Procedimiento - Inova Diagnostics
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NOVA Lite TM IgG F-Actin 708250<br />
Solo para exportación. No comercializable en Estados Unidos.<br />
Para uso diagnóstico in vitro.<br />
Complejidad CLIA: Alta.<br />
Uso previsto<br />
El kit NOVA Lite TM IgG F-Actin es un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) sobre sustrato<br />
epitelial de intestino de rata para la detección y la determinación semicuantitativa de anticuerpos IgG<br />
anti-actina F en suero humano. La presencia de anticuerpos IgG anti-actina F puede utilizarse en<br />
combinación con los resultados clínicos y otras pruebas de laboratorio para contribuir al diagnóstico de<br />
enfermedades hepáticas autoinmunes, como la hepatitis autoinmune (AIH) y la cirrosis biliar primaria<br />
(PBC).<br />
Resumen y explicación de la prueba<br />
Los autoanticuerpos IgG anti-actina F son el componente principal de los denominados anticuerpos antimúsculo<br />
liso (ASMA). 1-6 Estos anticuerpos se encuentran en hasta el 80 % de los pacientes con hepatitis<br />
autoinmune (AIH) y en hasta el 30 % de los pacientes con cirrosis biliar primaria, 2,6 pero también pueden<br />
hallarse, generalmente en títulos bajos, en personas sin AIH. Los ASMA son heterogéneos y<br />
comprenden anticuerpos contra las formas filamentosa (F) y globular (G) de la actina, además de<br />
componentes no actínicos como la tubulina y los filamentos intermedios. 3,4,7 Existen varios<br />
autoanticuerpos asociados a la AIH. Sin embargo, los anticuerpos IgG anti-actina F son los<br />
autoanticuerpos más específicos para la AIH. 2,5<br />
Aunque los análisis ELISA para IgG anti-actina F, como el ELISA QUANTA Lite Actin IgG, permiten<br />
detectar anticuerpos IgG anti-actina F de una manera objetiva y cuantificable, algunos laboratorios<br />
prefieren la metodología IFA para detectar anticuerpos IgG anti-actina F o para confirmar su presencia<br />
cuando son detectados mediante los habituales cortes tisulares de riñón/estómago/hígado (KSL). A<br />
menudo resulta difícil diferenciar los anticuerpos anti-actina F de otros anticuerpos anti-músculo liso<br />
utilizando sustratos de IFA convencionales como los cortes tisulares de KSL. 2,5 La identificación de los<br />
anticuerpos anti-actina F constituye una ayuda importante en el diagnóstico de la AIH. Actualmente no<br />
está disponible ningún método estándar de referencia para distinguir los anticuerpos anti-actina F de<br />
otras reactividades. 1,2 Los portaobjetos de células epiteliales de intestino de rata preparadas con<br />
métodos patentados de crecimiento y fijación proporcionan un nuevo sustrato para la detección de<br />
anticuerpos IgG anti-actina F mediante IFA. Este sustrato supera algunas de las limitaciones de otros<br />
procedimientos de IFA, puesto que el patrón de IgG anti-actina F es inequívoco y todos los anticuerpos<br />
que generan un patrón de interferencia en los portaobjetos de KSL no interfieren con el sustrato de<br />
células epiteliales de rata.<br />
Principios del procedimiento<br />
En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con el sustrato antigénico y los<br />
anticuerpos no unidos se eliminan mediante lavado. El sustrato se incuba entonces con un conjugado<br />
específico marcado con fluoresceína y, a continuación, se efectúa un lavado para eliminar el reactivo no<br />
unido. Al observarlas en un microscopio de fluorescencia, las muestras presentarán una fluorescencia<br />
de color verde manzana correspondiente a las zonas a las que se ha unido el autoanticuerpo. Se<br />
considera que una muestra es positiva si se observa tinción específica en las fibras de actina F que<br />
rodean a la mayor parte de las células según un patrón hexagonal y, a veces, en las fibras que van de<br />
una célula a otra.<br />
Reactivos<br />
1. Portaobjetos con actina F; 12 pocillos/portaobjetos, con desecante.<br />
2. Conjugado de anti-IgG humana (de cabra), marcado con fluoresceína en un tampón que<br />
contiene azul de Evans y un 0,09 % de azida de sodio.<br />
3. Control positivo de IgG anti-actina F; 1 vial de tampón que contiene un 0,09 % de azida de sodio<br />
y anticuerpos de suero humano anti-actina F; prediluido.<br />
4. Control negativo del sistema IFA; 1 vial de tampón que contiene un 0,09 % de azida de sodio y<br />
no contiene anticuerpos de suero humano anti-actina F; prediluido.<br />
5. Concentrado de PBS (40x).<br />
6. Medio de montaje, 0,09 % de azida de sodio.<br />
7. Cubreobjetos.<br />
Advertencias<br />
1. Todo el material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto<br />
ha sido analizado y ha producido un resultado negativo con respecto a la presencia de<br />
anticuerpos del VIH, el HBsAg y el VHC, según métodos aprobados por la FDA. Sin embargo,<br />
ningún método de análisis puede ofrecer plenas garantías de la ausencia del VIH, el VHB, el<br />
VHC u otros agentes infecciosos. Por tanto, el control positivo de IgG anti-actina F y el control<br />
negativo del sistema IFA deben tratarse de la misma manera que si fueran materiales<br />
potencialmente infecciosos. 8<br />
1
2. Se utiliza azida de sodio como conservante. La azida de sodio es una sustancia venenosa y<br />
puede resultar tóxica si se ingiere o si se absorbe a través de la piel o los ojos. La azida de sodio<br />
puede reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías y formar azidas metálicas<br />
potencialmente explosivas. Si utiliza las pilas de lavado para eliminar reactivos, aclare con<br />
abundante cantidad de agua para evitar la formación de azidas metálicas.<br />
3. Utilice un equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con los reactivos<br />
suministrados.<br />
4. Los vertidos de reactivos deben limpiarse inmediatamente. Cumpla todas las normas estatales y<br />
locales sobre protección del medio ambiente para la eliminación de residuos.<br />
Precauciones<br />
1. Este producto está destinado a uso diagnóstico in vitro.<br />
2. La sustitución de los componentes suministrados con este kit por otros diferentes puede dar<br />
lugar a resultados incoherentes.<br />
3. Un lavado incompleto o ineficaz de los pocillos del IFA puede generar valores de fondo elevados.<br />
4. La adaptación total o parcial de este análisis para utilizarlo con procesadores automáticos de<br />
muestras y otros dispositivos de manipulación de líquidos puede producir diferencias en los<br />
resultados del análisis con respecto a los resultados obtenidos siguiendo el procedimiento<br />
manual. Es responsabilidad de cada laboratorio comprobar que el procedimiento automático<br />
empleado da unos resultados que se encuentran dentro de los límites aceptables.<br />
5. Existen varios factores que influyen en el rendimiento del análisis: la temperatura inicial de los<br />
reactivos, la potencia de la lámpara utilizada por el microscopio, la precisión y la reproducibilidad<br />
de la técnica de pipeteado, la exhaustividad del lavado y los tiempos de incubación durante el<br />
ensayo. Es necesario mantener la máxima coherencia durante el análisis para obtener<br />
resultados precisos y reproducibles.<br />
6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo indicado.<br />
Condiciones de almacenamiento<br />
1. Almacene todos los reactivos del kit a 2-8 °C. No los congele. Los reactivos permanecen<br />
estables hasta la fecha de caducidad si se almacenan y manipulan como está indicado.<br />
2. El tampón de PBS diluido permanece estable durante 4 semanas a 2-8 °C.<br />
Recogida de muestras<br />
Este procedimiento debe realizarse con una muestra de suero. La adición de azida u otros conservantes<br />
a las muestras del análisis puede afectar de manera negativa a los resultados. No deben utilizarse<br />
muestras contaminadas con microorganismos, tratadas con calor, muy hemolizadas o lipémicas que<br />
contengan partículas visibles.<br />
Tras la recogida, el suero debe separarse del coágulo. El documento H18-A3 del NCCLS recomienda<br />
las siguientes condiciones de almacenamiento para las muestras: 1) No guarde las muestras a<br />
temperatura ambiente por más de 8 horas. 2) Si el análisis no se efectúa en un plazo de 8 horas,<br />
refrigere las muestras a 2-8 °C. 3) Si el análisis no va a realizarse en un plazo de 48 horas o si debe<br />
preparar las muestras para enviarlas, congélelas a una temperatura de –20 °C o inferior. Las muestras<br />
congeladas deben mezclarse bien después de descongelarse y antes del análisis.<br />
<strong>Procedimiento</strong><br />
Materiales suministrados<br />
5 Portaobjetos con 12 pocillos de actina F.<br />
1 7 mL de conjugado de anti-IgG humana FITC.<br />
1 0,8 mL de control positivo de IgG anti-actina F.<br />
1 0,5 mL de control negativo del sistema IFA.<br />
2 25 mL de concentrado de PBS (40x).<br />
1 7 mL de medio de montaje.<br />
1 Envase con 10 cubreobjetos.<br />
Materiales adicionales necesarios no suministrados<br />
Micropipetas para dispensar un volumen de 15-1.000 μL.<br />
Agua destilada o desionizada.<br />
Botellas comprimibles o pipetas Pasteur.<br />
Cámara de humedad.<br />
Recipiente de 1 L (para diluir el PBS).<br />
Frasco Coplin.<br />
Microscopio de fluorescencia con excitador de 495 nm y filtro de barrera de 515 nm.<br />
2
Método<br />
Antes de comenzar<br />
1. Lleve todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (20-26 o C).<br />
2. Diluya el concentrado de PBS. IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS a 1:40 añadiendo<br />
el contenido de la botella de concentrado de PBS a 975 mL de agua destilada o desionizada y<br />
mezcle completamente. El tampón de PBS se utiliza para diluir las muestras de los pacientes y<br />
como tampón de lavado. La muestra diluida puede almacenarse hasta 4 semanas a 2-8 °C.<br />
3. Diluya las muestras de los pacientes:<br />
a. Detección inicial: Diluya las muestras de los pacientes al 1:40 con tampón de PBS diluido<br />
(es decir, añada 50 μL de suero a 1,95 mL de tampón de PBS).<br />
b. Titulación: Realice sucesivas diluciones a la mitad partiendo de la dilución inicial de<br />
detección para todas las muestras positivas con tampón de PBS (es decir, diluya a 1:80,<br />
1:160, 1:320, etcétera, hasta la concentración final).<br />
<strong>Procedimiento</strong> del ensayo<br />
1. Preparación de los portaobjetos del sustrato: Deje que el portaobjetos del sustrato alcance la<br />
temperatura ambiente antes de extraerlo de la bolsa. Etiquételo con lápiz y colóquelo en una<br />
cámara de humedad adecuada. Añada una gota (20-25 μL) del positivo sin diluir y del control<br />
negativo a los pocillos 1 y 2, respectivamente. Añada una gota (20-25 μL) de muestra de<br />
paciente diluida a los demás pocillos.<br />
2. Incubación del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante 30 ± 5 minutos en una cámara de<br />
humedad (para mantener las condiciones de humedad adecuadas, puede colocar una toalla de<br />
papel húmeda horizontalmente en el fondo de un recipiente cerrado de plástico o vidrio). Evite<br />
que el sustrato se seque durante el procedimiento del ensayo.<br />
3. Lavado de los portaobjetos: Tras la incubación, utilice una botella comprimible de plástico o<br />
una pipeta para eliminar suavemente el suero mediante tampón de PBS diluido. Oriente el<br />
portaobjetos y el flujo de tampón de PBS de manera que el desbordamiento de muestras entre<br />
pocillos sea mínimo. No apunte el flujo directamente a los pocillos para evitar que el<br />
sustrato resulte dañado. Si lo desea, coloque los portaobjetos en un frasco Coplin con tampón<br />
de PBS diluido durante 5 minutos como máximo.<br />
4. Adición del conjugado fluorescente: Elimine el exceso de tampón de PBS. Vuelva a colocar el<br />
portaobjetos en la cámara de humedad y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de<br />
conjugado fluorescente. Incube los portaobjetos durante otros 30 ± 5 minutos.<br />
5. Lavado de los portaobjetos: Repita el paso 3.<br />
6. Cubreobjetos: Aunque los procedimientos relativos a los cubreobjetos varían de un laboratorio a<br />
otro, se recomienda utilizar el método siguiente:<br />
a. Coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel.<br />
b. Aplique el medio de montaje en el borde inferior del cubreobjetos siguiendo una línea<br />
continua.<br />
c. Elimine el exceso de tampón de PBS y ponga en contacto el borde inferior del<br />
portaobjetos con el borde del cubreobjetos. Haga descender suavemente el portaobjetos<br />
sobre el cubreobjetos de manera que el medio de montaje fluya hasta el borde superior<br />
del portaobjetos sin que se formen burbujas de aire ni estas queden atrapadas entre<br />
ambos.<br />
Control de calidad<br />
El análisis del control positivo de IgG anti-actina F y del control negativo del sistema IFA debe realizarse<br />
en todos los portaobjetos para asegurar que los reactivos y procedimientos actúan correctamente.<br />
Pueden prepararse sueros de control adecuados adicionales obteniendo muestras alícuotas de suero<br />
humano combinado y almacenándolas a una temperatura de –70 o C o inferior. Para considerar válidos<br />
los resultados del análisis, deben cumplirse todos los criterios indicados a continuación. Si alguno de<br />
ellos no se cumple, los resultados del análisis se considerarán no válidos y deberá repetirse el ensayo.<br />
1. El control positivo sin diluir de anticuerpo IgG anti-actina F debe ser 3+ o superior.<br />
2. El control negativo del sistema IFA debe ser negativo.<br />
Interpretación de los resultados<br />
Reacción negativa: Se considera que una muestra es negativa si la tinción específica, tal como está<br />
descrita en el apartado siguiente («Reacción positiva»), es menor o igual que la del control negativo del<br />
sistema IFA. Las muestras pueden presentar varios grados de tinción específica o de fondo en<br />
respuesta a otros componentes celulares y, sin embargo, pueden ser negativas con respecto a los<br />
anticuerpos IgG anti-actina F.<br />
Reacción positiva: Se considera que una muestra es positiva si se observa una tinción específica más<br />
intensa que la del control negativo del sistema IFA en las fibras de actina F que rodean a la mayor parte<br />
de las células según un patrón hexagonal y, a veces, en las fibras que van de una célula a otra.<br />
Determine el grado o la intensidad de la fluorescencia aplicando los criterios siguientes:<br />
4+ Fluorescencia verde manzana muy brillante.<br />
3+ Fluorescencia verde manzana brillante.<br />
2+ Fluorescencia positiva claramente distinguible.<br />
1+ La fluorescencia específica más baja que permite diferenciar claramente la tinción de la<br />
actina F de la fluorescencia de fondo.<br />
3
Interpretación del patrón: Pueden observarse varios patrones de tinción nuclear y/o citoplasmática,<br />
según los tipos y las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Solo el patrón<br />
descrito anteriormente en el apartado «Reacción positiva» debe considerarse positivo con respecto a los<br />
anticuerpos IgG anti-actina F. Todos los demás patrones deben considerarse negativos.<br />
Limitaciones del procedimiento<br />
1. El patrón de IgG anti-actina F con una titulación alta indica AIH, pero no debe atribuírsele valor<br />
diagnóstico. El resultado de la IgG anti-actina F debe evaluarse de forma combinada con otros<br />
resultados de laboratorio y con toda la historia clínica del paciente.<br />
2. Existen varios factores externos que influyen en la sensibilidad del análisis: el tipo de<br />
microscopio de fluorescencia utilizado, la potencia y la antigüedad de la lámpara, la ampliación<br />
aplicada, el sistema de filtrado y el observador.<br />
3. Si se emplea un filtro de paso de banda en lugar de un filtro de barrera de 515 nm, puede<br />
observarse una tinción más intensa, debida a artefactos.<br />
4. Los portaobjetos deben etiquetarse únicamente mediante un lápiz. El uso de cualquier otro<br />
material de escritura puede provocar tinción debida a artefactos.<br />
5. Todos los frascos Coplin utilizados para lavar los portaobjetos deben estar libres de residuos de<br />
tinción. El uso de frascos Coplin que presenten residuos de tinción puede dar lugar a una tinción<br />
debida a artefactos.<br />
6. Las características de rendimiento del análisis han sido verificadas para el suero, pero no para el<br />
plasma u otros tipos de muestras.<br />
Valores esperados<br />
La capacidad del kit NOVA Lite TM IgG F-Actin para detectar anticuerpos IgG anti-actina F se ha evaluado<br />
mediante una comparación con el ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgG que se comercializa actualmente<br />
(INOVA <strong>Diagnostics</strong>, Inc). Los resultados del ELISA se han considerado positivos cuando la muestra del<br />
paciente ha presentado un valor de 20 unidades o superior y se han definido como negativos si dicho<br />
valor ha sido inferior a 20 unidades.<br />
Rango normal<br />
Se han analizado 493 muestras de donantes de sangre normales mediante el kit NOVA Lite TM IgG F-<br />
Actin. Todas las 493 muestras normales excepto cuatro (especificidad: 99,2 %) han dado un resultado<br />
negativo en el ensayo NOVA Lite TM IgG F-Actin.<br />
Comparación entre el IFA NOVA Lite TM IgG F-Actin y el ELISA QUANTA<br />
Lite TM F-Actin IgG<br />
Con objeto de determinar los porcentajes de concordancia positiva y negativa de los ensayos, se<br />
analizaron 992 muestras que contenían anticuerpos frente a una amplia gama de antígenos mediante el<br />
IFA NOVA Lite TM IgG F-Actin y el ELISA QUANTA Lite TM Actin IgG. Las muestras pertenecían a 493<br />
donantes de sangre normales, 60 pacientes con enfermedades clínicamente definidas (artritis<br />
reumatoide, LES y esclerodermia), 40 muestras con anticuerpos identificados (anticuerpos de<br />
enfermedades infecciosas y autoanticuerpos) y 399 muestras de pacientes que podían padecer<br />
enfermedad hepática.<br />
N = 992<br />
NOVA Lite TM IgG F-Actin<br />
Positivo<br />
NOVA Lite TM IgG F-Actin<br />
Negativo<br />
Total<br />
ELISA QUANTA Lite TM Actin<br />
IgG<br />
Positivo<br />
269<br />
69*<br />
338<br />
Concordancia positiva (%): 269/338 (80 %)<br />
Concordancia negativa (%): 633/654 (97 %)<br />
Concordancia total (%): 902/992 (91 %)<br />
* 39 de los 69 fueron positivos débiles en el ELISA<br />
** 14 de los 21 fueron 1+ en el IFA (baja reactividad)<br />
4<br />
ELISA QUANTA Lite TM Actin<br />
IgG<br />
Negativo<br />
21**<br />
633<br />
654<br />
Total<br />
290<br />
702<br />
992
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antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin exp Immunolol 82: 52-56,<br />
1990.<br />
8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National<br />
Institute of Health, 2007, Fifth Edition.<br />
Fabricante:<br />
INOVA <strong>Diagnostics</strong>, Inc.<br />
9900 Old Grove Road<br />
San Diego, CA 92131<br />
United States of America<br />
Technical Service (Domestic) : 877-829-4745<br />
Technical Service (International) : 00+ 1 858-805-7950<br />
info@inovadx.com<br />
Representante Autorizado:<br />
Medical Technology Promedt Consulting GmbH<br />
Altenhofstrasse 80<br />
D-66386 St. Ingbert, Germany<br />
Tel.: +49-6894-581020<br />
Fax.: +49-6894-581021<br />
www.mt-procons.com<br />
628250ESP February 2010<br />
Revision 0<br />
5