Том 2 №2 - Общество Ð‘Ð¸Ð¾Ñ‚ÐµÑ Ð½Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¾Ð² России им. Ю.А. Овчинникова

ОбзорыУДК 616-092:612.6.05]-07:577.21Клонирование и экспрессия геновв молекулярных колонияхТ.Р. САМАТОВ, Е.В. ЧЕТВЕРИНА, А.Б. ЧЕТВЕРИН *Институт белка РАН, Пущино, Московская областьКлонирование генов in vivo и in vitroОбщепринятый метод клонирования генов включаетв себя встраивание гена в векторную молекулу итрансформацию бактериальных клеток полученной генетическойконструкцией (клонирование in vivo). При этомв одну клетку попадает и далее размножается не болееодной рекомбинантной молекулы ДНК. В результатеразмножения в селективных условиях на твердой агаризованнойсреде (на чашке Петри) образуются колониибактерий, представляющие собой потомство единичныхклеток, то есть клоны. Помимо исследуемого гена, бактериальныеклоны содержат компоненты самих клеток,что обуславливает необходимость последующей очисткиинтересующей исследователя ДНК с целью полученияпрепарата, пригодного для анализа и дальнейших манипуляций.Использование живых клеток для клонированиягенов имеет и другие недостатки. Так, продолжительностьэксперимента определяется скоростью роста клетоки может составлять до нескольких суток. Кроме того,в процессе клонирования исследуемый ген неизбежноподвергается естественному отбору. И, наконец, однимиз наиболее существенных ограничений является эффективностьвстраивания генов в вектор и собственнотрансформации: в клетки проникает и затем дает началоиндивидуальным клонам от 0,0001 до 0,01% исходногопрепарата ДНК (содержимого генной библиотеки)(Roberts & Ja, 1999).К настоящему моменту описан ряд бесклеточныхподходов, с использованием которых в принципе можно* Автор для переписки:© 2006 г. Четверин Александр Борисович,д.б.н., член-корреспондент РАН, заведующий лабораториейбиохимии вирусных РНК Института белка РАН142290 Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 4Тел.: (496) 773-2524Факс: (495) 632-7871E-mail: alexch@vega.protres.ruполучить индивидуальные клоны и которые лишены вышеперечисленныхнедостатков. Эти подходы основанына той идее, что при истощающем разведении экспериментальногообразца в одном сортировочном компартментеокажется единичная молекула исследуемой геннойбиблиотеки. В качестве компартментов могут выступать,например, реакционная ячейка (Lukyanov et al., 1996[10]; Vogelstein & Kinzler, 1999 [22]), элемент микрочипа(Chetverin & Kramer, 1994) [4], микрошарик (Brenneret al., 2000) [3] или капля водно-масляной эмульсии(Tawfik & Griffiths, 1998 [21]; Dressman et al., 2003[7]). В результате размножения ДНК с использованиембесклеточной системы, например, ПЦР, данный компартментс некоторой долей вероятности будет содержатьмолекулярный клон. Однако сами разработчики этихметодов вынуждены в каждом случае проверять чистотуполученных клонов при помощи обычного клонированияс использованием векторов и живых клеток.Функциональный скрининг генов in vitroВажным компонентом бесклеточной биотехнологииявляется функциональный скрининг генных библиотек,то есть отбор из множества последовательностейименно тех, продуктами экспрессии которых являютсябелки с искомыми свойствами. В основе такого скринингалежит технология бесклеточных генетических дисплеев.Их суть заключается в том, что в результате экспрессиигенной библиотеки in vitro новосинтезированный белококазывается связанным с кодирующей его молекулойнуклеиновой кислоты. Исследователь осуществляетселекцию ДНК или РНК по свойствам синтезированногопродукта и вместе с этим продуктом автоматическивыделяет соответствующий генотип.Среди бесклеточных генетических дисплеев можновыделить несколько основных групп. В одной из них новосинтезированныйполипептид оказывается связаннымс кодирующей его мРНК. Связь может быть нековален-45