Ribosoomivalgud ja nende modifikatsioonid statsionaarses faasis ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

MOLEKULAARBIOLOOGIA ÕPPETOOL 

Sander Jahilo 

Ribosoomivalgud ja nende modifikatsioonid statsionaarses faasis Escherichia coli rakkudes 

Bakalaureusetöö 

Juhendaja Ülo Maiväli, Ph.D, kaasjuhendaja Lauri Peil, M.Sc 

TARTU 2009

SISUKORD 

SISUKORD............................................................................................................................................. 2 

KASUTATUD LÜHENDID.................................................................................................................... 3 

SISSEJUHATUS ..................................................................................................................................... 4 

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE............................................................................................................... 5 

1.1 Ribosoomivalkude ülevaade ........................................................................................................... 5 

1.1.1 Ribosoomid ............................................................................................................................. 5 

1.1.2 Väike subühik – 30S................................................................................................................ 6 

1.1.3 Suur subühik – 50S.................................................................................................................. 6 

1.1.4 Ribosoomivalgud..................................................................................................................... 7 

1.1.5 Ribosoomid ja r-valgud statsionaarses faasis............................................................................ 7 

1.1.6 Ribosoomivalgu ja antiterminatsiooni kompleksid ................................................................... 8 

1.1.7 Ribosoomivalkude sünteesimise tagasisidestuslik regulatsioon................................................. 9 

1.1.8 30S subühiku ribosoomivalgud ja funktsioonid ........................................................................ 9 

1.1.9 50S subühiku ribosoomivalgud ja funktsioonid:..................................................................... 14 

1.2 Ribosoomivalkude post-translatsioonilised modifikatsioonid ........................................................ 20 

1.3 Ensüümid, mis ribosoomivalke modifitseerivad............................................................................ 21 

2. EKSPERIMENTAALOSA ................................................................................................................ 24 

2.1 Töö eesmärk................................................................................................................................. 24 

2.2 Materjal ja metoodika................................................................................................................... 24 

2.2.1 Ribosoomide eraldamine ....................................................................................................... 24 

2.2.2 Top-down tandem mass-spektromeetria (MS/MS)................................................................. 25 

2.2.3 ProSight PTM 2.0.................................................................................................................. 26 

2.3 Tulemused ................................................................................................................................... 27 

2.4 Arutelu......................................................................................................................................... 33 

KOKKUVÕTE ...................................................................................................................................... 37 

SUMMARY .......................................................................................................................................... 38 

KIRJANDUSE LOETELU .................................................................................................................... 39 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID ..................................................................................................... 50 

LISA 1................................................................................................................................................... 51 

2

KASUTATUD LÜHENDID 

AcPhe-tRNA – atsetüülfenüül-transport-RNA 

LLP - lüüsilahjenduspuhver 

R-valgud – ribosoomivalgud 

EF-G – elongatsioonifaktor G 

EF-Tu – elongatsioonifaktor Tu 

EF-Ts – elongatsioonifaktor Ts 

3

SISSEJUHATUS 

Käesolev töö uurib ribosoomivalkude post-translatsioonilisi modifikatsioone statsionaarses faasis 

Escherichia coli rakkudes. Post-translatsioonilised modifikatsioonid on seni tuvastatud 11 valgul 

70S ribosoomis, kuid kõigi nende funktsioon ei ole päris selge. Võimalik, et iga modifikatsioon 

mängib väikest rolli ribosoomi funktsioneerimisel. E.coli on valitud katsealuseks, kuna tegemist 

on kõige levinuma laboris kasutatava uurimisobjektiga, mille tõttu on tema kohta olemas ka 

kõige ammendavam teaduslike artiklite kogu. Nagu kohe näitame, on selle bakteri 

molekulaarbioloogias aspekte, milles senini valitseb teadmatus. 

Valdavalt käsitleb kirjandus just eksponentsiaalses faasis kasvanud E.coli bioloogiat, kuna selles 

faasis on käigus suur hulk rakusiseseid protsesse ning rakkude uurimisel on muudatusi just 

nõnda kergeim tuvastada. Statsionaarses faasis kannatavad rakud aga stressi all, mistõttu nende 

füsioloogilised ja geneetilised protsessid ei saa normaalselt toimida. Samas on üldlevinud 

teadmine, et iga organism reageerib kuidagi pärsitud kasvutingimustele, surudes maha oma 

metabolismi, varieerides energiaallikaid jne, mis on kõik seotud geenide ekspressiooni 

muutlikkusega või geenide sisse-välja lülitumisega. Selles valguses ei oleks üllatav, kui ka 

ribosoomivalgud ning nende modifikatsioonid omaksid erinevat rolli eksponentsiaalses ja 

statsionaarses faasis. 

Ribosoomivalgud on uurimisteema, mille uurimine on kestnud juba aastakümneid ning hoolimata 

paljudest sellealastest töödest ei ole ribosoomivalgud ning just nende post-translatsioonilised 

modifikatsioonid sugugi selgelt ega ammendavalt läbi uuritud. Ka meie töö katab üht seni veel 

uurimata aspekti ribosoomivalkude modifikatsioonide juures – nimelt uurime, kas ja kuidas 

erinevad omavahel statsionaarse ja eksponentsiaalse faasi rakkude ribosoomivalgu 

modifikatsioonid. 

Töö eesmärgiks on tutvuda olemasolevate ribosoomivalkudega, nende funktsioonide ja 

modifikatsioonidega, ning erinevaid molekulaarbioloogilisi meetodeid tundma õppides ja 

kasutades võrrelda statsionaarse faasi 30S ribosoomivalke ja modifikatsioone eksponentsiaalse 

faasi valkudega. 

4

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

1.1 Ribosoomivalkude ülevaade 

1.1.1 Ribosoomid 

Ribosoomid on makromolekulid, mis koosnevad RNA-st ja valkudest ning leiduvad kõigis 

rakulistes elusorganismides. Meid huvitavad prokarüootsed ribosoomid sedimenteeruvad 70S 

partiklitena ja koosnevad kahest subühikust – 30S ja 50S. Escherichia colis on 70S ribosoom 

210-Å diameetriga partikkel, mis koosneb umbes 2/3 ulatuses RNA-st ja 1/3 valgust (Schuwirth 

et al. 2005), kusjuures mitokondriaalsed ribosoomid koosnevad 2/3 valgust ja 1/3 RNA-st (Mears 

et al. 2006). Väike subühik – 30S – koosneb 16S rRNA-st (1542 nt) ja 21 valgust (märgistatud S1 

kuni S21), suur subühik – 50S – koosneb kahest rRNA-st – 23S (2904 nt) ja 5S (120 nt) ning 33 

valgust (L1 kuni L36)(Wilson ja Nierhaus 2005). 

Ribosoomivalgud S20 ja L26 on identsed ning esinevad ühe koopiana kogu 70S ribosoomi peale 

(nüüdseks ongi näidatud, et L26 on ekslikult määratud valk, seega on praeguses kasutuses vaid 

S20) (Wilson ja Nierhaus 2005); L7 on atsetüleerimata vorm valgust L12 ning nad esinevad 

dimeeri dimeerina (L7/L12) 2 ; L8 ei ole omaette valk, vaid on L7/L12 ja L10 kompleks (Noller ja 

Nomura 1996; Petersson et al. 1976). Peale S1, mille molekulaarmass on 61.2 kDa, on kõigi 

teiste ribosoomivalkude massivahemik 4.4 ja 29.7 kDa vahel (Arnold ja Reilly 1999). 

On hüpoteetiline võimalus, et ribosoomivalgud on lühikesed võrreldes pikkade rRNA 

molekulidega, kuna transkriptsioon on oluliselt täpsem protsess kui translatsioon. Ilma 

proofreading’uta on transkriptsiooni täpsus suurusjärgus 1:60000 kuni 1:120000 (Libby et al. 

1989), mis võimaldab vigadeta sünteesida 3000 kuni 5000 nukleotiidi pikkuseid rRNA molekule, 

samas kui translatsiooni täpsus on suurusjärgus 1:3000 (Bouadloun et al. 1983). Seega – et 

enamus ribosoomivalke oleksid funktsionaalsed ja täpsed, peaksid nad olema alla 300 

aminohappejäägi pikkused. (Wilson ja Nierhaus 2005) 

E. colis on 19 r-valgu operoni. Enamasti on r-valkude geenid klasterdunud teiste r-valkudega või 

siis valkudega, mis on seotud translatsiooniga, nt elongatsioonifaktorid EF-G, EF-Tu ja EF-Ts. 

(Kaczanowska et al 2007) 

5

1.1.2 Väike subühik – 30S 

E.colis seonduvad väikese subühiku valgud S4, S7, S8, S15, S17 ja S20 iseseisvalt 16S rRNA 

külge ja neid nimetatakse primaarseteks seostumisvalkudeks (primary binding proteins) (Sykes ja 

Williamson 2009). Pärast neid seonduvad kasvavale ribosoomile valgud S5, S6, S9, S12, S13, 

S16, S18 ja S19, mida nimetatakse sekundaarseteks seostumisvalkudeks. Need võimaldavad 

hiliste seostumisvalkude S2, S3, S10, S11, S14 ja S21 lisandumist ribosoomile. Valkude 

seondumine 16S rRNA helikaalühendustele (helical junctions) on oluline selleks, et initsieerida 

korrektne tertsiaarse RNA kokkupakkumine (folding) ja organiseerida üleüldist ribosoomi 

struktuuri (Culver 2003). Oluline on märkida, et 30S subühiku moodustumine on iseseisev, kuid 

50S on sõltuv 30S subühiku korrektsest assambleerumisest, kuigi mõlemad subühikud 

moodustatakse peaaegu samal ajal (Nashimoto ja Nomura 1970). 16S rRNA-d saab jagada 

neljaks domeeniks (tsentraalne, 3’ major, 3’ minor, 5’, vt Lisa 1. Joonis 1(A)), seega saab 

ribosoomivalkude (r-valkude) asukoha osaliselt määrata nende rRNA domeenide järgi, millega 

valgud seonduvad. 5’- domeen valkudega S4, S5, S12, S16, S17 ja S20 moodustavad 30S 

subühiku keha. 3’ major domeen moodustab pea, mis sisaldab r-valke S2, S3, S7, S9, S10, S13, 

S14, ja S19. Tsentraaldomeen moodustab platvormi valkude S1, S6, S8, S11, S15, ja S18 

interaktsioonideks (Lisa 1. Joonis 1(B)). 

1.1.3 Suur subühik – 50S 

50S subühik on poolkerakujuline, kolme väljaulatuva moodustisega. Kuigi 50S subühiku 

assambleerumisel on palju ühist 30S-ga, on täieliku 50S partikli moodustamisele eelnev 

protsesside käik oluliselt komplekssem. 23S rRNA on umbes kaks korda suurem 16S rRNA-st, 

seondab ligi kaks korda rohkem valke ning peab lisaks moodustama korrektse ühenduse 5S 

rRNA-ga. (Kaczanowska et al. 2007) 50S ribosoomivalgud stabiliseerivad rRNA tertsiaarset 

struktuuri ning on vajalikud subühiku assambleerumisel. 28 valgu struktuur kokku 34-st suure 

subühiku r-valgust on identifitseeritud. 50S subühiku assambleerumise esmase vahepartikli 41S 

moodustumisel on essentsiaalne valkude L4, L13, L20, L22, L24 ja L3 olemasolu (Kaczanowska 

et al. 2007). L5, L18, L25 ja L31 on otseselt seotud 5S rRNA seondumisega, neist L25 eraldi 

protsessis ning ülejäänud kokkuseondununa (Fanning ja Traut 1981). Enamus 50S valkudest 

moodustavad ühendusi mitmete rRNA domeenide saitidega, mis on vahepealsete nukleotiidse 

6

järjestusega üksteisest eraldatud. Seega on ilmne, et suurema osa 50S valkude ülesandeks on 

stabiliseerida neid interdomeenseid interaktsioone, mis loovad terve ribosoomi kuju. On olemas 

kaks regiooni, kus valkude kontsentratsioon on tavapärasest suurem: üks asub L7/L12 varre all. 

Seal toimub mitmete translatsioonifaktorite seondumine, ning teine ümbritseb polüpeptiidide 

väljumise tunnelit. (Kaczanowska et al 2007; Moore et al 2003) Suure subühiku rRNA saab 

jagada seitsmeks domeeniks mis erinevalt 30S subühikust on valkude ja üksteisega tihedasti 

läbipõimunud. Seega seonduvad suure subühiku valgud keskmiselt palju enamate domeenidega 

kui väikese subühiku valgud. Suure subühiku 5S partikkel moodustab omaette VII domeeni. 

(Wilson ja Nierhaus 2005) 

1.1.4 Ribosoomivalgud 

Peaegu kõik r-valgud (ribosoomivalgud) sisaldavad ühte või enamat globulaardomeeni ning 

paljud lisaks ka jätkeid, mis suudavad seonduda kaugelolevate RNA piirkondadega, muutes 

nõnda ribosoomi stabiilsemaks. Kõik väikese subühiku valgud (v.a. S4 ja S15) ning umbes 50% 

suure subühiku valkudest sisaldavad jätkeid, mis esinevad random coil’idena N- või C-terminuste 

otstes, alfa-heeliksina valgu keskosas või beta-lehena valgu keskosas. Need jätked omavad 

ülejäänud valguga võrreldes erinevaid aminohappelisi järjestusi, sisaldades mitmeid 

glütsiinijääke, mis võimaldab jätkete tihedat ja paindlikku kokkupakkumist. Stabiilsust 

suurendavad ka r-valkude aluselised jäägid, kuna nad neutraliseerivad RNA-selgroo laengut. R- 

valkude vahel esinevad ka valk-valk interaktsioonid, mis hoiavad struktuuri koos 

elektrostaatiliste ja vesiniksidemetega. (Wilson ja Nierhaus 2005) 

1.1.5 Ribosoomid ja r-valgud statsionaarses faasis 

Statsionaarse faasi E. coli ribosoomid muudavad oma kompositsiooni ja konformatsiooni 

võrreldes eksponentsiaalse faasiga. Ribosoomi modulatsioonifaktorit RMF ja r-valku S22 

seostatakse statsionaarse faasi ribosoomidega. RMF-i assotsieerumine põhjustab 

translatsioonilise aktiivsuse kadu ning 70S ribosoomi dimerisatsiooni 100S ribosoomiks, mis 

võib suurendada raku ellujäämisvõimalusi statsionaarses faasis. (Yoshida, Wada ja Maki 2000) 

On leitud, et mitmed r-valgud läbivad muutusi statsionaarsesse faasi sisenemisel. Näiteks kaovad 

statsionaarses faasis S3 mitmed isovormid, lõigatakse ära L16 ning L35 dissotsieerub suurest 

subühikust (Wada et al. 2000). Nende muudatuste bioloogiline tähendus pole teada. Statsionaarse 

7

faasi ribosoomide valguline koosseis peab aga suutma end taas ümber kohandada, kui 

eksponentsiaalne kasv peaks paranenud kasvutingimuste tõttu taastuma. Selline 

ümberkohastumine võib toimuda statsionaarse faasi r-valgu vormide vabastamisega ja/või uute 

ribosoomide sünteesiga (Vila-Sanjurjo 2008). 

Kalpaxis et al. viisid 1998. aastal läbi katse näljatingimustel kasvatatud E. coli rakkudega ning 

uurisid erinevusi ribosoomide funktsionaalsuses. Nad leidsid, et eksponentsiaalsest 

statsionaarsesse faasi ülemineku järgselt hakkasid ribosoomid lagunema ning pärast seitset päeva 

olid 35% ± 4% ribosoomidest kadunud. Allesjäänud ribosoomides polnud 23S ega 16S säilinud 

ühes tükis. Autorid väitsid, et süsinikunäljas hoitud E. coli rakkude ellujäämine on 

proportsionaalne konkreetse tüve võimega degradeerida rRNA-d. Lisaks leiti, et statsionaarse 

faasi rakud omasid vähenenud võimet seondada aminoatsüül-tRNA-d, mistõttu järeldati, et 70S 

ribosoom seondumise efektiivsus AcPhe-tRNA-ga sõltub kultuuri vanusest. Ka 

peptidüültransferaasne aktiivsus muutus kui bakterid läksid eksponentsiaalsest üle 

statsionaarsesse faasi. Funktsionaalsete ribosoomide kontsentratsioon on oluline factor, mis 

mõjutab peptiidsidemete moodustamise kiirust ning funktsionaalsete ribosoomide hulk on sõltuv 

rRNA fragmentatsiooni ulatusest. Kuigi töökorras ribosoomide hulk väheneb oluliselt pärast 

pikka näljatingimustel kasvamist, võib allesjäänud tervetel ribosoomidel lasuda vastutus vajalike 

statsionaarse faasi geenide ekspresseerimiseks ning ka edukaks taastumiseks, kui toitained taas 

kättesaadavaks muutuvad. (Kalpaxis et al. 1998) 

Ribosoomivalgud statsionaarse faasi rakkudes ei paista muutusi läbivat, ainsa erandina L7/L12 

valgukompleksi molaarses suhtarv, mis statsionaarse faasi algetapis (24 tundi) väheneb. Kui 

selles faasis olevates rakkudes asendada „nälgivad“ L7/L12 valgud värsketega, taastub 

peptidüültransferaasne aktiivsus võrreldavaks eksponentsiaalse faasi ribosoomidega. (Kalpaxis et 

al. 1998) 

1.1.6 Ribosoomivalgu ja antiterminatsiooni kompleksid 

Ribosomaalsed valgud on seotud antiterminatsioonikompleksidega ning see võimaldab r-valkudel 

koreguleerida transkriptsiooni ja ribosoomi biogeneesi. Oletatakse, et S1 vähendab 

antiterminatsiooni, samas kui S4, L3, L4 ja L13 suurendavad terminaatori läbilugemist umbes 11- 

kordselt. Nii on võimalik, et r-valgud suudavad suurendada rRNA sünteesi ning samal ajal lasta 

end transportida vastse transkripti seondumissaitidesse (Torres et al. 2001). Seega võib 

8

antiterminatsioonisüsteem omada rolli esimestes korrektse pakkimise ja rRNA töötlemise 

etappides ning r-valkude osalus antiterminatsioonikompleksis võib olla vajalik mittetäieliku 

rRNA tootmise vältimiseks (Nodwell ja Greenblatt 1993). 

1.1.7 Ribosoomivalkude sünteesimise tagasisidestuslik regulatsioon 

Mõned ribosoomivalgud suudavad tagasisidestuslikult reguleerida iseenda sünteesi 

translatsioonilisel tasemel (Nomura et al. 1984). Regulatsiooni põhimõte seisneb selles, et mingi 

polütsistroonse mRNA ühe tsistrooni poolt kodeeritud r-valk seondub iseenda polütsistroonse 

mRNA esimesele ribosoomi initsiatsioonisaidile (operaator-regioonile) ning seeläbi takistab kogu 

mRNA translatsiooni (Zengel ja Lindahl 1994). See toimub juhul, kui vaba (ribosoomile 

mitteseonduvat) r-valku on piisavalt suures koguses (Keener ja Nomura 1996). Repressor võib 

ribosoomidega mRNA pärast konkureerida ning, seondudes operaatorile, indutseerida selliste 

struktuuride teket, mis ei võimalda ribosoomil ligipääsu translatsiooni algussaidile (Mathy et al. 

2004). Kümme sellist repressorvalku on praeguseks identifitseeritud: S1, S4, S7, S8, S15, S20, 

L1, L4, L10 ja L20, mis reguleerivad vastavalt S1, α, str, spc, S15, S20, L11, S10, L10 ja L35 

operone (Keener ja Nomura 1996). 

1.1.8 30S subühiku ribosoomivalgud ja funktsioonid 

S1 

Suudab interakteeruda nii ribosoomi kui mRNA-ga, mis teoreetiliselt võimaldaks tal 

funktsioneerida translatsiooni initsiatsioonis nõnda, et „püüda kinni“ mRNA-sid ning suunata 

need ribosoomi. Ta paikneb ribosoomi 30S subühiku pea, platvormi ja keha ühenduskohas, kus 

on ümbritsetud mitmetest r-valkudest: S2, S6, S9, S11 ja S18 ning jätkete kaudu ka S21 ja S11- 

ga. S1 ühendub ka 16S rRNA-ga. (Sengupta et al. 2001). RNA- seondumisdomeen asub valgu C- 

terminaalses otsas. See ots võib olla vajalik ribosoomi autoregulatsiooniks (Boni et al 2000). S1 

seondub elongatsioonifaktori EF-Tu ja valgu SmpB-ga, et reguleerida tmRNA seondumist 

ribosoomidele ja et reguleerida vabade tmRNA-komplekside formatsiooni (Wower et al 2000). 

S2 

Arvatakse, et see valk on seotud ribosoomi „pea” ja valgu interaktsiooni vahendamises 

(Wimberly et al 2000). 

9

S3 

Omab kahte globulaardomeeni, alfa ja beeta, millest üks on RNA-st isoleeritud. S3 seondub 

valkudega S10 ja S14. Hüdrofoobsed interaktsioonid stabiliseerivad klastrit, mis jällegi aitab 

stabiliseerida ribosoomi struktuuri (Wimberly et al 2000). Vt struktuuri Lisa 1. Joonis 2(A)(B). 

S4 

Omab väljaulatuvat terminaalset aminojätket. Väljaulatuv osa võimaldab valgul interakteeruda 

16S rRNA-ga. S4 seondub 16S rRNA 5’ domeeniga. On oluline valk ribosoomi keha 

assambleerumisel. (Markus et al 1998) Vt struktuuri Lisa 1. Joonis 1(C), 2(A)(B). 

S5 

S5 valgu mutatsioonid põhjustavad mitmete erinevate vähenenud translatsioonitäpsusega 

fenotüüpide tekkimist (Bollen et al. 1969; Kreider ja Brownstein 1972). Need mutatsioonid 

viitavad, et S5 on seotud translokatsiooni ja translatsioonilise täpsuse reguleerimisega 

(Ramakrishnan, White 1992). S5 on oluline ka 30S subühiku assambleerumisel (Nashimoto et al. 

1972; Nashimoto ja Nomura 1970; Pardo et al. 1979). On näidatud, et S5 omab rolli valkude S2, 

S21 ja S3 seondumisel (Mizushima ja Nomura 1970). Vt struktuuri Lisa 1. Joonis 1(C), 2(A)(B). 

S6 

Koosneb 101 aminohappejäägist ning ühest neljaahelalisest antiparalleelsest beta-lehest kahe 

alfa-heeliksiga (Lindahl et al 1994). RNA interakteerub beta-lehe servaga (Wimberly 2000). 

Sisaldab kuni kuut glutamiinhappejääki C-terminuses; esimesed kaks on kodeeritud 

struktuurigeeni rpsF poolt ning ülejäänud lisatud post-translatsiooniliselt (Kang et al. 1989) 

S7 

Koosneb beta-juuksenõelast, mis ulatub kolmanda ja neljanda heeliksi vahele kuue alfa-heeliksi 

klastris. Arvatakse, et valgu pinnal on mitu RNA-seondumiskohta. Heeliksid üks, neli ja kuus 

ning beta-juuksenõel moodustavad positiivselt laetud kaarja pinna, mis on sobiv seondumiskoht 

kaheahelalisele RNA-le (Wimberly, White, Ramakrishnan, 1997). S7 asub 30S subühiku pea 

osas, kus ta initsieerib selle assambleerumist. S7 kontakteerub ka tRNA-ga (Hosaka et al 1997). 

S7 on vajalik ka 16S rRNA 3’ domeeni kokkupakkumiseks ja ta seondub iseenda mRNA-ga, et 

10

eguleerida iseenda sünteesi (Wimberly, White, Ramakrishnan, 1997). S7 ja S11 suudavad 

mõjutada translatsioonilist täpsust oma E-saidi positsioonilt, seda eelkõige negatiivselt ehk 

nendevahelise liidese (interface) muteerumisega kaasneb raaminihe või muud translatsioonivead. 

Vt struktuuri Lisa 1. Joonis 1(C). 

S8 

Koosneb kahest helikaalsegmendi domeenist ja kahest RNA-sidumiskohast. Lisaks on olemas 

hüdrofoobne tuum, mis sisaldab üheksat aminohappejääki ja võib olla seotud S5 valguga. S8 

mängib rolli ribosomaalvalkude translatsiooni regulatsioonil, kuna ta interakteerub spc-operoni 

mRNA-ga (Kalurachchi et al 1997). E.coli spc-operon kodeerib 10 r-valku järjekorras L14, L24, 

L5, S14, S8, L6, L18, S5, L30 ja L15. See operon on tagasisidestuslikult reguleeritud S8 poolt 

(Mattheakis ja Nomura 1988). E.colis suudab S8 seonduda iseenda mRNA-ga ja reguleerida selle 

translatsiooni, käitudes repressorina (Nevskaja et al 1998). 

S9 

S9 omab üht globulaardomeeni ja üht pikka väljaulatuvat karboksüül- või aminoahelat. Seda 

„saba” võib S9 kasutada interaktsiooniks ja kontakteerumiseks 16S rRNA-ga, soodustavaks 

teguriks on ka väljaulatuva ahela kitsus, mis lubab paremat kontakti rRNA-ga. Lisaks on sellel 

aluselised aminohappejäägid, mis neutraliseerib rRNA selgroo happelisust. (Wimberly et al. 

2000). 

S10 

S10 sisaldab alfa-heelikseid, mis on pakitud beta-lehtede vastu, lisaks ka ühte pikka juuksenõela 

või silmust, mis võivad olla vajalikud interaktsiooniks 16S rRNA-ga. S10 on koos valkude S3 ja 

S14-ga ühises klastris. Hüdrofoobsed interaktsioonid stabiliseerivad klastrit ja seeläbi ka kogu 

ribosoomi struktuuri (Wimberly et al 2000). 

S11 

See valk omab beta-lehte, mille ümber on pakitud alfa-heeliksid. Beta-leht asub 16S rRNA 

väikese vao lähedal, S11 ise on pakitud lapikult vastu seda vagu (Wimberly et al 2000). Vt ka 

„S7“ ja struktuuri Lisa 1. Joonis 1(C). 

11

S12 

Koosneb globulaardomeenidest ja ühest pikenenud karboksüül- või aminoahelast, mis lubab 

valgul luua sidet 16S rRNA-ga. See ahel koob ennast läbi 16S rRNA keha ning pakkub seejärel 

lühikeseks alfa-heeliksiks, mis saab seejärel interakteeruda ja sideme luua S8 ja S17 valguga 

(Wimberly et al 2000). S12 on ka 30S subühiku dekodeerimiskeskuse kriitilise väärtusega 

komponent ning on seotud nii tRNA selektsiooni kui streptomütsiinvastuse kujundamisega (Vila- 

Sanjurjo et al. 2007). Nii S12 mutatsioonid kui valgu eemaldamine in vitro rekonstituteeritud 30S 

subühikutes viis suurenenud translatsioonilisele täpsusele, mis lubab oletada, et S12 suurendab 

translatsioonikiirust täpsuse hinnaga (Wilson ja Nierhaus 2005). Kowalak ja Walsh tuvastasid 

1996. aastal, et S12 on β-metüültioleeritud 88. positsioonis ehk asparagiinhappejäägi juures. Vt 

struktuuri Lisa 1. Joonis 1(C). 

S13 

Koosneb kolmest alfa-heeliksist, mis moodustavad ühe globulaardomeeni. Omab mitut 

pikenenud amino- või karboksüül-terminaalotsa, mis moodustavad heelikseid. S13 interakteerub 

mitmete r-valkudega: S3, S4, S5, S7, S8, S9, S11, S12, S17, S19 ja S21.(Wimberly et al. 2000) 

S14 

Moodustab klastri valkudega S3 ja S10. Mahub RNA auku ribosoomi peaosas, stabiliseerides 

selle struktuuri. S14 interakteerub lisaks S9 valgu C-terminaalse otsaga, nõnda moodustub side 

kahe subühiku vastasküljel asuva valgu vahel ning see aitab struktuuri kuju kindlustada. 

(Wimberly 2000). 

S15 

S15 on kõrge aluselisusega nelja alfa-heeliksi kogum. Ta seondub põhiliselt 16S rRNA 

tsentraalse domeeniga ja on vajalik nii 30S subühiku assambleerumiseks kui ka subühikute 

vaheliseks seondumiseks. Arvatakse, et tertsiaarstruktuur heeliksite 20, 21 ja 22 vahel on sõltuv 

S15 seondumisest. S15 on osaline ka translatsiooni regulatsioonis. (Agalarov et al. 2000; Nikulin 

et al. 2000). S15 on vajalik S18, S6, S11 ja S21 inkorporeerumiseks in vitro (Held et al. 1974; 

Traub ja Nomura 1969; Grondek ja Culver 2004), kuid teda kodeeriva geeni rpsO deletsioon 

12

akteri genoomist ei mõjutanud nimetatud valkude inkorporatsiooni in vivo (Bubunenko et al 

2006). 

S16 

Koosneb kahest alfa-heeliksist ja viiest beta-ahelast, mis paiknevad antiparalleelse/paralleelse 

lehena. Lähimad valgulised naabrid on primaarsed seostumisvalgud S4 ja S20. Kui need kaks on 

seondunud 16S rRNA-ga, võtab S16 koha sisse heeliks 21 lähedases lõhes. S16 seondumine 

põhjustab konformatsioonilise muutuse ribosoomis, viies ta sammu võrra lõplikule kujule 

lähemale (Held ja Nomura 1975; Allard 2000). 

S17 

S17 on vajalik väikese subühiku assambleerumisel ning aitab kaasa translatsioonilisele täpsusele. 

Valk koosneb viiest beta-ahelast, mis paiknevad antiparalleelse lehena. On pakutud, et S17 

põhifunktsioon on hoida 16S rRNA piirkond, kuhu ta seondub (heeliksid 7 ja 11), teatud kindlas 

konformatsioonis. Lisaks interakteerub S17 heeliks 21-ga ning moodustab ristsidemeid 

valkudega S4 ja S13. (Golden 1993) 

S18 

S18 koosneb neljast alfa-heeliksist ja on ümbritsetud polüpeptiidspiraalist. S18 muutub 

asjaosaliseks ribosoomi kasvamisel pärast S15 rRNA-le seondumist. Ta seondub S6-ga piki tolle 

beta-lehte ja moodustab ühenduse RNA selgrooga heeliksite 20, 21 ja 22 ülemises ühenduskohas. 

S18 interaktsioone S6-ga iseloomustavad van der Waals’i jõud ning soolasildade interaktsioonid. 

On pakutud, et S18 saab kokkupakkuda ainult siis, kui ta on S6-ga heterodimeeri moodustanud. 

S18 interakteerub lisaks veel valkudega S14, S11 ja S21. (Agalarov et al. 2000; Wimberly et al. 

2000). 

S19 

Sisaldab 93 aminohappejääki. Ta küll seondub 16S rRNA 3’ domeeniga, kuid ei suuda seda teha 

enne, kui S7 pole seondunud, moodustades vajaliku S19 seondumissaidi. S19 sekundaarstruktuur 

koosneb alfa-heeliksist ja kolmest beta-ahelast paralleel/antiparalleelse mustriga. Valgul on pikad 

sabad, mis on olulised teiste r-valkudega interaktsioonideks. (Helgstrand et al. 1999) 

13

S20 

See valk seondub 30S subühiku alumise osaga ning moodustab ristsideme S12-ga. Koosneb 

kolmest alfa-heeliksist, mis moodustavad ühe globulaardomeeni. (Wimberly et al. 2000) 

S21 

S21 on viimane valk, mis assambleeruva 30S subühikuga seondub. Tema sihtkohaks on 16S 

rRNA keskosa. S21 moodustab ristsidemeid S13, S11, S12 ja S18-ga. (Lambert et al. 1983; 

Sommer ja Traut 1976) S21 valku on lisaks vaja ka valgusünteesi initsieerimise täielikuks 

aktiviseerimiseks (Held ja Nomura 1974). 

1.1.9 50S subühiku ribosoomivalgud ja funktsioonid: 

L1 

Koosneb kahest domeenist, mis on väga olulised rRNA seondumisel. Esimese domeeni N- 

terminaalse regiooni otsas on kaheksane grupp paindlikke aminohappejääke, mis on otseselt 

seotud 23S rRNA seondumisega. Need aminohappejäägid asuvad kahe domeeni piirkonna vahel, 

mis võimaldab RNA-l siseneda ja seonduda. L1 paistab omavat sekundaarset rolli mRNA 

repressorina, kuid võib olla seotud ka peptidüültransferaasse aktiivsusega. (Nevskaya et al. 2000; 

Hernandez et al. 1977). Kristallograafilised ja krüo-elektronmikro-skoopilised uuringud on 

näidanud, et L1 varre liikumine võib kontrollida deatsetüleeritud tRNA kõrvaldamist ribosoomi 

E-saidist (Wilson ja Nierhaus 2005). 

L2 

Tegemist on ühe suurima 50S subühiku r-valguga, mille struktuuris on samuti kaks domeeni, mis 

kumbki sisaldavad umbkaudu 70 aminohapet. L2 on seotud 23S rRNA seondumise ja 

assambleerumisega ja arvatakse, et ka peptidüültransferaasse aktiivsusega. Kahe domeeni 

vaheline piirkond sisaldab kahte arginiini jääki (Arg86 ja Arg155), mis toimivad värava ning 

abistajana rRNA seondumisel. (Nakagawa et al 1999) 

L3 

14

L3 interakteerub 23S rRNA domeenidega II, IV, V ja VI ning valkudega L14 ja L24 (H. 

marismortui Ban et al. 2000). On oluline valk subühiku korrektseks assambleerumiseks, kuna 

23S rRNA foldimise ajal initsieerib ühe olulise iseseisva assambleerumiskeskuse loomist 

(Östergaard et al 1998). 

L4 

L4 on ka autogeenne transkriptsiooni ja translatsiooni regulaator S10 operonile, mis sisaldab 11 

geeni. (Worbs et al. 2000) On essentsiaalne valk 50S subühiku rekonstitutsiooni esimeses etapis 

(Kaczanowska et al. 2007). Vt struktuuri Lisa 1. Joonis 3(A). 

L5 

L5 on 5S rRNA seondumisvalk ja interakteerub 23S rRNA domeeniga V. Lisaks on ühenduses 

valguga S13 50S-30S sillal. (H. marismortui Ban et al. 2000) Vahendab ribosoomi 

assambleerumisel olulisi interaktsioone 23S ja 5S rRNA vahel ning on vajalik keskse kühmu 

korrektseks formatsiooniks (Korepanov et al. 2007) 

L6 

Omab kahte sarnast domeeni (nagu ka L1, L2 jt). C-terminaalne regioon interakteerub 23S 

rRNA-ga, N-terminaalne ots on aga seotud valk-valk seondumistega. (Spierer ja Zimmermann 

1976) 

L7/L12 

L7/L12 vars on valkude kompleks, mis on osaline valkude translatsiooni elongatsiooniprotsessis. 

L7/L12 kompleks esineb tetrameerina (Georgalis et al. 1989). Aminohappejärjestuselt on L7 ja 

L12 identsed, erinevus on vaid L7 jäägi atsetüleerimises (Noller ja Nomura 1996). L7/L12 on 

vajalikud EF-G-sõltuvas GTP hüdrolüüsis ja seega ka polüfenüülalaniini sünteesiks, kuid mitte 

peptidüültransferaasi aktiivsuseks (Hernandez et al 1977). L7/L12 saab jagada kolmeks 

funktsionaalseks regiooniks: esimene (N-terminaalne) vastutab valk-valk interaktsiooni ja 

dimerisatsiooni eest; teine (väga happeline C-terminaalne) parandab ribosoomi seondumist 

elongatsioonifaktoritega ning stimuleerib nende GTPaasset aktiivsust (Dey et al. 1995; Kischa et 

al. 1971); kolmas – liidese regioon (hinge-region) hõlbustab N- ja C-terminaalse domeeni 

15

iseseisvat liikumist (Wilson ja Nierhaus 2005). L7/L12 vajab ribosoomile assambleerumiseks 

valku L11 (Highland ja Howard 1975). Vt L7 struktuuri Lisa 1. Joonis 3(D). 

L9 

Omab kaht domeeni, mis on suure tõenäosusega osalised 23S rRNA interaktsioonides. L9 on 

ribosomaalse kompleksi kõige pikendatum valk, mille kaks domeeni on ühendatud helikaalse 

ühendava regiooniga. Võimalik, et mängib rolli ribosoomi assambleerumisel ja/või rRNA 

katalüütiliselt aktiivse konformatsiooni säilitamisel (Hoffman et al. 1997). 

L10 

L10 struktuur pole veel teada, kuid eeldatakse, et ta on L11 valgu jaoks tugivalk (H. Marismortui 

Ban et al 2000). 

L11 

L11 on kõrgelt konserveerunud valk, mis asub L7/L12 varre alusel ning omab C- ja N- 

terminaalset domeeni. L11 seondub 23S rRNA-ga kohas, mida nimetatakse L11-seondumise 

regiooniks (Van Dyke ja Murgola 2002), mis moodustab GTPase-associated keskuse. In vivo ja 

krüo-elektronmikroskoopia uuringud annavad alust arvata, et L11 ja tema N-terminaalne domeen 

mängivad olulist rolli peptiidi vabastamisel class-I release factor RF1 vahendusel. (Bouakaz et al 

2006) L11 omab olulist rolli L7/L12 assambleerumisel ribosoomi (Highland ja Howard 1975) 

ning on kaudselt seotud EF-G-sõltuva GTPaasi aktiivsusega. Samas, modifitseeritud L11 

inhibeerib tugevasti EF-G-sõltuvat GTP hüdrolüüsi, kuigi sellest inhibitsioonist on osaliselt 

võimalik üle saada ülehulgas L7/L12 valkude lisamisega. (Hernandez et al 1977) On avastatud ka 

lisaroll näljatingimustes, kus L11 tunneb ära ilma laenguta tRNA ning mõjub signaalvalguna 

poomisvastuse (stringent response) käivitamisel (Wilson ja Nierhaus 2005). 

L13 

L13 interakteerub 23S rRNA domeenidega II, V ja VI ning valkudega L3 ja L6. (H. marismortui 

Ban et al. 2000) On essentsiaalne valk 50S subühiku rekonstitutsiooni esimeses etapis 

(Kaczanowska et al. 2007) 

L14 

16

L14 on seotud kahe erineva 23S regiooni seondumisel, üks millest on seotud 

peptidüültransferaasi aktiivsusega ning teine asub ribosoomi GTP-seondumise regioonis. Seega 

peaks see valk stabiliseerima suure subühiku tsentraalset regiooni ja toetama ribosoomi korrektset 

kokkupakkimist arengu käigus. (Davies, White, Ramakrishnan 1996) 

L15 

L15 interakteerub 23S rRNA domeenidega I, II ja V ning valkudega L18 ja L32. (H. marismortui 

Ban et al. 2000) 

L16 

Kaudselt on leitud, et L16 on seotud ribosoomi GTP seondumise saidiga. Otseselt on L16 aga 

seotud EF-G-sõltuva GTPaasse aktiivsusega ning peptidüültransferaasi aktiivsusega (Hernandez 

1977). Mutatsioonid L16-s tekitavad resistentsuse ortomütsiinide avilamütsiin ja evernimitsiin 

vastu (Wilson ja Nierhaus 2005). 

L18 

L18 on 5S rRNA seondumisvalk ja interakteerub 23S rRNA domeenidega II ja V ning valkudega 

L5 ja L21. (H. marismortui Ban et al. 2000) Vahendab ribosoomi assambleerumisel olulisi 

interaktsioone 23S ja 5S rRNA vahel ning on vajalik keskse kühmu korrektseks formatsiooniks 

(Korepanov et al. 2007). Vt struktuuri Lisa 1. Joonis 3(C). 

L19 

L19 interakteerub 23S rRNA domeenidega II, III, IV ja VI. (H. marismortui Ban et al. 2000) 

L20 

L20 on üks viiest essentsiaalsest esimese 50S rekonstitutsioonietapi valgust. On puhtalt 

assambleerumisvalk, mis tähendab, et täiskasvanud subühikust võib ta kõrvaldada ilma et sellega 

kaasneks ribosoomiaktiivsusele mingit mõju. L20 represseerib iseenda geeni translatsiooni, 

seondudes kahele oma mRNA saidile (Guillier et al. 2000) ning omab pikka jätket, mille 

kõrvaldamisel valgust kannatab oluliselt suure subühiku assambleerumine (Guillier et al. 2005) 

L21 

17

L21 interakteerub 5S rRNA-ga ning 23S rRNA domeenidega II ja V ning valguga L18 (H. 

marismortui Ban et al. 2000). 

L22 

Sisaldab väikest domeeni, mis koosneb alfa-heeliksitest ja beta-lehtedest ning sisaldab lisaks 

suurt beta-lingu (ligi 30 Angstromi) (Unge et al 1998). Lingu suure pinna tõttu on L22 üks 

väheseid suure subühiku valke, mis suudab interakteeruda kõigi kuue 23S rRNA domeeniga. See 

on viinud järelduseni, et L22 on määrav valk suure subühiku folding mehhanismis ja kogu 

ribosoomis tervikuna. Võib reguleerida translatsiooni värsketele ahelatele seondumise kaudu. 

L22 on ka tundlik erütromütsiini suhtes, kuna see antibiootikum suudab seonduda valgu betajuuksenõelale 

peptidüültransferaasi regiooni lähedal (Wilson ja Nierhaus 2005) On essentsiaalne 

valk 50S subühiku rekonstitutsiooni esimeses etapis (Kaczanowska et al. 2007) 

L23 

L23 interakteerub 23S rRNA domeenidega I ja III ning valkudega L29 ja L39 (H. marismortui 

Ban et al. 2000). Moodustab ühe osa tunneli exit-saidist ning on vajalik interakteerumisel trigger 

factor-iga (TF)(Wilson ja Nierhaus 2005). 

L24 

L24 interakteerub 23S rRNA domeeniga I ning valguga L4 (Ban et al. 2000). L24 on üks viiest 

varase assambleerumise valkudest (Charollais et al 2003). Ta seondub 23S rRNA-ga 

rekonstitutsiooni varajases etapis ning seega mõjutab igasugune selle valgu modifikatsioon kõiki 

teisi rekonstitutsiooni etappe (Hernandez 1977). Nagu L3, initsieerib 23S rRNA pakkumise ajal 

ühe olulise iseseisva assambleerumiskeskuse loomist (Östergaard et al 1998). On essentsiaalne 

valk 50S subühiku rekonstitutsiooni esimeses etapis (Kaczanowska et al. 2007) 

L25 

Interakteerub 5S rRNA E-silmuse alaga (Dallas ja Moore 1997). Vahendab ribosoomi 

assambleerumisel olulisi interaktsioone 23S ja 5S rRNA vahel ning on vajalik keskse kühmu 

korrektseks formatsiooniks (Korepanov et al. 2007) 

18

L27 

On bakterispetsiifiline valk, mis võib osa võtta P-saidi tRNA aktseptor-stem’i paiknemisest ning 

ribosoomi recycling-faktori seondumisel 50S-le (Wilson ja Nierhaus 2005). Võtab osa nii 50S 

subühiku assambleerumisest kui peptidüültransferaasi tööst (Wower et al 1998). 

L29 

L29 interakteerub 23S rRNA domeeniga I ning valguga L23. (H. marismortui Ban et al. 2000) 

Paikneb tunneli exit-saidi lähedal ja võib moodustada osa signaali äratundmispartikli (signal 

recognition particle) seondumissaidist (Wilson ja Nierhaus 2005). 

L31 

L31 interakteerub 23S rRNA domeenidega III, IV ja VI. (H. marismortui Ban et al. 2000) 

L32 

Reguleerib iseenda geeni transkripti splaissimist ja translatsiooni (S. cerevisiae Vilardell ja 

Warner 1997) 

L33 

Paikneb 50S subühiku välimisel pinnal, koosnedes 49-66 aminohappejäägist ja on 

monometüleeritud (http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR001705; Kaczanowska et al. 

2007). 

L35 

Valk, mis rakus seondumata olekus inhibeerib ornitiini dekarboksülaasi, kuid võime kaob 

ribosoomi inkorporeerudes (Kashiwagi ja Igarashi 1987). 

L36 

L36 on väikseim valk 50S subühikus. Tema aminohappestruktuuris on järjestus, mis koosneb 

kolmest tsüsteiinist ja ühest histadiinist, mis omab võimet moodustada tetrahedraalset struktuuri 

Zn-ioonidega. Arvatakse, et L36 esindab evolutsiooniliselt ürgset transkriptsioonilist elementi. 

(Härd et al 2000) 

19

1.2 Ribosoomivalkude post-translatsioonilised modifikatsioonid 

Seni teadaolevad posttranslatsioonilised modifikatsioonid on toodud tabelis 1 (v.a. metioniinide 

eemaldamine). Tavalisim posttranslatsiooniline modifikatsioon on N-terminaalse metioniini 

eemaldamine. See toimub 56-st mõlema subühiku valgust 34-s (Arnold ja Reilly 1999) ning 

esineb kõige tihemini olukordades, kus aminohape, mis on 2. positsioonis, omab lühikest 

külgahelat (Sherman et al. 1985; Ben-Bassat et al. 1987). Arvatakse, et steeriliselt suured 

külgahelad ei võimalda valkude põkkumist/dokkimist metioniini aminopeptidaasi saiti. Kui 

alaniin on positsioonis 2 (21 juhtu), siis kaob metioniin alati. Metioniin on alati lõigatud kui 

leutsiin, proliin ja glütsiin on positsioonis 2. Samas, kui lüsiin, isoleutsiin, seriin, glutamiin, 

arginiin, asparagiinhape, türosiin, glutamiinhape, fenüülalaniin või valiin on positsioonis 2 (20 

juhtu), metioniin alati säilub. Kui seriin on positsioonis 2, nähakse neljal juhul viiest, et metioniin 

on lõigatud. 

Valgud S11, L3, L7/L12, L16 ja L33 on monometüleeritud (Brosius ja Chen 1976; Chen et al. 

1977; Colson et al. 1979; Terhorst et al 1972), L11 on üheksakordselt metüleeritud (Colson et al. 

1979). Valgud S5, S18 ja L12 on atsetüleeritud (Cumberlidge ja Isono 1979; Isono ja Isono 

1980). Atsetüleeritud L12 valk muutub L7 valguks ning nende kahe vormi suhe muutub 

kasvukiirusega (Ramagopal ja Subramanian 1975). R-valk S6 on modifitseeritud kuue 

glutamiinhappe jäägiga (Kang et al. 1989). Valgul S12 on tuvastatud modifikatsioonina β– 

metüültiolatsioon asparagiinhappe 88. positsioonis. (Kowalak ja Walsh 1996) ning valk L16 

omab lisaks metüülrühmale ühte teadmata modifikatsiooni (Arnold ja Reilly 1999). Ainus 

modifikatsioon, mille puudumine avaldub fenotüübis on r-valgu L3 metülatsioon (Kaczanowska 

et al. 2007). Selline mutant näitab üles vähenenud kasvu, tundlikkust külmale ning akumuleerib 

ribosoomi subühikute prekursormolekule (Colson et al. 1979; Lhoest ja Colson 1981). 

Umbes pooled S11 molekulidest sisaldavad isoaspartaati (David et al. 1999). Isoaspartüülsaite, 

kus aspartaahappe jääk seotakse tema C-terminuse poolse naabriga beta-karboksüülkülgahela 

kaudu, peetakse üldiselt vananevate valkude ebanormaalse modifikatsiooni tulemuseks. Enamasti 

vastab see tõele, kuid mitte S11 puhul. Isoaspartaati sisaldab logaritmilises faasis S11 umbes 30 

20

korda rohkem kui mõni teine E. coli valk, seega peab seda S11 modifikatsiooni pidama mingil 

moel eksponentsiaalses faasi bakterirakule oluliseks. (David et al. 1999) 

Võimalik, et ribosoomivalkude modifikatsioone on teisigi, kuid hetkel neid veel ei teata, nagu ei 

ole täielikult ära seletatud valgumodifikatsioonide roll. Samas viitab tõsiasi, et mitmed r-valgud 

on modifitseeritud ning mõned lausa mitmekordselt, et neil peab olema lisaks teadaolevatele 

rollidele mingi märkimisvärne mõju ribosoomi struktuurile ja/või funktsioonile. Näiteks võivad 

modifikatsioonid mõjutada ribosoomivalkude rRNA-le seondumise efektiivsust ning 

spetsiifilisust, kuid ka optimeerida ribosoomiligandide seondumissaite (Kaczanowska et al. 

2007). 

TABEL 1. Escherichia coli ribosoomivalkude modifikatsioonid 

Valk 

Modifikatsioon + selle asukoht 

S5.................................................Atsetüleerimine (A1) 

S6.................................................Glutamiinhappejääkide lisamine 

S11...............................................Monometülatsioon (A1); osaline modifikatsioon isoaspartaadiga 

S12...............................................β-metüültioleeritud (D88) 

S18...............................................Atsetüleerimine (A1) 

L3 ................................................Monometülatsioon (Q150) 

L7/L12.........................................Monometülatsioon 

L12 ..............................................Atsetülatsioon 

L11 ..............................................üheksa metülatsiooni 

L16 ..............................................Monometülatsioon; teadmata 

L33 ..............................................Monometülatsioon (A1) 

Andmed pärit Kaczanowska et al. 2007 

1.3 Ensüümid, mis ribosoomivalke modifitseerivad 

Tabelis 2 on ära toodud seni teadaolevad modifitseeritud valgud ning teadaolevad 

modifitseerivad ensüümid. 

21

S5 

Post-translatsiooniline atsetüleerimise viib läbi RimJ, mida varem kirjeldati kui S5 N- 

atsetüültransferaasi (Cumberlidge ja Isono1979), kuid pärast Roy-Chaudhuri et al. tööd leiti, et 

atsetüültransferaasi aktiivsuse eemaldamisel suudab RimJ endisel supresseerida S5 defekte, mis 

näitab, et see aktiivsus pole sõltuv atsetüültransferaassest aktiivsust ning RimJ nimetamine endise 

nime järgi pole õigustatud. RimJ assotsieerub ka pre-30S subühikutega, mis lubab eeldada, et 

RimJ omab kahte funktsiooni – r-valkude atsetüleerimisel ning ribosoomi assambleerumisel. 

(Roy-Chaudhuri et al. 2008) 

S6 

Glutamiinhappe jäägid lisatakse valgu Glu-Glu C-terminusele RimK poolt (Kang et al. 1989). 

Kui Glu-Glu järjestus muteerida Lys-Glu, Glu jääke ei lisatud. Kuna aga S6 omab C-terminaalset 

Glu-Glu järjestust vaid mõnes liigis (sh E.Coli), siis lubab see eeldada, et teistes liikides omab 

RimK homoloog mõnd muud funktsiooni. (Kang et al. 1989) 

S11 

Modifikatsiooniks on monometülatsioon, mida viib läbi metüültransferaas MeT_S11 (Thiele et al 

2009), kuid isoaspartaadi modifikatsiooni ensüüm pole teada. 

S12 

Beta-metüültiotransferaasse reaktsiooni viib läbi MeST_S12 (Thiele et al 2009) 

S18 

N-terminaalse alaniini atsetüleerimise viib läbi RimI. S5 ja L12, mis on samuti atsetüleeritud, ei 

ole RimI muteerumise korral mõjutatud, seega on RimI spetsiifiliselt vaid S18 atsetüleerimiseks. 

(Isono K, Isono S 1980) 

22

L3 

Monometülatsiooni viib läbi PrmB. Geeni prmB muteerimise tulemusena kadus L3- 

metüültransferaasi aktiivsus ning fenotüübiline efekt oli mõningane külmatundlikkus (Colson et 

al. 1979; Vanet et al. 1994). 

L7 

Valgust N-terminaalse aminorühma atsetüleerimise teel L12 moodustamise viib läbi valk RimL 

(Isono S ja Isono K 1981). 

L7/L12 

Varre monometülatsiooni viib läbi MeT_L7/L12 (Thiele et al 2009). 

L11 

Metüültransferaas PrmA trimetüleerib L11 N-terminaalseid lüsiini aminorühmi (Demirci et al. 

2008). Mutatsioonid seda ensüümi kdoeerivas prmA1 ja prmA3 lookustes põhjustavad 

vähemetüleerunud L11 teket, kuid peale metüülgruppide puudumise muud mõju need 

mutatsioonid ei oma (Vanet et al. 1994). 2004. aastal läbi viidud Cameron et al. töö T. 

thermophiluse’ga aga leidis, et vaba L11 on in vitro metülatsiooniks parem substraat kui 

ribosoomiseoseline L11, mistõttu autorid pakkusid välja, et metülatsioon võib mängida rolli 

ribosoomi assambleerumisel. 

L16 

Monometülatsiooni viib läbi metüültransferaas MeT_L16 (Thiele et al 2009) 

L33 

Monometülatsiooni viib läbi metüültransferaas MeT_L33 (Thiele et al 2009) 

23

TABEL 2. Ribosoomivalke modifitseerivad ensüümid. 

Valk Modifikatsioon Modifitseeriv ensüüm 

S5 atsetüleerimine RimJ 

S6 Glu-jääkide lisamine RimK 

S11 monometülatsioon MeT_S11 

S12 β-metüültioleerimine MeST_S12 

S18 atsetüleerimine RimI 

L3 monometülatsioon PrmB 

L7 atsetüleerimine RimL 

L7/L12 monometüleerimine MeT_L7/L12 

L11 trimetüleerimine PrmA 

L16 monometülatsioon MeT_L16 

L33 monometüleerimine MeT_L33 

2. EKSPERIMENTAALOSA 

2.1 Töö eesmärk 

Käesoleva eksperimentaalse töö eesmärk oli võrrelda statsionaarse ja eksponentsiaalse faasi 

Escherichia coli bakterirakkude ribosoomide 30S subühiku ribosoomivalkude 

modifikatsioonimustreid ehk näha, kas statsionaarse faasi ribosoomivalkudes on muutunud 

modifikatsioonimuster võrreldes eksponentsiaalse faasiga või mitte. 

2.2 Materjal ja metoodika 

2.2.1 Ribosoomide eraldamine 

Kasvatasime 100ml rikkas söötmes (2X YT) Escherichia coli K12 POP2136/pFOS1 tüve 

(genotüüp: F - glnV44 hsdR17 endA1 thi-1 aroB mal - cI857 lambdaPR) rakke 52 tundi, et saada 

statsionaarse faasi bakterirakud. Seejärel tsentrifuugisime rakud põhja 4000 rpm ja 4C juures 10 

minutit (kasutades Sorvall RC5 tsentrifuugi), kõrvaldasime supernatandi ning võtsime sademe 

üles 35ml 1X LLP-s (1X LLP: 25mM Tris pH8, 100mM MgCl 2 , 5 mM β-merkaptoetanool) ning 

lisasime 10µl Dnaas I (Fermentas) ja 10mg lüsotsüümi. Seejärel lüüsisime rakud French Press’iga 

24

(Thermo) rõhu 16 000 psi juures kolm korda. Tsentrifuugisime lüsaadi põhja 10 000 rpm ja 4C 

juures 15 minutit (RC5) ning seejärel kihitasime supernatandi 30ml 20% sahharoosipadja (1X 

LLP-s) peale ning tsentrifuugisime Ti-45 rootoriga (Beckman) 34 000 rpm ja 4C juures 18 tundi. 

Seejärel kõrvaldasime supernatandi ning lisasime sademele 1.5ml 1X LLP-d, lastes tal jää peal 

loksuda 3 tundi. Paralleelselt valmistasime kaks dissotsieerivat sahharoosilahust – 25% ja 10%, 

mis sisaldasid kumbki 1mM MgCl 2 1X LLP-s. Segasime need kaks lahust nõnda kokku, et tekiks 

10-25% gradient, võtsime jää peal loksunud sademe samas LLP-s üles ning pipeteerisime 

gradiendile. Kasutades rootorit SW-32 tsentrifuugisime seda 19 400 rpm ja 4C juures 17 tundi 

(ω 2 t = 2.56 x 10 11 ). Seejärel kogusime dissotsieerunud 30S ja 50S piigid, mis sadestasime 2.5 

mahuga etanoolis üleöö -20C juures. Tsentrifuugisime 1 tund 4000 rpm ja 4C juures (RC5), 

kallasime supernatandi ära ning pesime sadet 70% etanooliga 20 minutit 4000 rpm ja 4C juures 

(RC5). Seejärel kallasime supernatandi ära ning võtsime sademe üles klaastuubis 180µl 

destilleeritud H 2 0, 20µl 10X LLP ja 10µl 2M MgCl 2 lahuses ning lisasime 440µl jää-äädikat 

(0C), lasime 1 tund jääl loksuda. Seejärel tsentrifuugisime 15 minutit 5000 rpm ja 4C juures 

(RC5) klaastuubis. Võtsime supernatandi eraldi klaastuubi, lisasime sellele 5 mahtu 100% -20C 

juures hoitud atsetooni ning hoidsime -20C juures tund aega. Seejärel tsentrifuugisime 30 minutit 

5000 rpm ja 4C juures (RC5) klaastuubis ning kallasime supernatandi ära. Sadet 

pesime/tsentrifuugisime 3ml 80% atsetooniga 4000 rpm ja 4C juures klaastuubis. Kallasime 

supernatandi ära ning lasime sademel 30 minutit toatemperatuuril kuivada. Kuiva sademe 

võtsime üles 30µl värskelt valmistatud 7M uurea lahuses ning säilitasime -20C juures. 

2.2.2 Top-down tandem mass-spektromeetria (MS/MS) 

Mass-spektromeetrilised analüüsid sooritati LTQ Orbitrap mass-spektromeetril (Thermo 

Electron), mis oli ühendatud nano vedelik-kromatograafiga (Agilent 1200 nanoLC) ja nanoelektropihustus 

ionisatsiooniallikaga (Proxeon). Kromatograafiakolonniks oli isepakitud 150 mm 

(OD) x 75 µm (ID) nanoemitter (Proxeon), maatriksiks oli ReproSil-Pur C18-AQ, 120 A 

poorisuurusega 3 µm partiklid (Dr. Maisch). Valgud lahutati 135 minutilise 2-60% atsetonitriili 

gradiendiga 0.11% sipelghappes ning kolonnilt elueeritud valgud analüüsiti koheselt massspektromeetris. 

Mass-spektromeetri töötsükkel koosnes ühest laia massivahemikuga MS1 

mõõtmisest (m/z 400-1800, Orbitrap detektor, R=60000 @ m/z 400) ning sellele järgnevast 

kolmest prekursor-iooni MS2 fragmentatsioonispektri mõõtmisest (fragmenteerimine LTQ osas 

(CID), mõõtmine Orbitrap detektoris, R=15000 @ m/z 400), ioonide maksimaalsed 

25

akumulatsiooniajad olid 500 ms MS1 mõõtmise korral ja 2000 ms MS mõõtmise korral ning 

kogutav ioonide hulk 1000000 laengut MS1 mõõtmise korral ja 100000 laengut MS2 mõõtmise 

korral. Kõikidel mõõtmistel kasutati sisemist kalibratsiooni, kalibrantideks olid polüsiloksaanid 

massidega 445.12003, 462.14658 ja 519.13882 Da, mis tagas mõõtmistäpsuse

Otsingu tulemusena saime andmed võimalikest valguvormidest koos järgmiste andmetega: 

ID/geen, pikkus (aminohapetes), mass, massierinevus teoreetilise ja eksperimentaalse vormi 

vahel, PPM erinevus, b-ioonide hulk, y-ioonide hulk, kogu ioonide hulk. Lisaks kuvas 

kasutajaliides teoreetilise ja eksperimentaalse valguvormi kattuvad fragmendid ning võimalikud 

modifikatsioonid neis (joonised 5 ja 9). 

2.3 Tulemused 

Eraldatud 52 tunni statsionaarse faasi E. coli ribosoomide 30S subühiku analüüs LTQ Orbitrap 

mass-spektromeetril (Thermo Electron) andis meile tulemuseks 30S subühiku kromatogrammi 

(joonis 1) ning andmed seal esinevate piikide (valkude) prekursormolekulide ning 

fragmentatsiooniioonide kohta, mida me seejärel ProSight PTM 2.0 keskkonnas analüüsisime. 

Tulemused on esitatud tabelis 3 ning valkude L33 ja S6 kohta joonistel 2-9. 

Identifitseerisime 19 valku, neist 14 S-valku ning 5 L-valku. S-valkudest tuvastasime S4, S5, S6, 

S9, S10, S12, S13, S14, S15, S16, S17, S19 ja S22, L-valkudest L22, L24, L29, L32 ja L33. 

Metioniini olid kaotanud S-valgud S4, S5, S9, S13, S14, S15, S17, S19 ja S20 ning L-valgud 

L24, L32 ja L33, ülejäänutel oli see säilinud. 

Oksüdeeritud olid valgud S12, S19, S5 ja S6. 

Modifitseeritud olid valgud L33 ja S5. Valgud S6 ja S12, millel on varem modifikatsioone 

täheldatud eksponentsiaalses faasis (Kaczanowska et al. 2007), ei omanud meil modifikatsioone. 

Valkude täpsel identifitseerimisel lähtusime võimalikult väikesest massierinevusest (

Ootusväärtustele seatud orientiir 5 fragmenti, aluseks mass-spektromeetria töö, mille viisid läbi 

Macek et al. 2006) vastasid kõik tuvastatud 19 valku, seejuures S19 ja S12 vastasid selles osas 

alampiirile, kui teised seda ületasid. 

Identifitseerimise kvaliteet sõltus lõpp-etapis (ProSight PTM 2.0) võimalikult täpsest 

prekursormolekulide ning fragmentide valikust, kuid isegi ideaaltingimustel võib esineda 

mittevajalikku müra ning fragmente, mis kuuluvad ajaskaalal eelmisele või järgmisele 

prekursorile, mistõttu identifitseerimise matemaatiline tõenäosus ei ole 100%. 

28

Tabel 3. Tandem top-down orbitrap mass-spektromeetria meetodil ProSight PTM 2.0 

tarkvara abil identifitseeritud valgud. 

Identiteet Retentsiooniaeg Modifikatsioon 

Ootusväärtus 

(Expectation value) 

Massierinevus 

(Da) 

Sobivaid 

fragmente 

Mittesobivaid 

fragmente 

S22 M+ 29.68 - 1.72e-16 0.0283 13 32 

L32 M- 33.27 - 1.18e-14 0.0179 28 61 

S12 M- oks. 44.29 

β-metüültiolatsiooni (D88) ei 

tuvastanud 924 

15.9938 5 132 

L33 M- 38.22 metülatsioon (A1) 3.27e-32 0.0151 28 30 

S14 M- 50,11 - 520 -0,2237 15 136 

S20 M- 50,77 - 0,643 -0,2799 8 87 

L24 M- 52,01 - 19,8 -0,2692 10 94 

S19 M- oks. 54,06 - 705 16,3097 5 62 

S15 M- 57,68 - 80,1 -0,4657 16 186 

S17 M- 59,76 - 6,93E-19 0,0523 47 72 

S4 M- 61,92 - 5,68E-05 0,1309 16 54 

L22 M+ 66,02 - 0,000656 0,0041 16 45 

S16 M+ 66,56 - 5,05E-11 0,0374 14 44 

L29 M+ 71,12 - 4,70E-13 0,0715 17 14 

S10 M+ 75,14 - 0,000113 0,0912 12 41 

S13 M- 76,09 - 1,03E-11 0,1023 31 52 

S9 M- 79 - 5,01E-16 0,0676 81 152 

S5 M- oks. 81,65 Atsetülatsioon (A1) 0,256 16,0909 15 85 

S6 M+ oks. 95,66 

Glutamiinhappejääkide 

lisamist ei tuvastanud 3,23E-16 16,0979 45 74 

Joonis 1. Ribosoomi väikesest subühikust eraldatud ja kromatograafiliselt lahutatud valkude 

basepeak kromatogramm mass-spektromeetris mõõdetuna. 

29

Joonis 2. Ribosoomivalgu L33 laenguvormide jaotus massivahemikus m/z 400-1800. 

Joonis 3. Ribosoomivalgu L33 laenguvormi z=10 (m/z 626.37) sisse-suumitud isotoopjaotuse 

massi-spekter. 

30

Joonis 4. Ribosoomivalgu L33 dekonvolueeritud monoisotoopne mass. Dekonvolueerimine viidi 

läbi kasutades XtractAll funktsiooni tarkvarapaketis Xcalibur (Thermo Electron) kasutades 

joonisel 2 esitatud algandmeid. 

Joonis 5. Ribosoomi valgu L33 identifitseerimise ja modifitseerituse määramise tulemused 

Prosight PTM 2.0 keskkonnas. Joonisel on näidatud teoreetilise valguvormi pikkus, mass, 

massierinevus, ioonide arv ning metülatsioon 1. positsiooni alaniini jäägi juures. 

31

Joonis 6. S6 M+ (oksüdeeritud): massispekter. 

Joonis 7. Ribosoomivalgu S6 laenguvormi z=12 (m/z 1310.90) sisse-suumitud isotoopjaotuse 

massi-spekter. 

Joonis 8. Ribosoomivalgu S6 dekonvolueeritud monoisotoopne mass. Dekonvolueerimine viidi 

läbi kasutades XtractAll funktsiooni tarkvarapaketis Xcalibur (Thermo Electron) kasutades 

joonisel 6 esitatud algandmeid. 

32

Joonis 9. Ribosoomivalgu S6 identifitseerimise ja modifitseerituse määramise tulemused 

Prosight PTM 2 keskkonnas. Joonisel on näidatud teoreetilise valguvormi pikkus, mass, 

massierinevus, ioonide arv ning modifikatsioonide puudumine. 

2.4 Arutelu 

Me tuvastasime kokku 19 valku, millest 14 paiknevad 30S subühikus ning 5 suures subühikus. 

Kuna kasutasime 30S fraktsiooni, siis on loogiline S-valkude suur hulk, L-valkude esinemine 

proovis on aga tingitud 50S subühiku saastusest, kuna dissotsieerival gradiendil kahe subühiku 

eraldamise efektiivsus ei ole sajaprotsendilineTavalisim post-translatsiooniline modifikatsioon N- 

terminaalne metioniini kadumine esines S-valkudest kümnel juhul ning L-valkudest kolmel juhul, 

mis on vastavuses varasemate tulemustega (Arnold ja Reilly 1999). 

Modifitseeritavatest valkudest tuvastasime S5, S6, S12 ja L33, kusjuures S6 ja S12 ei omanud 

meie katses modifikatsiooni: S12 puhul ei olnud toimunud β-metüültiolatsiooni, S6 puhul ei 

täheldanud me Glu-jääkide lisandumist, mis on ühtlasi vastavuses ka Arnold ja Reilly 1999. aasta 

tööga, kes seda modifikatsiooni samuti ei kirjeldanud. 

S6 puhul ei täheldanud me mingit modifikatsiooni. Valgu identifitseerimine meie poolt just 

sellisel kujul on üsna täpne (tabel 3, joonised 6 – 9, seega ei saa tegemist olla meiepoolse vigase 

analüüsiga. Võimalik, et tegemist on modifikatsiooniga, mille esinemine ei ole konserveerunud 

ning kuna S6 ei oma ka teadaolevalt olulist rolli ribosoomi assambleerumisel/funktsioneerumisel, 

33

ei pruugi ka modifitseerumine erilist mõju omada. Modifitseerumine võib olla tüvespetsiifiline 

või sõltuda kasvutingimustest ning kasvukiirusest, mis seletaks ka, miks kirjandus on 

modifikatsiooni esinemise osas ebaühtlane (nt Arnold ja Reilly 1999 vs Kaczanowska et al. 

2007). 

S12 valgu 88. positsiooni asparagiinhappe β-metüültiolatsiooni puhul on aga ühtlaste tulemustega 

viiteid ning eksperimentaalseid tulemusi oluliselt rohkem, mistõttu võib tegemist olla 

mutatsiooniga β-metüültiolatsiooni läbiviiva ensüümi MeST_S12 geenis, mis seejuures pole ise 

veel identifitseeritud (Thiele et al. 2009), või ebaõnnestunud andmete tõlgendamise/töötlemisega. 

Tabel 3 põhjal võib seada kahtluse alla identifikatsiooni usaldusväärsuse, kuna kolmest 

määramisparameetrist (ootusväärtus, massierinevus, fragmentide sobivus) on usaldusväärseim 

massierinevus (mis viitab tuvastatud valgu oksüdeerumisele), kuid ootusväärtus on nõrgim üle 

kõigi 19 tuvastatud valgu ning sobivate fragmentide arv on alumisel piiril. Võttes arvesse S12 

modifitseerumise kohta käivaid artikleid, sealhulgas Kowalak ja Walsh’i 1996. aasta tööd, kus on 

kirjeldatud S12 ahela positsioonide 82-94 mutatsioonide konserveerumust (β-metüültiolatsioon 

toimub positsioonis 88), võiks eeldada, et antud juhul on meiepoolne valguidentifikatsioon 

ebatäielik. S12 omab translatsioonili täpsust reguleerivat rolli, mistõttu võimalik modifikatsiooni 

puudumine võib põhjustada rakule kahjulikke tagajärgi. Võimalik on ka tüvespetsiifilise 

modifikatsiooni olemasolu, kuid eelnevat arvesse võttes ei tundu see kuigi tõenäoline. 

S5 atsetülatsiooni ning L33 metülatsiooni osas aga oleme veendunud, et modifikatsiooni 

identifitseerimine on õnnestunud, sest esimesel juhul on sobivate fragmentide arv kolmekordselt 

ületatud ning massierinevus vastab antud valgumodifikatsioonile oksüdeerunud kujul (kuigi 

ootusväärtus jääb pisut soovitud 0.05-st kõrgemale), L33 puhul aga on sobivaid fragmente ligi 

pool kõigist fragmentidest (kõigist valkudest vaid L29 on selles osas üle) ning ootusväärtus kõige 

tugevam üle kõigi meie tulemuste (tabel 3). L33 kui ühe edukamalt identifitseeritud valgu 

massispekter, prekursormolekuli dekonvolueeritud massispekter, isotoopjaotuse spekter ning 

ProSight PTM 2.0 vastav otsingutulemus on toodud joonistel 2-5. 

Kuigi analoogselt S12 valetõlgendamisega võiks rangelt võttes S14, S15, S19 ja S20 

identifikatsiooni täpsuse kahtluse alla seada (ühegi identifikatisooniparameetri järgi pole S12-le 

siiski võrdset), pole kirjanduses neile valkudele kusagil modifikatsioone ennistatud, seega võib ka 

neid tulemusi usaldusväärseiks pidada. 

34

Ülejäänud valgud on aga täpse valguidentifikatsiooni läve veenvalt ületanud vähemalt kahe 

parameetriga ning saadud tulemused vastavad kirjanduses esitatule, seega pole põhjust eeldada, et 

neis modifitseerumine toimuda. 

Miks 30S subühiku valkudest pole esindatud täiskoosseis, võib tingitud olla massspektromeetriliste 

lahutustulemuste ebaühtlusest ning selle tagajärjel saadud ebakonkreetsest 

identifikatsioonist, 30S valgufraktsioni ebatäielikust valmistamisest või puhtalt 

identifikatsiooniprobleemidest, kuna valgufragmendid ei jaotu ajaskaalal ühtlaselt, mistõttu võib 

identifitseerimine olla ebatäielik. Mitmed prekursormolekulid ei andnud vastavate fragmentide 

spektrite kompileerimisel ProSight PTM 2.0-s mingit tulemust, mis just sellele viitab. Rohkemate 

valkude identifitseerimiseks tuleks katset korrata, kuigi täieliku valgunimekirja identifitseerimine 

võib osutuda keeruliseks (S1 detekteerimine, Arnold ja Reilly 1999). 

Kokkuvõtteks 

Meie eksperimendi tulemuste põhjal võib öelda et statsionaarse faasi 30S ribosoomi subühiku r- 

valgud omavad samu modifikatsioone kui eksponentsiaalses faasis, mõningased kõrvalekalded ei 

ole piisavalt usaldusväärsed, et olemasolevat informatsiooni ümber lükata. Tabelis 4 on välja 

toodud meie töö ehk statsionaarse faasi rakkude ribosoomide 30S subühiku r-valkude 

modifikatsioonid võrrelduna Lauri Peili sarnase tööga eksponentsiaalse faasi 30S r-valkude kohta 

ning Arnold ja Reilly 1999. aasta tööga, kus on selgelt näha, et andmed korreleeruvad 

statsionaarse faasi ja eksponentsiaalse faasi ribosoomivalkude vahel. 

35

Tabel 4. Statsionaarse faasi 30S subühiku valkude modifikatsioonid võrrelduna kahe 

eksponentsiaalse faasi 30S valkude modifikatsioonidega. 

30S statsionaarne faas 

(metioniin +/-, oksüdeeritus, 

modifikatsioon) 

Lauri Peil, avaldamata andmed 

30S eksponentsiaalne faas 

Arnold ja Reilly 1999, 50S + 30S 

(eksponentsiaalne faas) 

S4 M- S4 M- S4 M- 

S5 M- oks. Atsetülatsioon (A1) S5 M- atsetülatsioon (A1) S5 M- atsetülatsioon (A1) 

S6 M+ oks. S6 M+ 

S7 M- S7 M- 

S8 M- S8 M- 

S9 M- S9 M- S9 M- 

S10 M+ S10 M+ S10 M+ 

S12 M- oks. S12 M- β-metüültioleeritud (D88) S12 M- β-metüültioleeritud (D88) 

S13 M- S13 M- S13 M- 

S14 M- S14 M- S14 M- 

S15 M- S15 M- S15 M- 

S16 M+ S16 M+ S16 M+ 

S17 M- S17 M- S17 M- 

S18 M- atsetüleeritud (A1) S18 M- atsetüleeritud (A1) 

S19 M- oks. S19 M- S19 M- 

S20 M- S20 M- S20 M- 

S21 M- S21 M- 

S22 M+ S22 M+ S22 M+ 

L22 M+ L22 M+ 

L24 M- L24 M- L24 M- 

L25 M+ 

L25 M 

L28 M- L28 M- 

L29 M+ L29 M+ 

L31 M+ L31 M+ 

L32 M- L32 M- 

L33 M- metülatsioon (A1) L33 M- metülatsioon (A1) L33 M- metülatsioon (A1) 

L34 M- L34 M+ 

36

KOKKUVÕTE 

Meie uurimustöö eesmärgiks oli tuvastada erinevuste olemasolu statsionaarse ja eksponentsiaalse 

faasi E.coli bakterirakkude ribosoomivalkude modifikatsioonides. Läbiviidud eksperimentaalse 

töö tulemusena võib väita, et erinevusi nende kahe faasi 30S ribosoomivalkude modifikatsioonide 

vahel pole, mis tähendab, et E.coli-s ei ole ribosoomivalkude modifikatsioonid stressitingimuste 

poolt mõjutatud. See lubab ühest küljest järeldada, et ribosoomi kui ükskõik millise elusolendi 

rakule hädavajalik organelli komponendid – ribosoomivalgud - on resistentsed stressoritele, mis 

võib olla evolutsiooniliselt välja kujunenud, kuna rakk vajab kvaliteetseid valke ükskõik mis 

tingimustel; teisest küljest seda, et ribosoomivalkude modifikatsioonid ei mängi stressivastuse 

kujundamisel rolli. 

Ühtlasi veendusime nii kirjanduse kui eksperimentaalse töö tulemusena, et ribosoomivalkude 

modifikatsioonid ei ole tingimata konserveerunud. Seda demonstreeris S6 Glu-jääkide olemasolu 

puudumine, mille kohta on ka varasemates uurimustes samalaadset muutlikkust täheldatud. Β- 

metüültiolatsiooni puudumise osas valgul S12 oleme pigem seisukohal, et tegemist on 

meiepoolse identifitseerimisveaga, kuna kirjanduses on veenvalt kirjeldatud modifikatsiooni 

konserveerumust. Samas ei saa välistada, et edaspidised korduskatsed võiksid anda meie tööd 

toetavaid tulemusi. 

Statsionaarse faasi kogu modifikatsioonide hulk on paar korda suurem, kui meil õnnestus 

ühekordse katse ja vaid 30S subühiku analüüsimisel tuvastada, mistõttu ei saa sajaprotsendiliselt 

väita, et statsionaarne ja eksponentsiaalne faas ribosoomivalkude modifikatsioonide osas 

tingimata identsed oleksid, küll on aga nüüd rohkem põhjust seda arvata. 

37

SUMMARY 

Ribosomal proteins and their modifications in stationary phase Escherichia coli cells 

The aim of our work was to see whether the post-translational modifications in E.coli cells differ 

from those of the exponential phase. 

The bacterial 70S ribosome contains over fifty ribosomal proteins and among them, 11 posttranslational 

modifications, the significance of which is still unknown. We attempted to gather 

data of ribosomal protein modifications in stationary-phase 30S ribosomes. We extracted 30S 

ribosomes from E.coli and proceeded to identify the proteins it contained. Our results showed a 

number of proteins, from both the large and small subunit, that had not been modified, just as 

they were not in exponential-phase cells, as well as four proteins, that had or should have had 

modifications. The two results that conflicted previous data were that of S12 β-methylthiolation 

and S6 Glu-residues, both of which remained hidden from us. In the first case we might have run 

into identification errors but as for the S6, the mentioned modification doesn’t appear to be a 

conserved one according to various references. As a final note we conclude that bacterial E.coli 

ribosomal protein modification is not altered in stationary phase compared to exponential phase, 

however, further research is necessary to deem this indifference absolute. 

38

KIRJANDUSE LOETELU 

Agalarov SC, Sridhar Prasad G, Funke PM, Stout CD, Williamson JR. 2000. Structure of the 

S15,S6,S18-rRNA complex: assembly of the 30S ribosome central domain. Science. 2000 Apr 

7;288(5463):107-13. 

Alix J H, Hayes D, Nierhaus K N. 1979. Properties of ribosomes and RNA synthesized by 

Escherichia coli grown in the presence of ethionine. V. Methylation dependence of the assembly 

of E. coli 50S ribosomal subunits. J. Mol. Biol. 127:375-395. 

Allard P, Rak AV, Wimberly BT, Clemons WM Jr, Kalinin A, Helgstrand M, Garber MB, 

Ramakrishnan V, Härd T. 2000. Another piece of the ribosome: solution structure of S16 and its 

location in the 30S subunit. Structure. 2000 Aug 15;8(8):875-82. 

Amunugama R, Hogan J M, Newton K A, McLuckey S A. 2004. Whole Protein Dissociation in a 

Quadrupole Ion Trap: Identification of an a Priori Unknown Modified Protein. Anal. Chem., 

2004, 76 (3), pp 720–727. 

Arnold J, Reilly J P. 1999. Observation of Escherichia coli Ribosomal Proteins and Their 

Posttranslational Modifications by Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry 269, 105–112. 

Ban N, Nissen P, Hansen J, Moore PB, Steitz TA. 2000. The complete atomic structure of the 

large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science. 2000 Aug 11;289(5481):905-20. 

Baxter RM, White VT, Zahid ND. 1980. The modification of the peptidyltransferase activity of 

50-S ribosomal subunits, LiCl-split proteins and L16 ribosomal protein by pyridoxal phosphate. 

Eur J Biochem. 1980 Sep;110(1):161-6. 

Ben-Bassat A, Bauer K, Chang SY, Myambo K, Boosman A, Chang S. 1987. Processing of the 

initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase 

and its gene structure. J Bacteriol. 1987 Feb;169(2):751-7. 

Bollen A, Davies J, Ozaki M, Mizushima S. 1969. Ribosomal protein conferring sensitivity to the 

antibiotic spectinomycin in Escherichia coli. Science 165:85-86. 

39

Boni IV, Artamonova VS, Dreyfus M. The last RNA-binding repeat of the Escherichia coli 

ribosomal protein S1 is specifically involved in autogenous control. J Bacteriol. 2000 

Oct;182(20):5872-9. 

Bouadloun F, Donner D, Kurland CG. 1983. Codon-specific missense errors in vivo. EMBO J. 

1983;2(8):1351-6. 

Bouakaz L, Bouakaz E, Murgola E J, Ehrenberg M, Sanyal S. 2006. The role of ribosomal 

protein L11 in class-I release factor mediated translation termination and translational accuracy. J 

Biol Chem. 2006 Feb 17;281(7):4548-56. 

Brodersen D E, Clemons W M, Carter A P, Wimberly B T, Ramakrishnan V. 2002. Crystal 

structure of the 30 S ribosomal subunit from Thermus thermophilus: structure of the proteins and 

their interactions with 16S RNA. J. Mol. Biol. 316:725-768. 

Brosius J, Chen R. 1976. The primary structure of protein L16 located at the peptidyltransferase 

center of Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett. 68:105-109. 

Bubunenko M, Korepanov A, Court DL, Jagannathan I, Dickinson D, Chaudhuri BR, Garber 

MB, Culver GM. 2006. 30S ribosomal subunits can be assembled in vivo without primary 

binding ribosomal protein S15. RNA. 2006 Jul;12(7):1229-39. Epub 2006 May 8. 

Bubunenko M, Korepanov A, Court DL, Jagannathan I, Dickinson D, Chaudhuri BR, Garber 

MB, Culver GM. 2006. 30S ribosomal subunits can be assembled in vivo without primary 

binding ribosomal protein S15. RNA. 2006 Jul;12(7):1229-39. 

Chen R, Brosius J, Wittmann-Liebold B, Schäfer W.1977. Occurrence of methylated amino 

acids as N-termini of proteins from Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol. 111:173-181. 

Colson C, Lhoest J, Urlings C. 1979. Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichia 

coli. III. Map position of two genes, prmA and prmB, governing methylation of proteins L11 and 

L3. Mol Gen Genet. 1979 Feb 1;169(3):245-50. 

Colson C, Lhoest J, Urlings C. 1979. Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichia 

coli. III. Map position of two genes, prmA and prmB, governing methylation of proteins L11 and 

L3. Mol. Gen. Genet. 169:245-250. 

40

Culver G M. 2003. Assembly of the 30S ribosomal subunit. Biopolymers. 2003 Feb;68(2):234- 

49. 

Cumberlidge A G, Isono K. 1979. Ribosomal protein modification in Escherichia coli. I. A 

mutant lacking the N-terminal acetylation of protein S5 exhibits thermosensitivity. J. Mol. Biol. 

131:169-189. 

Dallas A, Moore PB. 1997. The loop E-loop D region of Escherichia coli 5S rRNA: the solution 

structure reveals an unusual loop that may be important for binding ribosomal proteins. Structure. 

1997 Dec 15;5(12):1639-53. 

David C L, Keener J, Aswad D W. 1999. Isoaspartate in Ribosomal Protein S11 of Escherichia 

coli. J Bacteriol. 1999 May; 181(9): 2872–2877. 

David C, Keener J, Aswad D W. 1999. Isoaspartate in ribosomal protein S11 of Escherichia coli. 

J. Bacteriol. 181:2871-2877. 

Davies C, White S W, Ramakrishnan V. 1996. The crystal structure of ribosomal protein L14 

reveals an important organizational component of the translational apparatus. Structure. 1996 Jan 

15;4(1):55-66. 

Fanning T G, Traut R R. 1981. Topography of the C. coli 5S RNA-protein complex as 

determined by crosslinking with dimethyl suberimidate and dimethyl-3,3'- 

dithiobispropionimidate. Nucleic Acids Res. 1981 Feb 25;9(4):993-1004. 

Georgalis Y, Dijk J, Labischinski H, Wills P R. 1989. The Tetrameric Form of Ribosomal Protein 

L7/L12 from Escherichia coli THE JOURNAL of Biological Chemistry. Vol. 264, No. 16, Issue 

of June 5, pp. 9210-9214. 

Golden B L, Hoffman D W, Ramakrishnan V, White S W. 1993. Ribosomal protein S17: 

characterization of the three-dimensional structure by 1H and 15N NMR. Biochemistry. 1993 

Nov 30;32(47):12812-20. 

Green R, Noller H F. 1996. In vitro complementation analysis localizes 23S rRNA 

posttranscriptional modifications that are required for Escherichia coli 50S ribosomal subunit 

assembly and function. RNA 2:1011-1021. 

41

Grondek J F, Culver G M. 2004. Assembly of the 30S ribosomal subunit: positioning ribosomal 

protein S13 in the S7 assembly branch. RNA. 2004 Dec;10(12):1861-6. 

Guillier M, Allemand F, Dardel F, Royer C, Springer M, Chiaruttini C. 2005. Double molecular 

mimicry in Escherichia coli: binding of ribosomal protein L20 to its two sites in mRNA is similar 

to its binding to 23S rRNA. Mol Microbiol 56:1441–1456. 

Hasan Demirci H, Gregory S T, Dahlberg A E, Jogl G. 2008. Multiple-Site Trimethylation of 

Ribosomal Protein L11 by the PrmA Methyltransferase. Structure. 2008 Jul;16(7):1059-66. 

Held W A, Nomura M. 1975. Escherichia coli 30 S Ribosomal Proteins Uniquely Required for 

Assembly. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 260, No. 8, Issue of April 25, pp. 3179- 

3134. 

Held W A, Ballou B, Mizushima S, Nomura M. 1974. Assembly mapping of 30 S ribosomal 

proteins from Escherichia coli. Further studies. J Biol Chem. 1974 May 25;249(10):3103-11. 

Held W A, Nomura M, Hershey JW. 1974. Ribosomal protein S21 is required for full activity in 

the initiation of protein synthesis. Mol Gen Genet. 1974;128(1):11-22. 

Held W A, Nomura M. 1975. Escherichia coli 30 S ribosomal proteins uniquely required for 

assembly. J Biol Chem. 1975 Apr 25;250(8):3179-84. 

Helgstrand M, Rak AV, Allard P, Davydova N, Garber MB, Härd T. 1999. Solution structure of 

the ribosomal protein S19 from Thermus thermophilus. J Mol Biol. 1999 Oct 8;292(5):1071-81. 

Hernandez F, Vazquez D, Ballesta J P G. 1977. Functional Roles of 50-S Ribosomal Proteins. 

Eur. J. Biochem. 78, 267 – 272. 

Hernández F, Vázquez D, Ballesta JP.1977. Functional roles of 50-S ribosomal proteins. Eur J 

Biochem. 1977 Aug 15;78(1):267-72. 

Highland J H, Howard G A. 1975. J. Biol. Chem. 250, 831 - 834 

Hosaka H, Nakagawa A, Tanaka I, Harada N, Sano K, Kimura M, Yao M, Wakatsuki S. 1997. 

Ribosomal protein S7: a new RNA-binding motif with structural similarities to a DNA 

architectural factor. Structure. 1997 Sep 15;5(9):1199-208. 

42

Härd T, Rak A, Allard P, Kloo L, Garber M. 2000. The solution structure of ribosomal protein 

L36 from Thermus thermophilus reveals a zinc-ribbon-like fold. J Mol Biol. 2000 Feb 

11;296(1):169-80. 

Isono K, Isono S. 1980. Ribosomal protein modification in Escherichia coli. II. Studies of a 

mutant lacking the N-terminal acetylation of protein S18. Mol Gen Genet. 1980;177(4):645-51. 

Isono S, Isono K. 1981. Ribosomal Protein Modification in Escherichia coli III. Studies of 

Mutants Lacking an Acetylase Activity Specific for Protein L12. Mol Gen Genet. 

1981;183(3):473-7. 

Isono I, Isono K. 1980. Ribosomal protein modification in Escherichia coli. II. Studies of a 

mutant lacking the N-terminal acetylation of protein S18. Mol. Gen. Genet. 177:645-651. 

Jiang M, Sullivan SM, Walker AK, Strahler JR, Andrews PC, Maddock JR. 2007. Identification 

of novel Escherichia coli ribosome-associated proteins using isobaric tags and multidimensional 

protein identification techniques. J Bacteriol. 2007 May;189(9):3434-44. Epub 2007 Mar 2. 

Jiang M, Sullivan S M, Walker A K, Strahler J R, Andrews P C, Maddock J R. 2007. 

Identification of novel Escherichia coli ribosome-associated proteins using isobaric tags and 

multidimensional protein identification techniques. J. Bacteriol. 189:3434–3444. 

Kaczanowska M, Ryde´n-Aulin M. 2007. Ribosome Biogenesis and the Translation Process in 

Escherichia coli. Microbiology And Molecular Biology Reviews, Sept. 2007, p. 477–494 Vol. 

71, No. 3. 

Kalpaxis D L, Karahalios P, Papapetropoulou M. 1998. Changes in Ribosomal Activity of 

Escherichia coli Cells during Prolonged Culture in Sea Salts Medium. J Bacteriol. 1998 June; 

180(12): 3114–3119. 

Kalurachchi K, Uma K, Zimmermann R A, Nikonowicz E P. 1997. Structural features of the 

binding site for ribosomal protein S8 in Escherichia coli 16S rRNA defined using NMR 

spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2139-44. 

43

Kang W K, Icho T, Isono S, Kitakawa M, Isono K. 1989. Characterization of the gene rimK 

responsible for the addition of glutamic acid residues to the C-terminus of ribosomal protein S6 

in Escherichia coli K12. Mol Gen Genet. 1989 Jun;217(2-3):281-8. 

Kashiwagi K, Igarashi K. 1987. Nonspecific inhibition of Escherichia coli ornithine 

decarboxylase by various ribosomal proteins: detection of a new ribosomal protein possessing 

strong antizyme activity. Biochim. Biophys. Acta 911 180-90. 

Klein D J, Moore P B, Steitz T A. The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and 

evolution of the large ribosomal subunit. J Mol Biol. 2004 Jun 25;340(1):141-77. 

Korepanov A P, Gongadze G M, Garber M B, Court D L, Bubunenko M G. 2007. Importance of 

the 5 S rRNA-binding ribosomal proteins for cell viability and translation in Escherichia coli. J 

Mol Biol. 2007 Mar 2;366(4):1199-208. 

Korepanov A, Gongadze G M, Graber M B, Court D L, Bubunenko M. 2007. Importance of the 

5S rRNA-binding ribosomal proteins for cell viability and translation Escherichia coli. J. Mol. 

Biol. 366:1199-1208. 

Kowalak J A, Walsh K A. 1996. β-Methylthio-aspartic acid: identification of a novel 

posttranslational modification in ribosomal protein S12 from Escherichia coli. Protein Sci. 

5:1625-1632. 

Kreider G, Brownstein B L. 1972. Ribosomal proteins involved in the suppression of 

streptomycin dependence in Escherichia coli. J. Bacteriol. 109:780-785. 

Lambert J M, Boileau G, Cover J A, Traut R R. 1983. Cross-links between ribosomal proteins of 

30S subunits in 70S tight couples and in 30S subunits. Biochemistry. 1983 Aug 2;22(16):3913- 

20. 

Lhoest J, Colson C. 1981. Cold-sensitive ribosome assembly in an Escherichia coli mutant 

lacking a single methyl group in ribosomal protein L3. Eur. J. Biochem. 121:33-37. 

Libby R T, Nelson J L, Calvo J M, Gallant J A. 1989. Transcriptional proofreading in Escherichia 

coli. EMBO J. 1989 Oct;8(10):3153-8. 

44

Lillemoen J, Cameron C S, Hoffman D W. 1997. The stability and dynamics of ribosomal protein 

L9: investigations of a molecular strut by amide proton exchange and circular dichroism. J Mol 

Biol. 1997 May 2;268(2):482-93. 

Macek B, Waanders L F, Olsen J V, Mann M. 2006. Top-down protein sequencing and MS3 on a 

hybrid linear quadrupole ion trap-orbitrap mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 2006 

May;5(5):949-58. 

Maki Y, Yoshida H, Wada A. 2000. Two proteins, YfiA and YhbH, associated with resting 

ribosomes in stationary phase Escherichia coli. Genes Cells. 2000 Dec;5(12):965-74. 

Maki Y, Yoshida H, Wada A. 2000. Two proteins, YfiA and YhbH, associated with resting 

ribosomes in stationary phase Escherichia coli. Genes Cells 5:965–974. 

Markus M A, Gerstner R B, Draper D E, Torchia D A. 1998. The solution structure of ribosomal 

protein S4 delta41 reveals two subdomains and a positively charged surface that may interact 

with RNA. EMBO J. 1998 Aug 17;17(16):4559-71. 

Mattheakis L C, Nomura M. 1988. Feedback regulation of the spc operon in Escherichia coli: 

translational coupling and mRNA processing. J Bacteriol. 1988 October; 170(10): 4484–4492. 

Mattheakis L C, Nomura M. 1988. Feedback regulation of the spc operon in Escherichia coli: 

translational coupling and mRNA processing. J Bacteriol. 1988 Oct;170(10):4484-92. 

Mears J A, Sharma M R, Gutell R R, McCook A S, Richardson P E, Caulfield T R, Agrawal R K, 

Harvey S C. 2006. A structural model for the large subunit of the mammalian mitochondrial 

ribosome. J Mol Biol. 2006 Apr 21;358(1):193-212. 

Mizushima S, Nomura M. 1970. Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from E. coli. 

Nature. 1970 Jun 27;226(5252):1214. 

Moore P B, Steitz T A. 2003. The structural basis of large ribosomal subunit function. Annu. 

Rev. Biochem. 72:813-850. 

45

Nakagawa A, Nakashima T, Taniguchi M, Hosaka H, Kimura M, Tanaka I. 1999. The threedimensional 

structure of the RNA-binding domain of ribosomal protein L2; a protein at the 

peptidyl transferase center of the ribosome. EMBO J. 1999 Mar 15;18(6):1459-67. 

Nashimoto H, Nomura M. 1970. Structure and function of bacterial ribosomes. XI. Dependence 

of 50S ribosomal assembly on simultaneous assembly of 30S subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA 67:1440-1447. 

Nashimoto H, Held W A, Kaltschmidt E, Nomura M. 1971. Structure and function of bacterial 

ribosomes. XII. Accumulation of 21S particles by some cold-sensitive mutants of Escherichia 

coli. J. Mol. Biol. 62:121-138. 

Nevskaya N, Tischenko S, Fedorov R, Al-Karadaghi S, Liljas A, Kraft A, Piendl W, Garber M, 

Nikonov S. 2000. Archaeal ribosomal protein L1: the structure provides new insights into RNA 

binding of the L1 protein family. Structure. 2000 Apr 15;8(4):363-71. 

Nevskaya N, Tishchenko S, Nikulin A, al-Karadaghi S, Liljas A, Ehresmann B, Ehresmann C, 

Garber M, Nikonov S. 1998. Crystal structure of ribosomal protein S8 from Thermus 

thermophilus reveals a high degree of structural conservation of a specific RNA binding site. J 

Mol Biol. 1998 May 29;279(1):233-44. 

Nikulin A, Serganov A, Ennifar E, Tishchenko S, Nevskaya N, Shepard W, Portier C, Garber M, 

Ehresmann B, Ehresmann C, Nikonov S, Dumas P. 2000. Crystal structure of the S15-rRNA 

complex. Nat Struct Biol. 2000 Apr;7(4):273-7. 

Nodwell J R, Greenblatt J. 1993. Recognition of boxA antiterminator RNA by the E coli 

antitermination factors NusB and ribosomal protein S10. Cell 72:261-268. 

Noller H F, Nomura M. 1996. Ribosomes, raamatus Escherichia coli and Salmonella: Cellular 

and Molecular Biology, Second Edition, edited by Neidhardt, F.C. American Society for 

Microbiology, Washington, D.C., Vol. 1, pp. 167-186. 

Nomura M, Gourse R, Baughman G. 1984. Regulation of the synthesis of ribosomes and 

ribosomal components. Annu Rev Biochem. 1984;53:75-117. 

46

Okada S, Okada T, Aimi T, Morinaga T, Itoh T. 2000. HSP70 and ribosomal protein L2: novel 

5S rRNA binding proteins in Escherichia coli. FEBS Lett. 2000 Nov 24;485(2-3):153-6. 

Old I G, Margarita D, Saint Girons I. 2006. Nucleotide sequence of the Borrelia burgdorferi 

rpmH gene encoding ribosomal protein L34. Nucleic Acids Res. 20 6097. 

Pardo D, Vola C, Rosset R. 1979. Assembly of ribosomal subunits affected in a ribosomal mutant 

of E coli having an altered L22 protein. Mol. Gen. Genet. 174:53-58. 

Petersson I, Hardy S, Liljas A. 1976. FEBS Lett. 64, pp. 135–138. 

Ramagopal S, Subramanian A R. 1975. Growth-dependent regulation in production and 

utilization of acetylated ribosomal protein L7. J. Mol. Biol. 94:633-641. 

Ramakrishnan V, White S W. 1992. The structure of ribosomal protein S5 reveals sites of 

interaction with 16S rRNA. Nature. 1992 Aug 27;358(6389):768-71 

Robert F, Brakier-Gingras L. 2003. A functional interaction between ribosomal proteins S7 and 

S11 within the bacterial ribosome. J Biol Chem. 2003 Nov 7;278(45):44913-20. 

Roy-Chaudhuri B, Kirthi N, Kelley T, Culver G M. Suppression of a cold-sensitive mutation in 

ribosomal protein S5 reveals a role for RimJ in ribosome biogenesis. 2008. Mol Microbiol. 

Jun;68(6):1547-59. 

Sadygov R G, Yates J R 3rd. 2003. A hypergeometric probability model for protein identification 

and validation using tandem mass spectral data and protein sequence databases. Anal Chem. 2003 

Aug 1;75(15):3792-8. 

Schuwirth B S, Borovinskaya M A, Hau C W, Zhang W, Vila-Sanjurjo A, Holton J M, Cate J H 

D. 2005. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science 310:827-834. 

Sengupta J, Agrawal R K, Frank J. 2001. Visualization of protein S1 within the 30S ribosomal 

subunit and its interaction with messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Oct 

9;98(21):11991-6. 

Sherman F, Stewart J W, Tsunasawa S. 1985. Methionine or not methionine at the beginning of a 

protein. Bioessays. 1985 Jul;3(1):27-31. 

47

Sommer A, Traut R R. 1976. Identification of neighboring protein pairs in the Escherichia coli 30 

S ribosomal subunit by crosslinking with methyl-4-mercaptobutyrimidate. J Mol Biol. 1976 Oct 

5;106(4):995-1015. 

Spierer P, Zimmermann R A. 1976. RNA-protein interactions in the ribosome. Binding of 

proteins L1, L3, L6, L13 and L23 to specific fragments of the 23S RNA. FEBS Lett. 1976 Sep 

15;68(1):71-5. 

Sykes M T, Williamson J R. 2009. A Complex Assembly Landscape for the 30S Ribosomal 

Subunit. Annu Rev Biophys. 2009;38:197-215. 

Terhorst C, Wittmann-Liebold B, Möller W. 1972. 50S ribosomal proteins. Peptide studies on 

two acidic proteins, A1 and A2, isolated from 50S ribosomes of Escherichia coli. Eur. J. 

Biochem. 25:13-19. 

Thiele I, Jamshidi N, Fleming R M T, Palsson B Ø. 2009. Genome-Scale Reconstruction of 

Escherichia coli's Transcriptional and Translational Machinery: A Knowledge Base, Its 

Mathematical Formulation, and Its Functional Characterization. PLoS Comput Biol. 2009 

Mar;5(3):e1000312. 

Torres M, Condon C, Balada J M, Squires C, Squires C L. 2001. Ribosomal protein S4 is a 

transcription factor with properties remarkably similar to NusA, a protein involved in both nonribosomal 

and ribosomal RNA antitermination. EMBO J. 20:3811-3820. 

Traub P, Nomura M. 1969. Structure and function of Escherichia coli ribosomes. VI. Mechanism 

of assembly of 30 s ribosomes studied in vitro. J Mol Biol. 1969 Mar 28;40(3):391-413. 

Unge J, berg A, Al-Kharadaghi S, Nikulin A, Nikonov S, Davydova N, Nevskaya N, Garber M, 

Liljas A. 1998. The crystal structure of ribosomal protein L22 from Thermus thermophilus: 

insights into the mechanism of erythromycin resistance. Structure. 1998 Dec 15;6(12):1577-86. 

Van Dyke N, Xu W, Murgola EJ. 2002. Limitation of ribosomal protein L11 availability in vivo 

affects translation termination. J Mol Biol. 2002 May 31;319(2):329-39. 

48

Vanet A, Plumbridge J A, Guérin M F, Alix J H. 1994. Ribosomal protein methylation in 

Escherichia coli: the gene prmA, encoding the ribosomal protein L11 methyltransferase, is 

dispensable. Mol Microbiol. 1994 Dec;14(5):947-58. 

Vila-Sanjurjo A, Lu Y, Aragonez J L, Starkweather R E, Sasikumar M, O'Connor M. 2007. 

Modulation of 16S rRNA function by ribosomal protein S12. Biochimica et Biophysica Acta 

(BBA) - Gene Structure and Expression. Volume 1769, Issues 7-8, July-August 2007, 462-471. 

Vilardell J, Warner J R. 1997. Ribosomal protein L32 of Saccharomyces cerevisiae influences 

both the splicing of its own transcript and the processing of rRNA. Mol. Cell. Biol. 17 1959-65. 

Wada A. 1998. Growth phase coupled modulation of Escherichia coli ribosomes. Genes Cells. 

1998 Apr;3(4):203-8. 

Wada A, Mikkola R, Kurland C G, Ishihama A. 2000. Growth phase-coupled changes of the 

ribosome profile in natural isolates and laboratory strains of Escherichia coli. J. Bacteriol. 

182:2893–2899. 

Wahl M C, Bourenkov G P, Bartunik H D, Huber R. 2000. Flexibility, conformational diversity 

and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein L12. EMBO J. 2000 Jan 

17;19(2):174-86. 

Wilson D N, Nierhaus K H. 2005. Ribosomal proteins in the spotlight. Crit Rev Biochem Mol 

Biol. 2005 Sep-Oct;40(5):243-67. 

Wimberly B T, Brodersen D E, Clemons W M Jr, Morgan-Warren R J, Carter A P, Vonrhein C, 

Hartsch T, Ramakrishnan V. 2000. Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature. 2000 Sep 

21;407(6802):327-39. 

Wimberly B T, White S W, Ramakrishnan V. 1997. The structure of ribosomal protein S7 at 1.9 

A resolution reveals a beta-hairpin motif that binds double-stranded nucleic acids. Structure. 

1997 Sep 15;5(9):1187-98. 

Wittmann H G, Littlechild J A, and Wittmann-Liebold B. 1980. Ribosomes (Chambliss, G., et 

al., Ed.), pp. 51–88. 

49

Worbs M, Huber R, Wahl M C. 2000. Crystal structure of ribosomal protein L4 shows RNAbinding 

sites for ribosome incorporation and feedback control of the S10 operon. EMBO J. 2000 

Mar 1;19(5):807-18. 

Wower I K, Wower J, Zimmermann R A. 1998. Ribosomal Protein L27 Participates in both 50 S 

Subunit Assembly and the Peptidyl Transferase Reaction. J Biol Chem, Vol. 273, Issue 31, 

19847-19852, July 31, 1998. 

Wower I K, Zwieb C W, Guven S A, Wower J. 2000. Binding and cross-linking of tmRNA to 

ribosomal protein S1, on and off the Escherichia coli ribosome. EMBO J. 2000 Dec 

1;19(23):6612-21. 

Zengel J M, Lindahl L. 1994. Diverse mechanisms for regulating ribosomal protein synthesis in 

Escherichia coli. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994;47:331-70. 

Østergaard P, Phan H, Johansson L B, Egebjerg J, Östergaad L, Porse B T, Garrett R A. 1998. 

Assembly of proteins and 5S rRNA to transcripts of the major structural domains of 23S rRNA. 

J. Mol. Biol. 284:227-240. 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID 

http://www.biochem.umd.edu/biochem/kahn/bchm465-01/ribosome/proteins.html 

http://www.ecosal.org/ecosal/modules/index.jsp?2.5.6 : 

https://prosightptm2.scs.uiuc.edu/ 

http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR001705 

50

LISA 1 

Lisa 1. Joonis 1. Thermus thermophilus’e ribosoomivalkude asukohad. (A) 16S rRNA 

sekunaarstruktuur nelja erivärvilise domeeniga: tsentraalne (lilla), 3’major (roheline), 3’ minor 

(kollane), 5’ (sinine). (B) 30S domeenide jaotus kahest vaatest (interface side – kontakteerub 

50S-ga; solvent side – tsütoplasmaatiline külg): pea, keha, platvorm (värvikood sama mis (A); 

tumedad osad on r-valgud, heledad rRNA. (C) R-valkude S12, S11, S7, S5, S4 paiknemine 30S 

subühikus. Joonis: Wilson ja Nierhaus 2005. 

51

Lisa 1. Joonis 2. Valgud S3, S4 ja S5 moodustavad mRNA-le sisenemisava ja tunneli. (A) 

Thermus thermophilus’e 30S subühiku ava moodustavad r-valgud tsütoplasmaatiliselt küljelt 

vaadelduna. A-saidis on referentsiks näidatud kolmenukleotiidiline mRNA. (B) Lähivaade 

valkude S3, S4, S5 tunnelmoodustusest ja referentsnukleotiidist (värvikood sama, mis (A). 

Joonis: Wilson ja Nierhaus 2005. 

52

Lisa 1. Joonis 3. Ribosoomivalkude α- ja β-struktuurid Haloarcula marismortui’s: (A) L4; (B) 

L18; (C) L30 ja (D) L7. Joonis: Klein, Moore ja Steitz 2004. 

53

Ribosoomivalgud ja nende modifikatsioonid statsionaarses faasis ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?