Том 2 №2 - Общество Ð‘Ð¸Ð¾Ñ‚ÐµÑ Ð½Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¾Ð² России им. Ю.А. Овчинникова

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2плазматических мембран проводили по высвобождениюортофосфата при ферментативном гидролизе 1 мМMg-ATP (1 мМ MgSO 4+ 1 мМ Na 2ATP) [7, 10, 11].Генерируемые АТРазой рН и мембранный потенциалрегистрировали с помощью флуоресцентных красителей9-амино-6-хлоро-2-метоксиакридина (ACMA) и бис(3-фенил-5-оксоизоксазол-4-ил)пентаметин оксонола(оксонол V), соответственно, на спектрофлуориметреМ850 (Hitachi, Япония), используя при определениирН длины волн возбуждения и эмиссии 415 и 485 нм,соответственно, и 609 и 640 нм – при определении Em,как описано ранее [7, 10, 11].В опытах по поглощению сукцината к 1 мл раствора,содержащего 0,25 мМ сахарозу, 10 мМ MES-NaOH, 1 мМ Na 2АТР, 1 мМ MgSO 4, рН 6,5, добавляливезикулы и инкубировали при 30 °С 1–3 мин. Затемтуда же вносили раствор [ 14 C]сукцината, доведенныйNaOH до рН инкубационной среды. Вновь инкубировалив течение 0,5–5 мин., после чего разводили в 10раз холодным раствором 0,25 мМ сахарозы в 10 мМMES-NaOH, рН 6,5 и отфильтровывали везикулы черезпредварительно смоченные тем же буфером стекловолокнистыефильтры GF/F (Whatman, Великобритания)в установке для фильтрования (Millipore, США) придавлении 20–30 см рт. столба. Фильтры с везикуламидважды промывали 10 мл холодного раствора 0,25 мМсахарозы в 10 мМ MES-NaOH, pH 6,5, после чего ихсушили. Радиоактивность [ 14 C]сукцината на фильтрах(в импульсах в секунду) измеряли на счетчике фирмы«Intertechnique» (Франция).Рис. 1. Действие сукцината, нитрата и сульфата натрияна АТР-зависимое образование рН на плазмалеммеS. cerevisiae. Масштаб флуоресценции (F/F) указанв процентах. Добавлены до Mg-ATP (указана конечнаяконцентрация): 10 мМ NaNO 3; 10 мМ Na 2SO 4;0,2 мМ сукцинат натрия. Стрелками указано внесение(до конечной концентрации) 1 мМ Mg-ATP, 1 мМNaNO 3и сукцината (цифрами обозначена его концентрацияв мМ)Результаты и их обсуждениеВ экспериментах по изучению транспорта сукцинатас помощью флуоресцентных методов было показано,что при добавлении 1 мМ Mg-ATР к везикулам наблюдаетсягашение флуоресценции АСМА (рис. 1) и оксонолаV (рис. 2). Это свидетельствовало об образовании намембране pH (кислый внутри) и Em (положительныйзаряд внутри), соответственно. Натриевые соли сукцината,нитрата и сульфата добавляли или до Mg-ATР, когда H+ еще был не создан, или после внесения субстратаATРазы, когда оба компонента H+, рН и Е m, былисформированы.Использованные анионы обладали различнымдействием на формирование H+. Нитрат, являющийсяпроникающим анионом, стимулировал формированиерН (pиc. 1) и практически полностью разрушал Е m(pиc. 2). В отличие от него сукцинат вызывал уменьше-18Рис. 2. Действие сукцината, нитрата и сульфата натрияна АТР-зависимое образование E mна плазмалеммеS. cerevisiae. Масштаб флуоресценции (F/F) указанв процентах. Добавлен до Mg-ATP: 2 мМ NaNO 3.Стрелками указано внесение (до конечной концентрации)1 мМ Mg-ATP, 2 мМ NaNO 3, 10 мМ Na 2SO 4и 2 мМ сукцината