootoritel viidi samuti läbi KrIS<br />
(joonis 15). Ajapunktis 0 on <strong>AIRE</strong> poolt indutseeritavate geenide promootoritel olevate polII<br />
vormide hulk vaid poole kuni viiendiku võrra madalam kui aktiivselt transkribeeritava<br />
GAPDH promootoril. Edaspidi, geenide ekspressiooni aktiveerudes aga polII Ser5P tase<br />
promootoritel, võrreldes 0-seisuga, langeb. Veidral kombel toimub Ser2P taseme kõikumine<br />
suures osas sama mustri järgi. Kontrolliks oleks neile katsetele tarvis kõrvale teha ka katse<br />
polII üldise antikehaga. Juhul, kui üldise polII tase liiguks sarnaselt tema initsieeriva ja<br />
elongeeriva vormiga, oleks võib-olla võimalik teha järeldusi RNA polümeraasi eri vormide<br />
esinemise kohta <strong>AIRE</strong> poolt aktiveeritavate geenide promootoritel.<br />
Joonis 15. Initsieeriva (Ser5P) ja elongeeriva (Ser2P) polII dünaamika promootritel. Negatiivse kontrollina (neg)<br />
kasutati 4.7 liini indutseerimata rakke 72 tunni ajapunktist<br />
Abramson jt (2010) leidsid <strong>AIRE</strong> interaktsioonipartnereid uurides, et üheks<br />
potentsiaalseks kompleksiks, kus <strong>AIRE</strong> osaleda võib, on kompleks, mis osaleb<br />
transkriptsiooni initsiatsioonil DNAsse kaheahelaliste lõigete tegemises ja ka otste<br />
kokkuligeerimises. Teiste hulgas leiti kompleksist histooni H2A kaheahelaliste lõigete<br />
lähedusse paigutatav variant H2A.X. Käesolevas töös H2A.Xi paigutumist <strong>AIRE</strong>indutseeritavate<br />
geenide promootoritele aga ei tuvastatud. Väga suure tõenäosusega on antud<br />
valgu puhul põhjuseks antikeha, mis ei sobi kromatiini immunosadestamiseks.<br />
35
2.4 Arutelu<br />
Juba enam kui kümmekond aastat on erinevate meetoditega ning aina suurenevas mahus<br />
uuritud, kuidas <strong>AIRE</strong> reguleerib T-rakkude negatiivse selektsiooni käigus oma<br />
sihtmärkgeenide ekspressiooni. Et aidata seda seni lahendamata mehhanismi paremini mõista,<br />
loodi meie laboris Tet-On Advanced rakuliini (Clontech) baasil <strong>AIRE</strong>t vaid doksütsükliini<br />
juuresolekul ekspresseeriv rakuliin. Antud töö eksperimentaalne osa ongi peamiselt ülevaade<br />
selle rakuliini loomisprotsessist ja verifitseerimisest. Vajadus sellise liini järele tuleneb<br />
peamiselt <strong>AIRE</strong>t endogeenselt ekspresseeriva bioloogilise materjali piiratud kättesaadavusest<br />
ning <strong>AIRE</strong>t ekspresseerivate liinide vähesusest. Doksütsükliiniga indutseeritava<br />
ekspressioonisüsteemi üheks eeliseks teiste püsiliinide ees on see, et (antud liini puhul) on<br />
<strong>AIRE</strong> ekspressioon induktsiooni järel kiire, tugev ja IFi põhjal ühtlane, esinedes 24 tunni<br />
möödumise järel kõigis rakkudes. Lisaks kaob negatiivse kontrolli jaoks ära vajadus kasutada<br />
kontrollplasmiidi või kõrvuti kahte eri liini – samast kloonist pärit rakud sobivad<br />
eksperimendis nii katse enda jaoks (indutseeritud) kui ka negatiivseks kontrolliks<br />
(indutseerimata). Samuti võimaldab selline süsteem uurida <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide<br />
ekspressiooni ja geenide promootoritel toimuvaid muudatusi täpselt kontrollitaval ajalisel<br />
skaalal. Üks indutseeritava <strong>AIRE</strong>ga liini eeliseks püsiliinide ees tuleneb <strong>AIRE</strong>-valgu<br />
eripärast. Nimelt on <strong>AIRE</strong>t ekspresseerivate mTECide eluiga ~2 nädalat (Gray jt, 2007) ning<br />
<strong>AIRE</strong>- ekspressiooniga kaasnevat apoptoosi on näidatud ka erinevates rakuliinides (Liiv jt,<br />
avaldamata andmed).<br />
Rakuliini valmistamiseks tuli esmalt <strong>AIRE</strong>-GST plasmiidist pärinev <strong>AIRE</strong>-cDNA<br />
kloneerida doksütsükliinile reageeriva plasmiidi pTRE-Tight koosseisu. Mõlemaid plasmiide<br />
töödeldi EcoRI ja HindIII restriktaasidega ning seejärel ligeeriti puhastatud lineaarsed lõigud<br />
ning saadud pTRE-<strong>AIRE</strong> transformeeriti E.colisse. Paljundatud plasmiidi kontrolliti nii<br />
agaroos-geelelektroforeesi kui ka järjestuse sekveneerimisega. Mutatsioonideta plasmiid<br />
kotransfekteeriti hügromütsiini resistentsusgeeni sisaldava pTK-Hyg-plasmiidiga Tet-On<br />
Advanced-liini rakkudesse. Paljunevaid ja hügromütsiinile resistentseid kloone kontrolliti<br />
<strong>AIRE</strong> ekspressiooni suhtes Western Bloti ja immunofluorestsentsi katsetega. Suures osas<br />
jagunesid liinid doksütsükliiniga indutseerimisel <strong>AIRE</strong>t ekspresseerivateks ning<br />
mitteekspresseerivateks. <strong>AIRE</strong>t ekspresseerivad liinid aga jagunesid kolmeks: <strong>AIRE</strong>t<br />
indutseerimise järel kõrgemal ning madalamal tasemel ekspresseerivateks liinideks ning<br />
samuti leidus liine, mis ekspresseerisid <strong>AIRE</strong>t nii doksütsükliini toitelahuses esinemise kui ka<br />
puudumise korral. Selliste „lekkiva promootoriga“ liinide puhul võib oletada, et plasmiidi<br />
kromatiini inkorporeerumisel tekkisid selle plasmiidi doksütsükliinile reageerivas<br />
36
Ekspressiooni tase võrreldes HPRTga<br />
promootoris mutatsioonid, mis muutsid konkreetse liini mitte enam ainult indutseerimisel,<br />
vaid pidevalt <strong>AIRE</strong>t ekspresseerivaks liiniks. Kuna käesoleva töö eesmärgiks oli tekitada<br />
süsteem, kus oleks võimalik samas kloonis hinnata <strong>AIRE</strong> mõju rangelt +/- olukorras, siis tuli<br />
need liinid koos <strong>AIRE</strong>t mitteekspresseerivate liinidega kõrvale jätta.<br />
<strong>AIRE</strong>t ekspresseerivates liinides esinevat liinidevahelise ekspressiooni kõikumist<br />
selgitab ühelt poolt asjaolu, et kuigi on teada, et antud klooni genoomi on inserteerunud<br />
pTRE-<strong>AIRE</strong> plasmiid, siis seda, mitu koopiat ühe klooni kohta inserteerus, on tagantjärele<br />
väga keeruline kindlaks teha. Samuti võis rolli mängida plasmiidi mittespetsiifiline<br />
inserteerumine: piirkond, mis sobis kloonis inserteerumise jaoks, ei pruukinud hiljem<br />
transkriptsiooni läbiviivatele valgukompleksidele kõrge ekspressiooni tagamiseks piisavalt<br />
kättesaadav olla. Paralleelselt läbiviidud immunofluorestsentsi katsete tulemused olid WB<br />
katsetega kooskõlas: <strong>AIRE</strong> ekspressiooni ei tuvastatud üheski WB põhjal <strong>AIRE</strong>t<br />
mitteekspresseerivas liinis ega ka üheski <strong>AIRE</strong>t ekspresseeriva liini indutseerimata kontrollis.<br />
Juba valmis, stabiilselt transfekteeritud <strong>AIRE</strong> 4.7-liinist pärineva rakulüsaadist<br />
eraldatud totaalse RNA põhjal läbiviidud geeniekspressiooni aktivatsioonikatse tulemusel<br />
leiti, et kuigi loodud rakuliin <strong>AIRE</strong> 4.7 on stabiilselt transfekteeritud, aktiveerib <strong>AIRE</strong> antud<br />
liinis siiski pigem neid geene, mida transientselt transfekteeritud liinis. INV, HBG ja S100A8<br />
geene aktiveerib <strong>AIRE</strong> nii transientselt kui ka stabiilselt <strong>AIRE</strong>t ekpresseerivates HEKrakuliinil<br />
põhinevates süsteemides, kuid IFI16 geeni <strong>AIRE</strong>-poolset transkriptsiooni<br />
aktiveerimist on näidatud ainult pidevalt <strong>AIRE</strong>t ekspresseerivas HEK-liinis (Org jt, 2009).<br />
Sellest johtuvalt ei ole põhjust imestada, miks <strong>AIRE</strong> 4.7-liinis IFI16 ekspressiooni tase<br />
doksütsükliiniga indutseerides ei muutunud. Väikese ekspressiooni muutuse tõenäoseks<br />
põhjuseks 4.7-liinis võib olla IFI16 juba eelnevalt kõrge ekspressioonitase. Kui võrrelda<br />
uuritud geenide ekspressioonitasemeid HPRTga siis IFI16 ekspressioon on 4.7-liinis 0-<br />
ajapunktis 3-5 suurusjärku kõrgem kui teistel uuritud geenidel ning 48 tunni järel, erinevalt<br />
teistest geenidest, IFI16 ekspressioonitase suurt ei muutu (joonis 16).<br />
1,0E+00<br />
1,0E-01<br />
1,0E-02<br />
1,0E-03<br />
1,0E-04<br />
1,0E-05<br />
1,0E-06<br />
1,0E-07<br />
IFI16 INV S100A8 HBG<br />
0h 4,62E-02 8,57E-07 5,32E-05 3,51E-05<br />
48h Dox+ 5,54E-02 9,44E-05 1,30E-02 7,04E-03<br />
Joonis 16. <strong>AIRE</strong> oletatavate<br />
sihtmärkgeenide ekspressioonitase<br />
võrreldes HPRT ekspressioonitasemega.<br />
Kasutatud on joonisel 11 parempoolsel<br />
paneelil näidatud andmeid. Ära on<br />
toodud kahe ajapunkti andmed 0h ning<br />
doksütsükliiniga indutseeritud proov<br />
INV, S100A8 ja HBG kõrgeima<br />
ekspressiooniga ajapunktist 48 tundi (48h<br />
Dox+). Andmed on normaliseeritud<br />
HPRT vastavate ajapunktide suhtes<br />
37
Põhjuseks, miks ei olnud võimalik erinevate eksperimentide tulemusi keskmistada<br />
seisneb selles, et <strong>AIRE</strong> poolt aktiveeritavate geenide ekspressioonitase kõikus eri<br />
eksperimentides mitmekordselt. Need tulemused võiksid kokku sobida varem avaldatud ühe<br />
raku PCRi tulemustega, mille põhjal erineb aktiveeritavate geenide tase ning ampluaa juba<br />
ühe tüümuse erinevates medulla epiteeli rakkudes, rääkimata erinevatest tüümustest<br />
(Derbinski jt, 2008; Venanzi jt, 2008). Hoolimata katsetevahelisest kõikumisest näib samadest<br />
rakupopulatsioonidest paralleelselt tehtud Western Bloti analüüside järgi, et <strong>AIRE</strong>-valgu<br />
koguse suurenedes suureneb ka sihtmärkgeenide ekspressioon, hakates langema alles <strong>AIRE</strong>valgu<br />
taseme platoo saabumisel induktsioonist 48 tunni ajapunkti möödudes.<br />
Geeniekspressiooni aktivatsiooniga kaasnevad muudatused nii aktiveeritava geeni<br />
promootoril viibivate valkude koosluses kui ka koguses. Samuti toimuvad muudatused<br />
promootorite piirkonnas kromatiini epigeneetilistes märgetes. Üheks palju-uuritud<br />
epigeneetiliseks modifikatsiooniks, mida seostatakse aktiivselt transkribeeritavate geenide<br />
promootoritega, on histoon H3 neljandas positsioonis asuv trimetüleeritud lüsiin (H3K4me3).<br />
GAPDH kui aktiivselt transkribeeritava geeni promootoril on H3K4me3 tase kõrge ning ei<br />
muutu ajas olulisel määral. <strong>AIRE</strong> seondub in vitro katsete põhjal spetsiifiliselt metüleerimata<br />
H3K4ga (H3K4me0) (Koh jt, 2008; Org jt, 2008) ja sellele lüsiinile metüülrühmade lisamine<br />
takistab <strong>AIRE</strong> seondumist ehk <strong>AIRE</strong> kui mitteekspresseeritavate geenide aktivaator ei ole<br />
üldiselt võimeline muutma juba aktiivse kromatiini märgist kandvate geenide<br />
ekspressioonitaset. Seda võis näha ka geeniekspressioonianalüüsi katsest, kus <strong>AIRE</strong><br />
olemasolu rakus ei suutnud juba eelnevalt kõrgelt ekspresseeritava IFI 16 taset olulisel määral<br />
muuta. H3K4me3-spetsiifilise antikehaga läbiviidud kromatiini immunosadestamise katsest<br />
johtub, et H3K4me3 kahe- kuni kolmekordne tõus 24h järel induktsioonist on piisav selleks,<br />
et võimaldada geeniekspressiooni aktivatsiooni katsetes nähtud <strong>AIRE</strong> poolt reguleeritavate<br />
geenide 80-600-kordset ekspressiooni tõusu. Samas jääb <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenidel esineva<br />
H3K4me3 tase isegi uuritavate geenide ekspressiooni kõrgpunktis GAPDH geenil esinevale<br />
H3K4me3 tasemele alla kuni kolm suurusjärku ega ole ka piisavalt kõrge, et takistada <strong>AIRE</strong><br />
seondumist promootorile.<br />
Antud magistritöö käigus valminud rakuliini on tänu oma indutseeritavale <strong>AIRE</strong>ekspressioonile<br />
võimalik kasutada mitmete <strong>AIRE</strong>ga seotud küsimuste uurimiseks. Praegu on<br />
4.7- liin kasutuses <strong>AIRE</strong>-põhjustatatud apoptoosi uuringutes, samuti vajab põhjalikumat<br />
uurimist <strong>AIRE</strong> otseste interaktsioonipartnerite võrgustik, mille kasvõi osaline tuvastamine<br />
lubaks <strong>AIRE</strong> funktsioonide täpsustamist imetajate immuunsüsteemi kujunemisel.<br />
38
Kokkuvõte<br />
<strong>AIRE</strong> (autoimmuunsusregulaator) on immuunsüsteemi arengu ja normaalse<br />
funktsioneerimise vaatenurgast keskse tähtsusega transkriptsioonifaktor, mis reguleerib<br />
tüümuses tuhandete koespetsiifiliste geenide transkriptsiooni. Ainuüksi selles geenis esinevad<br />
mutatsioonid põhjustavad haigust nimega APECED (autoimmune polyendocrinopathy<br />
candidiasis ectodermal dystrophy). Hiire vastava haiguse mudeli põhjal võib oletada, et seda<br />
autoimmuunhaigust põdevatel inimestel esinevad tõsised puudujäägid tüümuses toimuvas T-<br />
rakkude negatiivses selektsioonis, mille käigus terves organismis hävitatakse oma keha valke<br />
võõrastena ära tundvad T-rakud. Seetõttu pääsevad APECEDi patsientidel tüümusest<br />
organismi laiali autoreaktiivsed, sageli just sisenõrenäärmete hormoone tootvaid rakke<br />
hävitavad T-rakud ning samuti suureneb patsientide vastuvõtlikkus Candida perekonna<br />
seentele.<br />
Olgugi et <strong>AIRE</strong>-vahendatavat transkriptsiooni aktivatsiooni on uuritud praeguseks enam<br />
kui kümmekond aastat, on selles vallas endiselt palju küsimärke. Peamiseks uurimist<br />
takistavaks põhjuseks on see, et <strong>AIRE</strong> interaktsioone teiste valkude ning DNAga peetakse<br />
lühiajalisteks ning nõrgaks. Samuti, antud uurimuse vaatenurgast veelgi olulisem põhjus on<br />
uurimismaterjali vähene kättesaadavus – <strong>AIRE</strong>t ekspresseeritakse peaasjalikult väikese<br />
arvukusega tüümuse medulla epiteeli rakkudes ning liine, mis <strong>AIRE</strong>t ekspresseeriks, on<br />
samuti vähe. Kahel viimasel põhjusel otsustati meie laboris luua Clontechi Tet-On Advancedsüsteemi<br />
põhjal rakuliin, milles <strong>AIRE</strong> ekspressioon oleks ainuüksi doksütsükliiniga<br />
aktiveeritav.<br />
Siinse magistritöö kirjalik osa annab ülevaate <strong>AIRE</strong>-valgu rollist immuunsüsteemis ning<br />
tutvustab temaga interakteeruvaid valke. Samuti tutvustatakse tüümuses toimuvat T-<br />
lümfotsüütide küpsemisprotsessi, kus <strong>AIRE</strong> on kriitilise tähtsusega faktor organismi enda<br />
valke võõrastena ära tundvate T-rakkude elimineerimises negatiivse selektsiooni etapis.<br />
<strong>AIRE</strong> on transkriptsioonifaktor, mis praeguste tulemuste põhjal osaleb peaasjalikult<br />
transkriptsiooni initsiatsioonis ning elongatsioonis. Seetõttu on kirjaliku osa teises pooles<br />
keskendutud neis etappides osalevatele valkudele, peamiselt RNA polümeraasile, ja<br />
kirjeldatud initsiatsioonilt elongatsioonile üleminekul toimuvaid muudatusi valkude<br />
koosluses.<br />
Siin töös esitletud ning juba ka teistes eksperimentides kasutatav <strong>AIRE</strong> 4.7 liin saadi<br />
Tet-On Advanced-liini transfekteerimisel eelnevalt sekveneeritud pTRE-<strong>AIRE</strong> liitplasmiidiga.<br />
<strong>AIRE</strong>-valgu olemasolu valmisliinis kinnitati Western Bloti ja IF-katsetega. <strong>AIRE</strong> paigutub<br />
4.7-liinis IF-katsete põhjal varem kirjeldatud rakuosadesse ja geeniekspressiooni analüüsi<br />
39
põhjal on võimeline aktiveerima oma sihtmärkgeenide ekspressiooni mitmesajakordselt<br />
võrreldes sama liini indutseerimata negatiivse kontrolliga. Kromatiini immunosadestamise<br />
katsega uuriti antud liinis <strong>AIRE</strong> ning teiste faktorite olemasolu <strong>AIRE</strong> sihtmärkgeenide<br />
promootoritel ning promootoritel toimuvaid muudatusi valkude koosluses.<br />
Tänuavaldused<br />
Suurimad tänud minu juhendajatele eesotsas Tõnis Oruga. Samuti soovin tänada kõiki<br />
laborikaaslasi, kes selle töö valmimisele nõuga kaasa aitasid ja professor Pärt Petersoni<br />
võimaluse eest teha seda tööd Molekulaarpatoloogia töögrupis.<br />
Kasutatud kirjandus<br />
Aaltonen, J., Bjorses, P., Perheentupa, J., Horelli-Kuitunen, N., Palotie, A., Peltonen, L., Lee,<br />
Y.S., Francis, F., HenningSteffen, Thiel, C., jt (1997). An autoimmune disease, APECED,<br />
caused by mutations in a novel gene featuring two PHD-type zinc-finger domains. Nat Genet<br />
17, 399-403.<br />
Abbas, A.K., Lichtman, Andrew H., Pillai, Shiv (2007). Cellular and Molecular<br />
Immunology 6th Edition (Elsevier Press).<br />
Abramson, J., Giraud, M., Benoist, C., ja Mathis, D. (2010). Aire's partners in the molecular<br />
control of immunological tolerance. Cell 140, 123-135.<br />
Anderson, M.S., Venanzi, E.S., Klein, L., Chen, Z., Berzins, S.P., Turley, S.J., von Boehmer,<br />
H., Bronson, R., Dierich, A., Benoist, C., ja Mathis, D. (2002). Projection of an<br />
immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science (New York, N.Y<br />
298, 1395-1401.<br />
Bannister, A.J., ja Kouzarides, T. (2005). Reversing histone methylation. Nature 436, 1103-<br />
1106.<br />
Björses, P., Pelto-Huikko, M., Kaukonen, J., Aaltonen, J., Peltonen, L., ja Ulmanen, I. (1999).<br />
Localization of the APECED Protein in Distinct Nuclear Structures. Human molecular<br />
genetics 8, 259-266.<br />
Chen, Z.A., Jawhari, A., Fischer, L., Buchen, C., Tahir, S., Kamenski, T., Rasmussen, M.,<br />
Lariviere, L., Bukowski-Wills, J.C., Nilges, M., jt (2010). Architecture of the RNA<br />
polymerase II-TFIIF complex revealed by cross-linking and mass spectrometry. Embo Journal<br />
29, 717-726.<br />
Cheng, M.H., Shum, A.K., ja Anderson, M.S. (2007). What's new in the Aire? Trends in<br />
Immunology 28, 321-327.<br />
Cramer, P., Armache, K.J., Baumli, S., Benkert, S., Brueckner, E., Buchen, C., Damsma,<br />
G.E., Dengl, S., Geiger, S.R., Jaslak, A.J., jt (2008). Structure of eukaryotic RNA<br />
polymerases. Annual Review of Biophysics 37, 337-352.<br />
Darzacq, X., Shav-Tal, Y., de Turris, V., Brody, Y., Shenoy, S.M., Phair, R.D., ja Singer,<br />
R.H. (2007). In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature structural &<br />
molecular biology 14, 796-806.<br />
Derbinski, J., Pinto, S., Rösch, S., Hexel, K., ja Kyewski, B. (2008). Promiscuous gene<br />
expression patterns in single medullary thymic epithelial cells argue for a stochastic<br />
mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 657-662.<br />
40
Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., ja Klein, L. (2001). Promiscuous gene expression in<br />
medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nature Immunology 2, 1032-<br />
1039.<br />
DeVoss, J.J., ja Anderson, M.S. (2007). Lessons on immune tolerance from the monogenic<br />
disease APS1. Current opinion in genetics & development 17, 193-200.<br />
Egerton, M., Scollay, R., ja Shortman, K. (1990). Kinetics of mature T-cell development in<br />
the Thymus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of<br />
America 87, 2579-2582.<br />
Egloff, S., ja Murphy, S. (2008). Cracking the RNA polymerase IICTD code. Trends in<br />
Genetics 24, 280-288.<br />
Eichner, J., Chen, H.T., Warfield, L., ja Hahn, S. (2010). Position of the general transcription<br />
factor TFIIF within the RNA polymerase II transcription preinitiation complex. Embo Journal<br />
29, 706-716.<br />
Ferguson, B.J., Alexander, C., Rossi, S.W., Liiv, I., Rebane, A., Worth, C.L., Wong, J., Laan,<br />
M., Peterson, P.r., Jenkinson, E.J., jt (2008). <strong>AIRE</strong>'s CARD Revealed, a New Structure for<br />
Central Tolerance Provokes Transcriptional Plasticity. Journal of Biological Chemistry 283,<br />
1723-1731.<br />
Freundlieb, S. (2007). The Tet System: Powerful, Inducible Gene Expression.<br />
Clontechniques.<br />
Freundlieb, S., Schirra-Muller, C., ja Bujard, H. (1999). A tetracycline controlled<br />
activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells.<br />
J. Gene. Med. 1, 4-12.<br />
Fuda, N.J., Ardehali, M.B., ja Lis, J.T. (2009). Defining mechanisms that regulate RNA<br />
polymerase II transcription in vivo. Nature 461, 186-192.<br />
Gardner, J.M., DeVoss, J.J., Friedman, R.S., Wong, D.J., Tan, Y.X., Zhou, X., Johannes,<br />
K.P., Su, M.A., Chang, H.Y., Krummel, M.F., ja Anderson, M.S. (2008). Deletional<br />
Tolerance Mediated by Extrathymic Aire-Expressing Cells. Science (New York, N.Y 321,<br />
843-847.<br />
Gotter, J., ja Kyewski, B. (2004). Regulating self-tolerance by deregulating gene expression.<br />
Current opinion in immunology 16, 741-745.<br />
Gray, D., Abramson, J., Benoist, C., ja Mathis, D. (2007). Proliferative arrest and rapid<br />
turnover of thymic epithelial cells expressing Aire. The Journal of experimental medicine<br />
204, 2521-2528.<br />
Guerau-de-Arellano, M., Mathis, D., ja Benoist, C. (2008). Transcriptional impact of Aire<br />
varies with cell type. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 14011-14016.<br />
Gäbler, J., Arnold, J., ja Kyewski, B. (2007). Promiscuous gene expression and the<br />
developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. European Journal of<br />
Immunology 37, 3363-3372.<br />
Hager, G.L., McNally, J.G., ja Misteli, T. (2009). Transcription Dynamics. 35, 741-753.<br />
Hahn, S. (2009). New beginnings for transcription. Nature 462, 292-293.<br />
Halonen, M., Kangas, H., Ruppell, T., Ilmarinen, T., Ollila, J., Kolmer, M., Vihinen, M.,<br />
Palvimo, J., Saarela, J., Ulmanen, I., ja Eskelin, P. (2004). APECED-causing mutations in<br />
<strong>AIRE</strong> reveal the functional domains of the protein. Human Mutation 23, 245-257.<br />
Heino, M., Peterson, P., Kudoh, J., Nagamine, K., Lagerstedt, A., Ovod, V., Ranki, A.,<br />
Rantala, I., Nieminen, M., Tuukkanen, J., jt (1999). Autoimmune Regulator Is Expressed in<br />
the Cells Regulating Immune Tolerance in Thymus Medulla. Biochemical and Biophysical<br />
Research Communications 257, 821-825.<br />
Hubert, F.X., Kinkel, S.A., Webster, K.E., Cannon, P., Crewther, P.E., Proeitto, A.I., Wu, L.,<br />
Heath, W.R., ja Scott, H.S. (2008). A specific anti-Aire antibody reveals Aire expression is<br />
restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. Journal of<br />
Immunology 180, 3824-3832.<br />
41
Ilmarinen, T., Eskelin, P., Halonen, M., Rüppell, T., Kilpikari, R., Torres, G.D., Kangas, H.,<br />
ja Ulmanen, I. (2005). Functional analysis of SAND mutations in <strong>AIRE</strong> supports dominant<br />
inheritance of the G228W mutation. Human Mutation 26, 322-331.<br />
Ilmarinen, T., Kangas, H., Kytömaa, T., Eskelin, P., Saharinen, J., Seeler, J.-S., Tanhuanpää,<br />
K., Chan, F.Y.-L., Slattery, R.M., Alakurtti, K., jt (2008). Functional interaction of <strong>AIRE</strong> with<br />
PIAS1 in transcriptional regulation. Molecular Immunology 45, 1847-1862.<br />
Kalkhoven, E. (2004). CBP and p300: HATs for different occasions. Biochemical<br />
Pharmacology 68, 1145-1155.<br />
Kogawa, K., Nagafuchi, S., Katsuta, H., Kudoh, J., Tamiya, S., Sakai, Y., Shimizu, N., ja<br />
Harada, M. (2002). Expression of <strong>AIRE</strong> gene in peripheral monocyte/dendritic cell lineage.<br />
Immunology Letters 80, 195-198.<br />
Koh, A.S., Kuo, A.J., Park, S.Y., Cheung, P., Abramson, J., Bua, D., Carney, D., Shoelson,<br />
S.E., Gozani, O., Kingston, R.E., jt (2008). Aire employs a histone-binding module to mediate<br />
immunological tolerance, linking chromatin regulation with organ-specific autoimmunity.<br />
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105,<br />
15878-15883.<br />
Kornberg, R.D. (2007). The molecular basis of eukaryotic transcription. Proceedings of the<br />
National Academy of Sciences of the United States of America 104, 12955-12961.<br />
Krishnamurthy, S., He, X.Y., Reyes-Reyes, M., Moore, C., ja Hampsey, M. (2004). Ssu72 is<br />
an RNA polymerase IICTD phosphatase. Molecular Cell 14, 387-394.<br />
Kyewski, B., ja Klein, L. (2006). A central role for central tolerance. Annual review of<br />
immunology 24, 571-606.<br />
Lan, F., Collins, R.E., De Cegli, R., Alpatov, R., Horton, J.R., Shi, X.B., Gozani, O., Cheng,<br />
X.D., ja Shi, Y. (2007). Recognition of unmethylated histone H3 lysine 4 links BHC80 to<br />
LSD1-mediated gene repression. Nature 448, 718-U714.<br />
Liiv, I., Rebane, A., Org, T., Saare, M., Maslovskaja, J., Kisand, K., Juronen, E., Valmu, L.,<br />
Bottomley, M.J., Kalkkinen, N., ja Peterson, P. (2008). DNA-PK contributes to the<br />
phosphorylation of <strong>AIRE</strong>: Importance in transcriptional activity. Biochimica et Biophysica<br />
Acta (BBA) - Molecular Cell Research 1783, 74-83.<br />
Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., ja Goodnow, C.C. (2003). Aire regulates<br />
negative selection of organ-specific T cells. Nat Immunol 4, 350-354.<br />
Maiolica, A., Cittaro, D., Borsotti, D., Sennels, L., Ciferri, C., Tarricone, C., Musacchio, A.,<br />
ja Rappsilber, J. (2007). Structural Analysis of Multiprotein Complexes by Cross-linking,<br />
Mass Spectrometry, and Database Searching. Molecular & Cellular Proteomics 6, 2200-2211.<br />
Marrella, V., Poliani, P.L., Sobacchi, C., Grassi, F., ja Villa, A. (2008). Of Omenn and mice.<br />
Trends in Immunology 29, 133-140.<br />
Mathis, D., ja Benoist, C. (2009). Aire. Annual review of immunology 27, 287-312.<br />
Mosley, A.L., Pattenden, S.G., Carey, M., Venkatesh, S., Gilmore, J.M., Florens, L.,<br />
Workman, J.L., ja Washburn, M.P. (2009). Rtr1 Is a CTD Phosphatase that Regulates RNA<br />
Polymerase II during the Transition from Serine 5 to Serine 2 Phosphorylation. Molecular<br />
Cell 34, 168-178.<br />
Nagamine, K., Peterson, P., Scott, H.S., Kudoh, J., Minoshima, S., Heino, M., Krohn, K.J.E.,<br />
Lalioti, M.D., Mullis, P.E., Antonarakis, S.E., jt (1997). Positional cloning of the APECED<br />
gene. Nature Genet. 17, 393-398.<br />
Noma, K., Allis, C.D., ja Grewal, S.I.S. (2001). Transitions in distinct histone H3 methylation<br />
patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science (New York, N.Y 293, 1150-1155.<br />
Ooi, S.K.T., Qiu, C., Bernstein, E., Li, K.Q., Jia, D., Yang, Z., Erdjument-Bromage, H.,<br />
Tempst, P., Lin, S.P., Allis, C.D., jt (2007). DNMT3L connects unmethylated lysine 4 of<br />
histone H3 to de novo methylation of DNA. Nature 448, 714-U713.<br />
Org, T., Chignola, F., Hetenyi, C., Gaetani, M., Rebane, A., Liiv, I., Maran, U., Mollica, L.,<br />
Bottomley, M.J., Musco, G., ja Peterson, P. (2008). The autoimmune regulator PHD finger<br />
42
inds to non-methylated histone H3K4 to activate gene expression. EMBO reports 9, 370-<br />
376.<br />
Org, T., Rebane, A., Kisand, K., Laan, M., Haljasorg, U., Andreson, R., ja Peterson, P.<br />
(2009). <strong>AIRE</strong> activated tissue specific genes have histone modifications associated with<br />
inactive chromatin. Human molecular genetics 18, 4699-4710.<br />
Oven, I., Brdickova, N., Kohoutek, J., Vaupotic, T., Narat, M., ja Peterlin, B.M. (2007). <strong>AIRE</strong><br />
recruits P-TEFb for transcriptional elongation of target genes in medullary thymic epithelial<br />
cells. Molecular and cellular biology 27, 8815-8823.<br />
Peterlin, B.M., ja Price, D.H. (2006). Controlling the elongation phase of transcription with P-<br />
TEFb. Molecular Cell 23, 297-305.<br />
Peterson, P. (2008). Autoimmune Polyglandular Syndrome Type 1 (Autoimmune Diseases in<br />
Endocrinology Humana Press).<br />
Peterson, P., Org, T., ja Rebane, A. (2008). Transcriptional regulation by <strong>AIRE</strong>: molecular<br />
mechanisms of central tolerance. Nat. Rev. Immunol. 8, 948-957.<br />
Pitkanen, J., ja Peterson, P. (2003). Autoimmune regulator: from loss of function to<br />
autoimmunity. Genes and Immunity 4, 12-21.<br />
Pitkanen, J., Vahamurto, P., Krohn, K., ja Peterson, P. (2001). Subcellular localization of the<br />
autoimmune regulator protein - Characterization of nuclear targeting and transcriptional<br />
activation domain. Journal of Biological Chemistry 276, 19597-19602.<br />
Pitkänen, J., Doucas, V., Sternsdorf, T., Nakajima, T., Aratani, S., Jensen, K., Will, H.,<br />
Vähämurto, P., Ollila, J., Vihinen, M., jt (2000). The Autoimmune Regulator Protein Has<br />
Transcriptional Transactivating Properties and Interacts with the Common Coactivator<br />
CREB-binding Protein. Journal of Biological Chemistry 275, 16802-16809.<br />
Pitkänen, J., Rebane, A., Rowell, J., Murumägi, A., Ströbel, P., Möll, K., Saare, M., Heikkilä,<br />
J., Doucas, V., Marx, A., ja Peterson, P. (2005). Cooperative activation of transcription by<br />
autoimmune regulator <strong>AIRE</strong> and CBP. Biochemical and Biophysical Research<br />
Communications 333, 944-953.<br />
Poliani, P.L., Kisand, K., Marrella, V., Ravanini, M., Notarangelo, L.D., Villa, A., Peterson,<br />
P., ja Facchetti, F. (2010). Human Peripheral Lymphoid Tissues Contain Autoimmune<br />
Regulator-Expressing Dendritic Cells. Am J Pathol 176, 1104-1112.<br />
Rinderle, C., Christensen, H.M., Schweiger, S., Lehrach, H., ja Yaspo, M.L. (1999).<br />
Functional analysis of the <strong>AIRE</strong> protein: subcellular localization and identification of<br />
potential interactors. Cytogenetics and Cell Genetics 86, 19-19.<br />
Saunders, A., Core, L.J., ja Lis, J.T. (2006). Breaking barriers to transcription elongation.<br />
Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557-567.<br />
Schaller, C.E., Wang, C.L., Beck-Engeser, G., Goss, L., Scott, H.S., Anderson, M.S., ja Wabl,<br />
M. (2008). Expression of Aire and the Early Wave of Apoptosis in Spermatogenesis. J<br />
Immunol 180, 1338-1343.<br />
Taverna, S.D., Ilin, S., Rogers, R.S., Tanny, J.C., Lavender, H., Li, H.T., Baker, L., Boyle, J.,<br />
Blair, L.P., Chait, B.T., jt (2006). Yng1 PHD finger binding to H3 trimethylated at K4<br />
promotes NuA3 HAT activity at K14 of H3 and transcription at a subset of targeted ORFs.<br />
Molecular Cell 24, 785-796.<br />
Urlinger, S., Baron, U., Thellmann, M., Hasan, M.T., Bujard, H., ja Hillen, W. (2000).<br />
Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: Novel<br />
mutations yield expanded range and sensitivity. Proceedings of the National Academy of<br />
Sciences of the United States of America 97, 7963-7968.<br />
Wade, J.T., ja Struhl, K. (2008). The transition from transcriptional initiation to elongation.<br />
Current opinion in genetics & development 18, 130-136.<br />
Vaquerizas, J.M., Kummerfeld, S.K., Teichmann, S.A., ja Luscombe, N.M. (2009). A census<br />
of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat. Rev. Genet. 10, 252-<br />
263.<br />
43
Venanzi, E.S., Melamed, R., Mathis, D., ja Benoist, C. (2008). The variable immunological<br />
self: Genetic variation and nongenetic noise in Aire-regulated transcription. Proceedings of<br />
the National Academy of Sciences 105, 15860-15865.<br />
Woltjen, K., Michael, I.P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R.,<br />
Cowling, R., Wang, W., Liu, P.T., Gertsenstein, M., jt (2009). piggyBac transposition<br />
reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 458, 766-U106.<br />
Kasutatud veebiaadressid:<br />
www.clontech.com<br />
www.collaslab.com<br />
44
Generation of a Cell-Line with Doxycycline-Inducible <strong>AIRE</strong> expression<br />
Uku Haljasorg<br />
Summary<br />
<strong>AIRE</strong> (Autoimmune Regulator) is a transcriptional regulator expressed in a subset of mTECs<br />
(medullary thymic epithelial cells). The <strong>AIRE</strong> protein is responsible for activating the<br />
promiscuous expression of a bulk of autoantigens needed to carry out the negative selection of<br />
developing T-cells and to avoid the escape of autoreactive T-cells to the periphery. The<br />
precise molecular mechanisms of <strong>AIRE</strong> mediated gene expression activation have, so far, in<br />
large, remained an enigma. The low numbers of <strong>AIRE</strong> expressing mTECs and the lack of celllines<br />
expressing <strong>AIRE</strong> have prompted us to generate a doxycycline inducible <strong>AIRE</strong><br />
expression system in HEK293 cell-line in order to better understand <strong>AIRE</strong> role in regulation<br />
of gene expression. This new cell-line, termed 4.7 provides a number of advantages such as<br />
strong, uniform and precise activation of <strong>AIRE</strong> expression, and perfectly matched negative<br />
control as we observed no expression leakage in unstimulated cells. In addition, we show<br />
<strong>AIRE</strong> functional capacity in these cells as we observe a clear <strong>AIRE</strong> dependent increase in the<br />
expression of previously identified <strong>AIRE</strong> target genes. By using chromatin<br />
immunoprecipitation approach, the system will enable to study the kinetics of <strong>AIRE</strong>-mediated<br />
transcriptional regulation and epigenetic changes, which will further help to understand the<br />
molecular mechanism of promiscuous gene expression in mTECs.<br />
With different assays we have convincingly verified that <strong>AIRE</strong> is not only expressed but is<br />
also located in the right cellular compartments and acts as a transactivator in the 4.7 cell-line.<br />
Also, although the Q2ChIP (Quick and Quantitative Chromatin Immunoprecipitation) results<br />
are still preliminary and they still need conformation, <strong>AIRE</strong> protein in this 4.7 cell-line is<br />
capable of binding its target genes’ promoters and activating them henceforth.<br />
This doxycycline inducible <strong>AIRE</strong> expressing cell line 4.7 gives us exact control over the<br />
expression of one of the key proteins involved in establishment of self-tolerance. Therefore<br />
this cell-line is highly suitable for studying the molecular mechanisms behind <strong>AIRE</strong>-induced<br />
gene expression in a time dependent manner<br />
45
Lisad<br />
Lisa 1. Artikkel<br />
<strong>AIRE</strong> activated tissue specific genes have histone modifications associated with inactive<br />
chromatin<br />
Tõnis Org, Ana Rebane, Kai Kisand, Martti Laan, Uku Haljasorg, Reidar Andreson<br />
ja Pärt Peterson. Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, No. 24<br />
46
Change language