QUANTA Lite ENA Profile EIA - inova

MetodologíaAntes de empezar1. Atemperar a temperatura ambiente• El kit está diseñado para trabajar a temperatura ambiente (20-24°C).• Sacar el kit de su embalaje y dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos.Los pocillos no deben sacarse de su embalaje antes de alcanzar la temperatura ambiente.Nota: Este kit puede mantenerse a temperatura ambiente hasta 1 semana.2. Componentes del kitMezclar con cuidado cada componente del kit antes de usar.3. Tampón de lavado (Concentrado 40x)Diluir la solución de lavado HRP 1:40 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml de agua destiladao desionizada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución de lavado añadiendo2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan a utilizarse. El tampón diluido esestable 1 semana a 2-8°C, si no se va a utilizar el kit entero dentro de las tiempo, se pueden diluir volúmenes máspequeños. Si se forman agregados o hay cualquier signo de contaminación bacteriana, descartarlo y preparalo denuevo.4. Manipulación de las tiras y el marcoRecordar que cada muestra de paciente requiere una tira completa de 8 pocillos, colocar el número necesario depocillos en el contenedor de tiras. Desde la posición del pocillo A1 rellenar las columnas de izquierda a derecha.Mientras se manipula la placa, apretar los cantos largos del marco para evitar que los pocillos se salgan. Nota:Devolver inmediatamente a la bolsa los pocillos no utilizados con los desecantes y cerrar fuertemente con el fin deminimizar la exposición a la humedad.Tener cuidado de no punzar o rasgar la bolsa.ADVERTENCIA: La exposiciónde los pocillos a la humedad o contaminación por polvo u otras partículas conlleva a una degradación delantígeno llegando a obtener resultados imprecisos y potencialmente falsos.5. Dilución de la muestraDiluir 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente (1:101) y mezclar bien. Nota: Las muestras diluidas debenemplearse en las 8 horas siguientes. Nota: Los controles positivo y de cut-off están listos para el uso y norequieren dilución.Procedimiento de EnsayoMantener la misma secuencia de dispensación durante todo el test.1. Adición de la muestraUtilizando una tira completa para cada muestra, aplicar 100µL de control cut-off listo para el uso en la fila A y controlpositivo en la fila B de todas las tiras. Añadir 100µL de muestra diluida (1:101) a los 6 pocillos restantes de cada tira.Nota: Las muestras deben aplicarse lo más rápido posible para minimizar la deriva del análisis, y poner en marcha elcronómetro después de la adición de la última muestra.Incubar 30 minutos a temperatura ambiente.2. LavadoEl proceso de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un mal lavado de la placa puede dar lugar aresultados poco precisos, con escasa precisión y valores de fondo elevados. Tras la incubación sacar la placa y lavarlos pocillos 3 veces con 200-300µL de tampón de lavado por cada pocillo. Lavar la placa con un lavador de placasautomático o manualmente según las siguientes indicaciones. Si se realiza el lavado automático, invertir la placa alfinal del lavado y sacudir los pocillos sobre papel absorbente.Las placas pueden lavarse manualmente según sigue:a. Verter el contenido de placa al fregadero.b. Sacudir los pocillos sobre papel absorbente seco.c. Echar en cada pocillo 200-300µL de tampón de lavado utilizando un pipeta multicanal.d. Con cuidado agitar la placa sobre una superficie plana.e. Repetir a-d dos veces.f. Repetir a y b.3

3. Adición del conjugadoPipetear 100µL de conjugado a cada pocillo, secar la parte de arriba de los pocillos con un pañuelo de papel paraeliminar salpicaduras. Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de conjugado a la botella.Incubar 30 minutos a temperatura ambiente.4. LavadoRepetir punto 2.5. Adición del substrato (TMB)Pipetear 100µL de substrato TMB en cada pocillo, secar la parte de arriba de los pocillos con un pañuelo de papelpara eliminar salpicaduras. Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de TMB a la botella. Incubar30 minutos a oscuras y a temperatura ambiente.6. ParadaPipetear 100µL de la solución de parada en cada pocillo. Esto dará un cambio de color de azul a amarillo.7. Medición de la densidad ópticaLeer la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de micro placas en los siguientes 30 minutos ala reacción.Control de Calidad1. Control de calidadPara que el ensayo se dé como válido, deben cumplirse los siguientes criterios:• Deben incluirse controles cut-off y positivo en cada serie.• La DO del cut-off y el resultado ENA de los controles positivos deben estar en los rangosespcificados en el Certificado QC.Si los criterios anteriores no se cumplen el resultado no es válido y deberárepetirse el ensayo.2. Cálculo del resultado de muestra y control positivoUtilizar la siguiente fórmula para calcular el resultado ENA para cada muestra:DO de lamuestra ocontrol positivo x 10 =DO del controlcut-offValor control o muestra(U/mL)Las muestras que dan resultados en el rango ‘Dudoso’ deberan ser confirmados en el ELISA ENA específicopertinente.3. Calibración del ensayoEl ensayo se calibra contra una referencia arbitraria. Los resultados ENA son semicuantitativos y vienen dados por lafórmula anterior.4. Interpretación de valores de Sm y RNPSi una muestra es negativa para anticuerpos Sm pero positiva en el ELISA RNP, entonces la reactividad es debida ala presencia de anticuerpos anti-RNP aislados.Si el valor del ELISA Sm es positivo y equivalente al valor del ELISARNP, entonces la actividad es debida principalmente a la presencia de anticuerpos anti-Sm. Una muestra Sm positivapero que da un valor de menos que 80% del valor de RNP deberá reportarse como positiva para ambos anticuerposSm y RNP. Es difícil estimar la actividad específica RNP de muestras dando densidades ópticas superiores a las quepueden medirse con el lector ELISA. Diluir la muestra 1:200 o 1:400 permitirá discernir si la actividad de RNP esmayor que la de Sm.Limitaciones del Procedimiento• Estos kits se emplean solo como soporte al diagnóstico. Un resultado positivo sugiere cierta patología que debe confirmarsepor otras certezas clínicas y otros tests serológicos.• Los resultados obtenidos mediante este ensayo no son una prueba diagnóstica de presencia o ausencia de enfermedad.Valores EsperadosEl rango de normalidad se determinó en sueros de 120 donantes de sangre normales. El control de cut-off se ha definido comoun punto equivalente al límite normal superior resultante de 3 diferentes muestras que se encontraron positivas para SSB, RNPy Scl-70. Los resultados para todas las 120 muestras se confirmaron utilizando los respectivos kits EIA BINDAZYME deespecifidad individual. Se indican los rangos sólo como orientación. Los análisis Elisa son muy sensibles y capaces de detectarpequeñas diferencias en poblaciones de muestra. Se recomienda que cada laboratorio determine su propio rango denormalidad, basado en la población y las tecnicas y equipo empleados.Resultado ENA Interpretación12,0 PositivoCaracterísticas de funcionamientoPrecisiónLa precisión intra-ensayo se midió por la suma de 12 replicas de un valor medio de muestra para cada especificidad a través dela columna adecuada de una única placa.PRECISIÓN INTRA-ENSAYOEspecificidad Valor medio (densidad óptica) % C.V.SSA 3,10 1,8SSB 1,31 5,9Sm 2,41 3,8Sm/RNP 2,16 3,0Scl-70 2,19 2,9Jo-1 1,44 2,6La precisión inter-ensayo se midió añadiendo una muestra negativa, positiva baja y positiva elevada para cada especificidad en4

tres lotes distintos.PRECISIÓN INTER-ENSAYOEnsayoMuestra 1 Muestra 2 Muestra 3U/mL %C.V. U/mL %C.V. U/mL %C.V.SSA/Ro 3,3 6,1 15,5 7,1 29,3 6,1SSB/La 1,9 15,8 23,6 12,7 27,9 19,0Sm 3,7 8,1 19,4 8,3 37,5 10,7Sm/RNP 7,7 5,2 19,3 5,2 46,3 11,9Scl-70 2,6 15,4 18,2 5,0 31,8 4,4Jo-1 3,1 16,1 19,5 6,7 45,3 9,1ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD, CONCORDANCIA RELATIVASLa especificidad, sensibilidad y concordancia relativas han sido determinadas analizando 139 muestras ENA positivas (141 Scl-70) en el perfil y con cada uno de los kits EIA BINDAZYME de especifidad individual.BINDAZYMEELISASSA/RoSSBKit de especifidad individual Correlaciones relativas (%)+ - Sensibilidad Especificidad Concordancia+ 66 3100 95,9 97,8- 0 70+ 26 0- 1 11296,3 100 99,3SmSm/RNPScl-70Jo-1+ 18 0- 2 119+ 63 2- 2 72+ 13 5- 0 123+ 21 2- 1 11690 100 98,696,9 97,3 97,196,9 96,1 96,5100 98,3 98,614 de las 17 lecturas, consideradas dusosas con todos los ensayos específicos, estaban cerca del punto de corte delensayo (el valor más alto obtenido 12,6 U/mL y la mayoría 61) pos. (42,7) neg. neg.Sm pos. (20,6) neg. pos. (19,9) neg.pos.(>61)Sm/RNP pos. (28,9) neg. pos. (>61)pos. pos.(>61) (>61)Scl-70 neg. neg. neg. neg. neg.Jo-1 neg. neg. neg. neg. neg.5

AntígenoCDC-6nucleolarCDC-7SSACDC-8centrómeroCDC-9Scl-70CDC-10Jo-1SSA neg. pos. (46,4) neg. neg. pos. (24,0)SSB neg. neg. neg. neg. neg.Sm neg. neg. neg. neg. neg.Sm/RNP neg. neg. neg. neg. neg.Scl-70 neg. neg. neg. pos. (>61) neg.Jo-1 neg. neg. neg. neg. pos. (>61)Todos los sueros fueron identificados correctamente de acuerdo con la Tabla 2 en la refencia superior.Nota: Las muestras CDC-6 y -8 contienen anticuerpos a antígenos fibrilarina y centrómeros, respectivamente, ypor tanto no serían detectados por este kit.Informes indican que la mayoría de los sueros Jo-1 positivos también contienen anticuerpos a SSA 52kD. Estoaparece en el caso para CDC-10, que era positivo a SSA en el ensayo del perfil pero negativo al analizarlo en unkit sólo para SSA/Ro 60kD.SUSTANCIAS QUE PUEDEN INTERFERIRSe salpicaron una serie de substancias interferentes en muestras negativas y positivas, que se analizaron. Elmétodo usado se basa en el kit Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Japón.SubstanciaBilirubina F (libre)Bilirubin C (conjugada)Hemoglobina hemolizadaQuiloConcentración18,3mg/dL19,0mg/dL490mg/dL1930 unidadesEsquema de la Placa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGHResumen del procedimiento1. Añadir 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida 1:101 a los pocillos.Incubar 30 minutos. Lavar.2. Añadir 100µL de conjugado a cada pocillo.Incubar 30 minutos. Lavar.3. Añadir 100µL de sustrato a cada pocillo.Incubar 30 minutos.4. Añadir 100µL de solución de parada a cada pocillo.Medir la absorbancia a 450nm.6

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