QUANTA LiteTM dsDNA - inova

NOVA Lite® ANA Plus Mouse Kidney & StomachPer uso diagnostico In VitroComplessità CLIA: elevataCodice Prodotto: 708150, 708155508150.30, 508155.10Finalità d’usoNOVA Lite® ANA Plus è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semi-quantitativa nelsiero umano degli anticorpi antinucleo (ANA), anti-mitocrondrio (AMA), anti-muscolo liscio (ASMA) ed anti paretegastrica (GPA). La presenza di anticorpi antinucleo, assieme ad altri test sierologici ed ai riscontri clinici, più essere diausilio nella diagnosi di lupus eritematoso sistemico (LES) ed altre malattie del tessuto connettivo o reumatiche.Riassunto e Spiegazione del testLa definizione “anticorpi antinucleo” descrive una varietà di autoanticorpi che reagiscono con costituenti dei nuclei dellecellule come il DNA, l’RNA e varie proteine e ribonucleoproteine. 1 Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenzaelevata in pazienti affetti da malattie reumatiche o del tessuto connettivo, specialmente il lupus eritematoso sistemico.Praticamente tutti i pazienti affetti da LES sono positivi agli ANA. Questa sensibilità diagnostica ha portato ad includerela determinazione degli ANA nei criteri revisionati per la classificazione del lupus eritematoso sistemico del 1982compilata da un sottocomitato dell’American College of Rheumatology (collegio americano di reumatologia). 2 L’analisidegli ANA è un è un test di screening eccellente per il LES (un risultato negativo in pratica esclude il LES in fase attiva 3 )ma non è assolutamente un esame specifico. Pazienti con altre malattie del tessuto connettivo come l’artrite reumatoide,la sclerodermia e la dermatomiosite risultano spesso positivi, e titoli bassi di ANA possono essere osservati in altremalattie ed anche nella popolazione normale. 4 Si possono riscontrare risultati positivi agli ANA in seguito ad ustioni gravio ad infezioni virali, e si sono riscontrati anche in individui sani, soprattutto fra gli anziani. Per via di questa mancanza dispecificità si raccomanda di titolare fino agli estremi tutti i campioni ANA positivi e di eseguire indagini più accurate perricercare autoanticorpi diretti verso il DNA a doppia elica (dsDNA) e verso l’antigene estraibile nucleare (ENA). 1-3Livelli elevati di AMA si riscontrano spesso in associazione alla cirrosi biliare primaria. Titoli bassi di AMA si possonoriscontrare in altre malattie epatiche come l’epatite cronica attiva e la cirrosi criptogenetica. 5,6 Gli ASMA si riscontranocon titoli elevati nel siero del 70% dei pazienti affetti da epatite cronica attiva. Inoltre il 50% di questi pazienti è positivoagli ANA mentre il 25% presenta titolo basso di AMA. Titoli bassi di ASMA si possono riscontrare in pazienti affetti dainfezioni virali, tumori maligni ed in individui normali. 5,7I GPA si riscontrano nel siero del 90% dei pazienti affetti da anemia perniciosa. Assieme ad altri esami diagnostici e ariscontri clinici, un risultato di GPA positivo può essere di ausilio nel distinguere l’anemia perniciosa autoimmune da altreanemie megaloblastiche. Anche se si riscontrano solo in meno del 2% della popolazione normale d’età inferiore ai 20anni, l’incidenza dei GPA aumenta nelle donne di età superiore ai 40 anni e si può riscontrare in una percentuale chearriva fino al 16% della popolazione normale di età superiore ai 60 anni. 8,9L’immunofluorescenza indiretta è il metodo di riferimento per l’analisi degli ANA, AMA, ASMA e dei GPA. I substraticomuni sono sia sezioni sottili di organi di roditore che alcuni tipi di linee cellulari. Il substrato scelto per il NOVA Lite®ANA Plus è costituito da sezioni di rene e stomaco di topo fissate in maniera ottimale. Il coniugato è costituito da anti-IgG umane purificate per affinità.Principio della MetodicaNel test all’immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell’antigene e gli anticorpi chenon hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico marcato con fluoresceina esuccessivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i campioni positivi agli autoanticorpi vengonoosservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle areedelle cellule o dei nuclei dove si è legato l’autoanticorpo.Reagenti1. Vetrini ANA Plus (rene/stomaco di topo), 4 o 8 pozzetti/vetrino, con essiccanteSolo kit:2. Coniugato anti-IgG umano (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed azoturo disodio allo 0,09%3. ANA Pattern omogeneo, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero umanodiretti verso il nucleo cellulare, prediluto4. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09%, senza anticorpi disiero umano anti ANA Plus, prediluto5. Concentrato PBS (40x)6. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%7. CoprivetriniAvvertenze1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate esono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HBsAg e per anticorpi anti-HCV mediantemetodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell’assenza di HIV, HBV, HCV o dialtri agenti infettivi. Pertanto, i ANA Pattern omogeneo ed Controllo Negativo Sistemi IFA devono esseremaneggiati come materiali potenzialmente infettivi. 101

2. La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita oassorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formandoazidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino pereliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti inmateria di eliminazione dei residui di natura chimica.Precauzioni1. Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un’elevato background.4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi dimanipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a quelli ottenutieseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro procedura automatizzataaffinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili.5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, laluminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della tecnica di pipettamento, laprecisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il test. E' richiesto di prestare particolareattenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e riproducibili.6. Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni caso, ilcambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test.7. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.Condizioni di conservazione1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2 - 8 ° C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza seconservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2 - 8 ° C.Raccolta dei campioniQuesta tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservantipuò influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore ocontenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso di sieri fortemente emolizzati olipemici.Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 CLSI (precedentementedell’NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni atemperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni infrigorifero a 2 - 8 ° C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelarea ≤-20 ° C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati.ProceduraMateriali forniti (kits)70815020 8-pozzetti Vetrini ANA Plus di substrato1 15 ml Coniugato anti-IgG umano1 0,5 ml ANA Pattern omogeneo1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA2 25 ml Concentrato PBS (40x)1 7 ml Liquido di montaggio1 20 Coprivetrini70815510 4-pozzetti Vetrini ANA Plus di substrato1 7 ml Coniugato anti-IgG umano FITC1 0,5 ml ANA Pattern omogeneo1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA1 25 ml Concentrato PBS (40x)1 7 ml Liquido di montaggio1 10 CoprivetriniMateriali forniti (vetrini)508150.30 30 - 8-pozzetti Vetrini ANA Plus di substrato508155.10 10 - 4-pozzetti Vetrini ANA Plus di substratoMateriali richiesti ma non fornitiMicropipette in grando di erogare volume di 15 – 1000μlAcqua distillata o deionizzataBottiglie di plastica a spruzzo o pipette PasteurCamera umidaBeuta da 1l per diluire il PBSVaschette CoplinMicroscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm2

MetodicaPrima di incominciare1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20 - 26 o C) e mescolarli bene.2. Diluire il concentrato PBS: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS 1:40 aggiungendo il contenuto delflacone contenente il concentrato PBS in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e mescolare accuratamente. Iltampone PBS viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluitopuò essere conservato al massimo per 4 settimane 2 - 8°C.3. Diluire i campioni del paziente:a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:20 con il tampone PBS diluito (ovvero, aggiungere 50 μl di sieroa 950 μl di tampone PBS).b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti icampioni positivi con il tampone PBS diluito (ovvero 1:40, 1:80,... 1:5120).Esecuzione del test1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del substrato primadi toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera umida adeguata. Aggiungere 1goccia (70 – 90µL) dei controlli positivi e negativi non diluiti rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1goccia (70 – 90µL) del campione diluito del paziente nei rimanenti pozzetti.2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per 30 + 5 minuti in una camera umida (un tovagliolo di cartainumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità adeguate). Nonlasciare asciugare il substrato durante la procedura d’esame.3. Lavare i vetrini: dopo l’incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per lavare viadelicatamente il siero utilizzando il tampone PBS diluito. Orientare il vetrino e la direzione del flusso deltampone PBS in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari pozzetti. Evitare di dirigere ilflusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se voluto, disponga gli vetrini i in un vaso diCoplin dell'amplificatore diluito di PBS per fino a 5 minuti.4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS in eccesso. Porre nuovamente il vetrino nellacamera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare ivetrini per ulteriori 30 + 5 minuti.5. Lavare i vetrini: ripetere la fase 3.6. Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti proceduresono raccomandate:a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta.b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino.c. Eliminare il tampone PBS in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il bordo delcoprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il collante scorra fino albordo superiore del vetrino senza formare bolle d’aria.Controllo di qualitàL’ANA Pattern omogeneo ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo daassicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può preparare dell’ulteriore sierodi controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati dell’analisi devonosoddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, sidovrebbe considerare non valido il risultato dell’esame e si dovrebbe ripetere il test.1. L’ANA Pattern omogeneo non diluito deve essere > 3+.2. Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo.Interpretazione dei risultatiReazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione specifica è uguale o inferiore alControllo negativo sistema IFA. I campioni possono mostrare differenti gradi di colorazioni di fondo per via di anticorpieterofili o livelli bassi di autoanticorpi contro costituenti citoplasmatici come le proteine contrattili.Reazione positiva. Colorazione specifica delle componenti cellulari. Si possono osservare una varietà di pattern dellacolorazione in base alla specificità anticorpale.Determinare il grado o l’intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri:4+ Fluorescenza verde chiaro brillante3+ Fluorescenza verde chiara accesa2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione nuclearee/o citoplasmatica rispetto alla fluorescenza di fondoInterpretazione dei pattern. In base al tipo ed alla quantità relativa degli autoanticorpi presenti nel campione si possonoottenere differenti pattern nucleari e/o citoplasmatici. Si possono riscontrare i seguenti tipi di pattern:Omogeneo: una colorazione compatta del nucleo che apparentemente copre o no i nucleoli.Tipi di antigeni nucleari presenti: dsDNA, ssDNA, istoniAssociazioni con malattie: titoli elevati sono suggestivi di LES; titoli bassi sono suggestivi di LES o altrepatologie a carico del tessuto connettivo.Periferico: una colorazione compatta principalmente attorno la regione esterna del nucleo, con una colorazione piùdebole verso il centro.Tipi di antigeni nucleari presenti: dsDNA, ssDNA, DNP, istoniAssociazioni con malattie: titoli elevati sono suggestivi di LES; titoli bassi sono suggestivi di LES o altrepatologie a carico del tessuto connettivo.A granuli: una colorazione che appare finemente o più grossolanamente granulare, in genere in assenza di colorazionefluorescente dei nucleoli.Tipi di antigeni nucleari presenti: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B ed altri sistemi antigene/anticorpo nonancora caratterizzati.3

Associazioni con malattie: titoli elevati sono suggestivi di LES (anticorpo Sm), patologia mista a carico deltessuto connettivo (anticorpo RNP), sclerodermia (anticorpo Scl-70), complesso della sindrome Sjögren(anticorpo SS-B); titoli bassi possono essere suggestivi di altre malattie del tessuto connettivo.Nucleolare: colorazione a granuli grandi e grossolani all’interno del nucleo, generalmente in numero inferiore a 6 perogni cellula, con o senza la presenza di granuli più fini.Antigeni nucleari presenti: 4-6S RNA ed altri antigeni nucleari sconosciuti.Associazioni con malattie: titoli elevati sono prevalenti nella sclerodermia e nella sindrome di Sjögren.Mitocondriale (AMA): una colorazione granulare discreta dei tubuli distali e/o prossimali del rene. Le cellule parietaligastriche metabolicamente attive contengono elevate concentrazioni di mitocondri e possono colorarsipositivamente.Antigeni nucleari presenti: vari tipi di antigeni mitocondriali.Associazioni con malattie: titoli elevati indicano la cirrosi biliare primaria.Muscolo liscio (ASMA): una colorazione discreta degli strati muscolari interni dei vasi sanguigni del rene e/o la laminamuscolare dello stomaco è considerata specifica per gli ASMA.Antigeni nucleari presenti: ActinaAssociazioni con malattie: titoli elevati sono indicativi di epatite cronica attiva, epatite autoimmune.Cellule parietali gastriche (GPA): colorazione del citoplasma della cellula parietale. Queste cellule sono localizzatenella mucosa gastrica. Dal momento che gli AMA possono provocare colorazione anche delle cellule parietali, sidovrebbero testare anche i tubuli renali prima di riferire la presenza di GPA. Se il campione è GPA positivo, itubuli renali risulteranno negativi.Antigeni nucleari presenti: pompa protonica (h/K ATPasi)Associazioni con malattie: questi anticorpi si riscontrano nell’anemia perniciosa e nella gastrite atroficaÈ importante avvertire l’utente di esercitare cautela nell’affidarsi a questi pattern per determinare la specificitàautoanticorpale, tranne che per i pattern nucleolare e centromerale nei quali ognuno degli antigeni è ben definito ed ipattern sono caratteristici. Dal momento che molti autoanticorpi o relative combinazioni possono produrre unacolorazione omogenea o a granuli si raccomanda di eseguire successive analisi specifiche per gli autoanticorpi (come glidsDNA e gli ENA) su tutti i campioni che risultano omogenei o a granuli.Limitazioni del test1. Titoli alti di ANA sono suggestivi di malattie del tessuto connettivo ma non dovrebbero essere consideratidiagnostici. I risultati agli ANA dovrebbero essere considerati in combinazione con altre analisi sierologiche ealla storia clinica del paziente.2. I pattern degli ANA spesso variano se il campione viene titolato fino agli estremi. Questo fenomeno è dovuto alfatto che titoli anticorpali bassi possono cadere al disotto del livello di sensibilità del sistema se si analizza uncampione più diluito.3. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a fluorescenzautilizzato, la forza e l’età della lampadina, l’ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e l’osservatore.4. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero maggiore diartefatti di colorazione.5. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale per scriverepuò causare artefatti.6. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante. L’utilizzo divaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti.7. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e delrisultato degli altri test sierologici.8. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.I vetrini venduti separatamente vengono classificati come “Reagenti analita-specifici”.Ad eccezione di un componente del kit NOVA Lite® ANA Plus kit, le caratteristiche analitiche e prestazionali non sonostabilite.Valori attesiUtilizzando il test NOVA Lite® ANA Plus, sono stati analizzati una varietà di pazienti affetti da malattie del tessutoconnettivo, da malattie epatiche autoimmuni, da anemia perniciosa ed anche 200 donatori di sangue scelti in manieracasuale. I risultati appaiono qui di seguito:Numero* di positivi al NOVA Lite® ANA PlusGruppo di pazienti Numero ANA AMA ASMA GPALES 105 101 5 9 1Lupus indotto da droghe 24 24 0 0 0Artrite reumatoide 40 28 1 1 0Epatite cronica attiva 25 10 4 21 0Cirrosi biliare primaria 30 5 27 3 0Anemia perniciosa 15 0 0 0 14Normali 200 3 2 6 1* Il numero totale dei positivi potrebbe eccedere in numero dei testati per via di pattern multipli in un unico pozzetto.4

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