QUANTA LiteTM dsDNA - inova

NOVA Lite Adrenal (Primate) IFA SlidesPer uso diagnostico In VitroSolo para exportación. No comercializable en Estados Unidos.Codice Prodotto: 508370, 508375, 508375.10Complessità CLIA: elevataFinalità d’usoLas secciones de glándula suprarrenal de mono se utilizan en ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA), para elcribado de anticuerpos circulantes séricos humanos dirigidos contra la corteza suprarrenal, a modo de ayuda en eldiagnóstico de la enfermedad de Addison.Sumario y Explicación de la pruebaLos anticuerpos dirigidos contra las células esteroideas de la corteza suprarrenal se encuentran con frecuencia en elsuero de pacientes con la enfermedad de Addison. La técnica empleada para detectar estos anticuerposcitoplasmáticos es la inmunofluorescencia en secciones de glándula suprarrenal de mono.Un 60% de pacientes con enfermedad de Addison presentarán anticuerpos dirigidos contra la corteza suprarrenal en elsuero. Los pacientes con enfermedad de Addison también presentan con frecuencia otros trastornos autoinmunes,como tirotoxicosis, tiroiditis de Hashimoto e insuficiencia ovárica. En caso de insuficiencia suprarrenal aislada, lapresencia de anticuerpos positivos disminuye aproximadamente a un 20%. Prácticamente nunca se detectananticuerpos antisuprarrenales en el suero de personas sanas 1 .Procedimiento de trabajoEstos portaobjetos se utilizan en una técnica de inmunofluorescencia indirecta, en la que las muestras de paciente y loscontroles adecuados se incuban con las secciones. Los anticuerpos no reactivos se eliminan mediante lavado y, acontinuación, se aplica un conjugado adecuado marcado con fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediantelavado, tal como se ha hecho anteriormente. Los portaobjetos se examinan en un microscopio de fluorescencia. Lasmuestras positivas producen una fluorescencia de color verde brillante que corresponde a las áreas de la sección a lasque se ha unido el autoanticuerpo 2 .ReactivosSecciones suprarrenales de mono en portaobjetos de 5 pocillos, envueltas individualmente en una bolsa de aluminioque contiene desecante.Advertencias/PrecaucionesDeben establecerse métodos de manipulación y eliminación adecuados para todas las muestras potencialmenteinfecciosas analizadas con este producto. Sólo personal debidamente formado puede llevar a cabo estosprocedimientos.Condiciones de almacenamientoLos portaobjetos no abiertos deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8°C y pueden utilizarse hasta la fechade caducidad indicada. NO CONGELAR. Tras extraer los portaobjetos de la bolsa de aluminio, deben utilizarseinmediatamente.Recolección de MuestrasLas muestras de sangre deben obtenerse mediante venipunción, dejando que se coagulen de forma natural, y el suerodebe separarse lo antes posible para evitar hemólisis. El suero puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 7días antes del ensayo 4 , o para periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperaturainferior. NO congelar y descongelar el suero más de una vez. Evitar el uso de sueros lipémicos, hemolizados ocontaminados con microbios, puesto que puede dar lugar a títulos reducidos o patrones de tinción poco claros.1

ProcedimientoMateriales Suministrados1. 508370 – Adrenal (Primate) – 1 x 8-well slide (Portaobjetos con glándula suprarrenal de mono – 8 pocillos obien glándula suprarrenal de mono2. 508375 – Adrenal (Primate) – 1 x 4-well slide (Portaobjetos con glándula suprarrenal de mono – 4 pocillos obien glándula suprarrenal de mono3. 508375.10 – Adrenal (Primate) – 10 x 4-well slide (Portaobjetos con glándula suprarrenal de mono – 10 x 4pocillos o bien glándula suprarrenal de mono4. 1 x folleto de instruccionesMaterial necesario no incluido1. Agua destilada para diluir el PBS concentrado.2. Contenedor para el tampón PBS.3. Micropipetas y puntas desechables para aplicar las muestras.4. Cámara húmeda para las incubaciones5. Microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 495nm y filtro barrera de 515nm.6. Botella lavadora para los lavados iniciales con PBS.Los componentes adicionales pueden obtenerse de INOVA Diagnostics, Inc.: PBS (508002), controlnegativo IFA Sistema (508186), conjugado (H&L) adsorbida para mono FITC (504011, 504071), azul deEvans (504049) y medio de montaje PVA (504046, 504047).Procedimiento del testControl de calidadDeben utilizarse controles positivos y negativos cada vez que se ensayen las muestras.1. Medio de montaje: Retirar el medio de montaje del refrigerador para que alcance la temperatura ambiente (18-28°C) antes de su uso.2. Dilución de muestras de pacienteCribado: Diluir las muestras de paciente 1/5 añadiendo 20μL de suero a 80μL de tampón PBS.Titulación: Realizar diluciones seriadas de las muestras cribadas positivas con el tampón PBS (p.ej. 1/10,1/20, 1/40 y 1/80, etc.). Por ejemplo: tomar 100μL de la dilución 1/5, mezclar con 100μL de PBS para obteneruna dilución 1/10. Repetir la operación para otras diluciones.3. Portaobjetos de sustrato. Dejar que los portaobjetos de sustrato alcancen la temperatura ambiente (18-28°C)antes de retirarlos de las bolsas.Etiquetar los portaobjetos adecuadamente. Colocarlos en la cámara húmeda y añadir 50-100μL de los controlespositivos y negativos a los pocillos correspondientes. Añadir 50-100μL de muestras de paciente diluidas a lospocillos restantes.4. Incubación de portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperaturaambiente (18-28°C).5. Lavado con PBS. Retirar los portaobjetos de la cámara húmeda y aclararlos brevemente con un frascocomprimible de PBS. No dirigir directamente el chorro a los pocillos. Colocar los portaobjetos en una bandeja,sumergirlos en PBS y agitar durante 5-10 minutos.6. Adición de conjugado fluorescente. Eliminar el exceso de PBS y secar con material absorbente el contorno delos pocillos. Volver a colocar los portaobjetos en la cámara húmeda y cubrir inmediatamente cada pocillo conuna gota de conjugado fluorescente adecuadamente diluido. NO DEJAR LOS POCILLOS DESCUBIERTOSDURANTE MÁS DE 15 SEGUNDOS. El secado del sustrato afecta negativamente a los resultados. Lautilización de conjugado adsorbido de mono permitirá obtener mejores resultados (p.ej. 504011).7. Incubación de portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda y oscura atemperatura ambiente (18-28°C).8. Lavado con PBS. Volver a lavar, tal como se describe en el paso 5. CONTRATINCIÓN OPCIONAL: añadir 2-3gotas de azul de Evans al 1% por cada 100mL de PBS antes de proceder a la inmersión de los portaobjetos.9. Montaje con cubreobjetos. Retirar uno a uno los portaobjetos de la solución PBS de lavado. Secar rápidamenteel contorno de los pocillos y añadir una gota de medio de montaje a cada pocillo. Colocar con cuidado elportaobjetos en el cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de aire. No intentar eliminar las burbujas quese hayan podido formar. Eliminar el exceso de medio de montaje del borde del cubreobjetos.10. Examen de portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos pueden almacenarse un máximode 3 días a 2-8°C, en un lugar oscuro, sin que se produzca una pérdida de fluorescencia significativa.2

ResultadosControl de calidadUna muestra de suero que contenga autoanticuerpos de células esteroideas debe mostrar una tinción de color verdebrillante fluorescente del citoplasma de los portaobjetos de corteza suprarrenal.Un control negativo debe mostrar una tinción de color verde pálido en todos los tejidos, pero sin fluorescenciaperceptible.Si el aspecto de los controles no es el que se describe, el ensayo debe considerarse inválido y, por consiguiente,deberá repetirse.Interpretación de los resultadosConsultar las referencias 3 para ver ejemplos de imágenes en color de este patrón. Los resultados se notifican comopositivos o negativos.N.B.: cada laboratorio debe establecer el valor límite en el que se considera que un resultado positivo es clínicamentesignificativo.Limitaciones del Procedimiento1. La calidad de la fuente de luz, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia influirá en lasensibilidad del kit. El funcionamiento del microscopio depende de un correcto mantenimiento, especialmentedel enfoque de la lámpara de vapor de mercurio y el reemplazo de la misma una vez transcurrido el período detiempo recomendado.2. Otros autoanticuerpos, especialmente los antimitocondriales, pueden estar ocultos o confundirse conanticuerpos antisuprarrenales. Por este motivo, el suero que produzca tinción de las secciones suprarrenalestambién debe analizarse en secciones de hígado, riñón y estómago.3. No se ha evaluado la idoneidad del uso con reactivos IFA de otros fabricantes, sin embargo, no debe excluirsesu empleo.4. Este ensayo por sí solo no es válido para el diagnóstico. También deben tenerse en cuenta los demás factores,incluidos la historia clínica de los pacientes y otros resultados serológicos o biópsicos.Resumen del procedimiento1. Dejar que el medio de montaje alcance la temperatura ambiente.2. Diluir PBS con agua destilada.3. Diluir el suero de paciente 1/5 con PBS.4. Dejar que los portaobjetos de sustrato alcancen la temperatura ambiente (18-28°C).5. Aplicar 50-100μL de controles positivos y negativos y suero de paciente diluido a los pocillos correspondientes.6. Incubar en una cámara húmeda durante 30 minutos.7. Lavar durante 5-10 minutos en PBS.8. Secar con material absorbente el contorno de los pocillos y cubrirlos inmediatamente con una gota deconjugado.9. Incubar tal como se describe en el paso 6.10. Lavar tal como se describe en el paso 7.11. Montar.12. Examinar el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.Referencias1. Irvine W.J. Adrenalitis, hypoparathyroidism and associated diseases, in Samter M. (ed) ImmunologicalDiseases, ed 2. Boston, Little, Brown & Co. pp. 1278-1295, 1978.2. Weller T.H. Coons A.H. (1954). Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zosterpropagated in vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86, 789-794.3. Bradwell A.R. et al (2008). Atlas of Tissue Autoantibodies (Third Edition). Publ. The Binding Site Ltd.,Birmingham, UK4. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) 2004. Ed. A. Milford Ward, G.D. Wild. Publ. PRUPublications, Sheffield. 14.NOVA Lite es una marca deINOVA Diagnostics, Inc.3

Fabricante:INOVA Diagnostics, Inc.9900 Old Grove RoadSan Diego, CA 92131United States of AmericaTechnical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950support@inovadx.comRepresentante Autorizado:Medical Technology Promedt Consulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. Ingbert, GermanyTel.: +49-6894-581020Fax.: +49-6894-581021www.mt-procons.com628375ESP October 2010Revision 04