Том 2 №2 - Общество Ð‘Ð¸Ð¾Ñ‚ÐµÑ Ð½Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¾Ð² России им. Ю.А. Овчинникова

Т.Р. Саматов и др., с. 45–49образом, разработанный подход позволяет исследователюизбежать значительных потерь содержимого геннойбиблиотеки.Экспериментальная схема клонирования и экспрессиигенов в молекулярных колониях, реализованнаяна примере гена GFP, приведена на рисунке 1. Послепроведения ПЦР полиакриламидный гель промываютв спиртово-солевом растворе, затем в 50% этаноле ивысушивают. В процессе этой обработки из геля вымываютсянизкомолекулярные вещества, а ДНК остаетсяв виде компактных колоний. Данный способ можно использоватьдля того, чтобы в одном и том же геле последовательнопроводить несколько реакций, оптимальныеусловия которых сильно различаются. В частности, такимобразом нам удалось освободить гель от компонентовсмеси для ПЦР, ингибирующих синтез белка.Далее гель пропитывают бесклеточной системойтранскрипции-трансляции. В указанной работе (Samatovet al., 2005) [19] использовали систему на основе пшеничногоэкстракта и гель инкубировали при 25 °С. Впроцессе инкубации детектировали флуоресценциюновосинтезированного GFP в геле с использованиемлазерного сканера микрочипов.Как можно видеть на рисунке 2, изображениягелей, полученные при детекции флуоресценции и пригибридизации колоний ДНК с радиоактивным зондом,практически совпадают. Это означает, что флуоресцируютмолекулярные колонии, содержащие ген GFP, тоесть экспрессия in situ привела к образованию функциональноактивного белка. Колонии содержат в среднем10 9 молекул зрелого GFP (40 пг/мм 2 ), то есть около 10молекул белка на молекулу матричной ДНК (Samatov etal., 2005) [19]. Такого количества белка достаточно дляего обнаружения in situ по связыванию с антителами илилигандами, а также по его ферментативной активности.Рис. 1. Схема эксперимента по размножениюи экспрессии генов в молекулярных колонияхЭкспрессия в молекулярных колониях:генетический дисплейСинтез белка в молекулярной колонии и его детекцияпо функциональной активности означали созданиепервого бесклеточного метода клонирования генов,позволяющего проводить скрининг клонов по свойствамкодируемых продуктов экспрессии (Samatov et al., 2005)[19].Рис. 2. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях.После ПЦР в геле провели транскрипцию-трансляцию.Регистрировали флуоресценцию GFP (слева),а затем в том же геле детектировали колонии ДНК,содержащие ген GFP (справа)47