QUANTA Lite® C1q CIC ELISA - inova

QUANTA Lite ®Para utilização em diagnóstico In VitroComplexidade CLIA: ElevadaC1q CIC ELISA 704620Aplicação DiagnósticaEste kit destina-se à quantificação dos imunocomplexos circulantes (CIC) ,in-vitro, os quais se ligam aos dos C1qpresente no soro humano. Tem como objectivo a determinação de CIC no soro de doentes com doençasautoimunes e outras relacionadas com os CIC, sendo utilizado em conjugação com outros dados clínicos.O kit contém reagentes suficientes para testar até 41 amostras em duplicado ou 89 amostras simples em conjuntocom a curva de calibração e dois controlos, um positivo e outro negativo.Resumo e Explicação do testeAs inter-reacções antigénio-anticorpo podem dar origem à formação de imunocomplexos. Isto faz parte da funçãoimunológica continua normal do organismo. Os antigénios podem ser fixados no tecido ou libertados no plasma oupara outros fluidos corporais formando imunocomplexos. Normalmente, os CIC são removidos através do sistemareticulo-endotelial. Contudo, elevados depósitos de imunocomplexos nas estruturas vasculares com activaçãosubsequente de “pathways” inflamatórios tais como a cascata do complemento, podem dar origem a uma doençapor imunocomplexos, associada a danificação dos tecidos. O destino a dar a estes complexos depende de umnúmero de variáveis, nomeadamente a natureza do antigénio e do anticorpo, o tamanho do complexo, apercentagem de produção e a integridade funcional do sistema fagócitico.Devido ao papel patogénico dos CIC em muitas doenças, foram desenvolvidos métodos específicos para osdetectar. Estes consideram as propriedades físico-químicas específicas dos CIC e/ou a sua capacidade de ligaçãoà superfície das células ex. células Raji e plaquetas, ou moléculas tais como a C1q 1, 2, 3 . Por estas razões, umestudo efectuado pela OMS recomenda que a determinação dos CIC seja efectuada com a utilização de, pelomenos, dois métodos de análise diferentes 4 .A determinação das concentrações dos C1q ligador ao CIC no soro por ELISA é considerado um meio deprognóstico importante 5 . É particularmente recomendado na monitorização dos níveis de CIC em doentes comLúpus Eritematoso Sistémico, onde os níveis variam consoante a actividade da doença e as respostas docomplemento 6 .Princípio do métodoOs poços da microplaca estão revestidos com C1q purificado. Os calibradores, controlos e amostras diluídas dosdoentes são pipetados nos poços e o complexo de ligação de C1q liga-se ao C1q durante a primeira incubação.Após a lavagem dos poços, para a remoção das proteínas que não se ligaram, é adicionado o conjugadopurificado de cabra anti-IgG marcado com peroxidase. O conjugado liga-se ao imunocomplexo capturado e oexcesso de conjugado que não se ligou é removido através da lavagem posterior.Após a adição do substrato 3,3’,5,5’ Tetrametilbenzidina (TMB) forma-se um produto de cor azul, cuja intensidadeé proporcional à concentração de CIC na amostra. Posteriormente é adicionado ácido sulfúrico a cada poçoproduzindo uma cor amarela para parar a reacção. A leitura é realizada a um comprimento de onda de 450nm. Aconcentração de CIC na amostra é obtida directamente da curva de calibração, sendo os resultados expressoscomo equivalentes de IgG humana agregada por mL (μg Eq/mL).Reagentes1. Placa de ELISA de micropoços de poliestireno revestidos humano C1q antígeno (12-1 x 8 poços), comsuporte em embalagem de protecção com dessecantes2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorposhumanos a C1q, pré-diluído, 1,2 ml3. Calibrador A C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada aC1q, pré-diluído, 1,2 ml4. Calibrador B C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada aC1q, pré-diluído, 1,2 ml5. Calibrador C C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada aC1q, pré-diluído, 1,2 ml6. Calibrador D C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada aC1q, pré-diluído, 1,2 ml7. Calibrador E C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada aC1q, pré-diluído, 1,2 ml8. Controlo Positivo C1q CIC, 1 frasco de solução tampão com conservantes e 1 frasco de solução tampãocom conservantes e de IgG humana agregada a C1q, pré-diluído, 1,2 ml9. Diluente da amostra Type III, 2 frascos cor-de-amarelo, contém, Tween 20, estabilizadores proteicos econservante, 50 ml10. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris eTween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método.11. Conjugado HRP C1q CIC IgG, 1 frasco – de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos econservante, 10 ml12. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml13. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco – incolor, 10 ml1

Advertências1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) nos diluente da amostra,controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. Diluente da amostracontém Proclin 150. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões.2. Todo o material de origem humana, utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado edeu resultados negativos para testes aprovados pela FDA em relação a anticorpos anti HBsAg, HIV eHCV. Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência destes anticorpos ou outrosagentes infecciosos. Assim os controlos e calibradores C1q CIC manipulados como material8potencialmente infectante.3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingeridoou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo oucobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos dereagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destassubstâncias.4. O Conjugado HRP C1q CIC IgG contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxicoquando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir aocorrência de queimaduras químicas.5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ouabsorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões.6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases,metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo epode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência dequeimaduras químicas.7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes.8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentaçõesambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos.Precauções1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro.2. Deve seguir-se as instruções com rigor.3. Qualquer alteração pode ter efeito na prestação do teste, e nos resultados obtidos. Tomar atenção a Notasespecíficas e avisos ao longo das instruções de uso.4. Utilizar sempre os reagentes do mesmo lote. Caso se realize um número elevado de testes dever-se-áverificar se todos os reagentes pertencem ao MESMO lote. As tiras devem ser provenientes do mesmoinvólucro. A substituição de qualquer componente do kit pode induzir a resultados incorrectos.5. Para evitar quaisquer contaminações dos reagentes utilizar pontas descartáveis de plástico/vidro. Nuncarepor nos frascos originais reagentes não utilizados6. Não deixar os recipientes dos reagentes destapados, qualquer evaporação ou contaminação pode levar aresultados inconsistentes.7. O substrato TMB não dever ser exposto ao contacto com a luz ou água.8. Não devem ser utilizados soros contaminados, hemolisados ou lipémicos e amostras que contenhampartículas em suspensão.9. A diluição não pode ser verificada visto que os controlos estão prontos a usar. Recomenda-se a utilizaçãode pipetas calibradas e de soro de Controlo de Qualidade interno (CQ).10. A utilização de sistemas automáticos para o teste, diluição das amostras e outros aparelhos automáticospode conduzir a diferenças nos resultados quando comparados com o procedimento manual. É daresponsabilidade de qualquer laboratório a validação do sistema com o qual está a trabalhar, e assegurarque os resultados se encontram dentro dos limites definidos pelas instruções de uso e pelo certificado deCQ associado.11. Todo o equipamento utilizado deve ser calibrado e conservado de acordo com as instruções do fabricante.Precauções particulares de conservação1. O kit deve ser conservado entre 2-8ºC e NÃO deve ser congelado. A conservação a temperaturasimpróprias irão afectar os resultados.2. O tampão de lavagem diluído pode ser conservado a 2-8ºC até 1 semana.3. A data de validade do kit está mencionada no rótulo exterior.Colheita da amostra1. As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa de modo a permitir a formação do coágulonaturalmente e a separação do soro.2. O soro pode ser conservado de 2-8ºC até 7 dias antes do teste 7 , ou em aliquotas a -20ºC ou menos,para períodos mais prolongados.3. Devem evitar-se descongelamentos e congelamentos sucessivos.4. As amostras de soro não devem ser inactivadas pelo calor, pois poder-se-á obter resultados falsospositivos.ProcedimentoMaterial fornecido• Instruções de uso: Fornece instruções detalhadas do teste.• Certificado CQ: Indica a performance esperada para o lote.• Microplaca revestida com C1q CIC: 12 tiras fraccionáveis constituídas por 8 poços cada evestidos comhumano C1q. Cada microplaca é embalada num invólucro hermeticamente fechado e contém dois pacotes deexsicante.• Controlo negativo ELISA: 1 frasco. Contém 1,2mL de soro humano diluído. Os valores esperados encontramseno certificado do CQ. Pronto a usar.2

• Calibradores C1q CIC: 5 frascos, com 1,2mL de IgG humana agregada, com as seguintes concentrações deimunocomplexos: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23µg Eq/mL. Prontos a usar.• Controlo positivo C1q CIC: 1 frasco. Contém 1,2mL de IgG humana agregada diluído. Os valores esperadosencontram-se no certificado do CQ. Pronto a usar.• Diluente da amostra, Type III: 2 frascos. Contém 50mL de tampão para a diluição da amostra. Com coloraçãode-amarelo e pronto a usar.• Solução de lavagem HRP (40x): 1 frasco. Contém 25mL de tampão de lavagem concentrado 40 vezes, paralavagem dos poços das placas.• Conjugado HRP C1q CIC IgG: 1 frasco. Contém 10mL de anticorpo anti-IgG humana marcado comperoxidase, de coloração azul. Pronto a usar.• TMB Cromogénio: 1 frasco. Contém. 10mL de cromogénio TMB. Pronto a usar.• Solução de paragem HRP: 1 frasco. Contém 10mL de ácido sulfúrico a 0,344M. Pronto a usar.Material adicional necessário mas não fornecido• Lavador automático de microplacas: É o mais recomendado, no entanto a lavagem pode ser efectuadamanualmente.• Leitor de microplacas: Para efectuar leituras de densidade óptica a 450nm contra o ar.• Água destilada ou desionisada: A água deve ser de elevada qualidade.• Micropipetas calibradas: Para a pipetagem de 1000, 100 e 10µL.• Pipeta multicanal: Recomendado para a pipetagem de volumes de 100µL do conjugado, substrato e soluçãode paragem.• Pontas de plástico/vidro: Para a diluição das amostras.MétodoAntes de iniciar1. Conduzir o kit à temperatura ambiente• O kit foi desenvolvido para a realização dos testes à temperatura ambiente (20-24°C).• Retirar o kit do frigorifico e deixa-lo à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Asmicroplacas não devem ser retiradas do invólucro antes deste se encontrar à temperatura ambiente.Nota: Este kit pode ser conservado à temperatura ambiente até uma semana.2. Componentes do kitAgitar suavemente todos os componentes do kit, antes de usar.3. Diluição do tampão de lavagemDiluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podemser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada oudesionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante umasemana a 2-8º C.4. Diluição da amostraDiluir 10µL de cada amostra com 1000µL de diluente da amostra (1:101) e misturar bem. Nota: Após asua diluição a amostra deve ser utilizada nas 8 horas seguintes.5. Manuseamento das tiras e do moldura das tirasColocar o número de tiras necessárias na moldura da microplaca e fixá-las pelas extremidades,posicionar-se no poço A1 e preencher as colunas da microplaca da esquerda para a direita. Nota: Repor,de imediato, as tiras não utilizadas, no invólucro com os dois sacos de exsicante e fecha-los novamentede modo a minimizar a exposição ao ar. Cuidado para não perfurar ou rasgar o invólucro. AVISO: Aexposição das tiras à humidade ou a contaminação pelo ar ou por outras partículas pode resultarna deterioração do antigénio, conduzindo à perda de precisão do teste bem como a resultadosfalsos.Técnica1. AmostraPipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços da microplaca.Nota: As amostras devem ser pipetadas de imediato, o tempo de incubação começa a contar após apipetagem da última amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.2. LavagemOs passos de lavagem são passos críticos e requerem uma atenção especial. A lavagem dos poçosquando realizada de modo inadequado, pode conduzir a resultados pouco precisos e a um elevadobackground. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com 200-300µL tampão de lavagem, por poço.A microplaca deve ser lavada com um lavador automático de microplacas ou manualmente de acordo comas indicações abaixo. Após a lavagem de modo automático, inverter a microplaca sobre papel absorvente,batendo suavemente, de modo a secar os poços completamente.Lavagem manual das microplacas:a. Deitar fora o conteúdo dos poços.b. Bater suavemente com a microplaca invertida sobre papel absorvente.c. Encher cada poço com 200-300µL de tampão de lavagem utilizando uma pipeta multicanal.d. Agitar suavemente a microplaca numa superfície plana.e. Repetir os passos de a-d duas vezes.f. Repetir a e b.3. Adição do conjugadoPipetar 100µL de conjugado em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo aremover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso deconjugado no frasco correspondente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.4. LavagemRepetir o descrito no passo 2.3

5. Adição de substrato (TMB)Pipetar 100µL de substrato (TMB) em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modoa remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso desubstrato (TMB) no frasco correspondente. Incubar, no escuro, à temperatura ambiente durante 30minutos.6. Paragem da reacçãoPipetar 100µL de solução de paragem em cada poço. Dá-se uma mudança de cor de azul para amarelo.7. Leitura da densidade ópticaLer a densidade óptica (DO) de cada poço a 450nm, num leitor de microplacas até 30 minutos após aparagem da reacção.Controlo de qualidade1. Controlo de qualidadePara que o teste seja válido, tem que obedecer aos seguintes critérios:• Os calibradores e controlos positivo e negativo devem estar incluídos em cada série.• Os valores obtidos para todos os controlos devem encontrar-se dentro do intervalo especificado peloCertificado de CQ.• A curva obtida deve ser similar à curva de calibração evidenciada no Certificado CQ.Caso os critérios acima referidos não sejam respeitados, o teste é considerado inválido e o testedeve ser repetido.2. Cálculo da média das densidades ópticas (somente para os ensaios realizados em duplicado)Para cada calibrador, controlo ou amostra calcular a média da DO das leituras em duplicado. Apercentagem do coeficiente de variação (%C.V.) para cada DO em duplicado deverá ser inferior a 15%.3. Curva de calibraçãoA curva de calibração pode ser traçada automaticamente ou manualmente, colocando a concentração deimunocomplexos em µg Eq/mL na escala logarítmica e as DO de cada calibrador na escala linear.• Automaticamente – utilizar um software adequado.• Manualmente – utilizar um papel log/linear, traçar a melhor curva através dos pontos obtidos, (nãotraçar uma linha recta, ou unir ponto por ponto).4. Tratamento de pontos anómalosCaso algum ponto se encontre fora da curva de calibração, este poderá ser retirado. A ausência destesignifica que a curva tem uma forma diferente da curva de calibração ou caso exista mais que um pontofora da curva, o teste deverá ser repetido.5. Cálculo dos valores CIC dos controlos e das amostrasDeterminar o nível dos imunocomplexos ligados nos controlos e nas amostras diluídas directamente apartir da curva de calibração. Os valores devem estar compreendidos entre o intervalo fornecido noCertificado do CQ. Nota: Os valores do calibrador foram ajustados por um factor de 100 para uma diluiçãode amostra de 1:101. Não é necessário mais nenhum tipo de correcção.6. Calibração do testeO teste é calibrado em µg Eq/mL por um calibrador de referência interno, cujos valores foram atribuídossegundo a preparação de referência da OMS para IgG humana agregada.Limitações do método1. Este kit é utilizado somente para diagnóstico. Um resultado positivo deve ser confirmado através de outrosdados clínicos e outros testes serológicos.2. Os resultados obtidos com este teste não constituem prova de diagnóstico da presença ou ausência dadoença.3. O soro poderá conter substâncias interferentes tais como agentes quelantes, ADN, autoanticorpos anti-C1q, factor reumatóide ou imunoglobulina monomérica.Valores esperadosO intervalo de referência foi determinado, utilizando soros de 200 dadores adultos saudáveis. O limite superiordeste intervalo é expresso em μg equivalente por mL (μg Eq/mL).O intervalo descrito em baixo serve apenas de referência. Os testes de ELISA são muito sensíveis e capazes dedetectar pequenas diferenças nas amostras. Recomenda-se que cada laboratório determine os seus intervalos dereferência, baseando-se em técnicas e equipamento utilizado.Valores esperados< 4,4μg Eq/mL Resultado negativo4,4 -

Distribuição normal da amostraNo. de amostras1401201008060402000-2 2.1-4 4.1-6 6.1-8 8.1-10 >10C1q CIC ug Eq/mLEste intervalo é fornecido apenas como referência. Recomenda-se que cada laboratório determine os seusintervalos de referência.Características de desempenhoPrecisãoA precisão intra- e inter-testes foi determinada utilizando três amostras dentro do intervalo da curva de calibração.A concentração e % C.V. para cada amostra está representada abaixo:PRECISÃO INTER-TESTEn=3 Concentração (μg Eq/mL) % C.V.Amostra 1 5,4 13,0Amostra 2 28,7 7,1Amostra 3 50,7 3,9PRECISÃO INTRA-TESTEn=16 Concentração (μg Eq/mL) % C.V.Amostra 4 5,3 7,2Amostra 5 24,0 5,5Amostra 6 67,4 7,5Sensibilidade AnalíticoA sensibilidade foi determinada calculando a concentração média + 2 DP de 20 determinações do diluente daamostra. O valor obtido é igual a 0,1μg Eq/mL.Especificidade, Sensibilidade e Concordãncia RelativasA especificidade, sensibilidade e concordância foram determinadas com base num kit alternativo de CIC-C1q EIA,tendo sido testadas 48 amostras, incluindo 29 de dadores adultos e 12 de doentes de SLE.EIA alternativo+ dúbio -+ 14 4 0BINDAZYMEdúbio 1 0 7C1q-CIC EIA- 0 1 21Sensibilidade relativa 95,0%Especificidade relativa 75,0%Concordância relativa 83,3%Para o cálculo da sensibilidade, especificidade e concordância relativas, os valores dúbios foram consideradoscom positivos.A correlação dos valores dos dois kits deu uma R 2 de 0,80.Substância InterferentesForam testados vários tipos de soro de modo a verificar o possível efeito de substâncias interferentes utilizandoum kit de verificação de substâncias interferentes Interference Check A plus TM - Kokusai, Shiyaku, Japão).SubstânciaBilirubina F (livre)Bilirubina C (conjugada)Hemoglobina hemolisadaquiloFactor reumatóideConcentração18,3mg/dL19,0mg/dL490mg/dL1930 Unidades500 IU/mLNão foram detectadas quaisquer interferências para as concentrações acima referidas de bilirubina, hemoglobinaou quilo, contudo o factor reumatóide (FR) interfere, devem ser efectuado um rastreio das amostras quecontenham factor reumatóide através de um teste de FR apropriado antes da determinação de C1q CIC.5

Intervalo de LeituraO intervalo de leitura do teste é de 1,23 - 100µg Eq/mL.Esquema da Microplaca1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGHSumário do Procedimento1. Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços.Incubar durante 30 minutos.Lavar.2. Adicionar 100µL de conjugado em cada poço.Incubar durante 30 minutos.Lavar.3. Adicionar 100µL de substrato em cada poço.Incubar durante 30 minutos.4. Adicionar 100µL de solução de paragem em cada poço.Ler as absorvâncias a 450nm.QUANTA Lite é uma marca registrada da INOVA Diagnostics, Inc.Copyright 2012 Todos os Direitos Reservados©6

Referências1. Hay FC et al.: Routine assay for the detection of immune complexes of known immunoglobulin classusing solid phase C1q. Clin. Exp. Immunol., 1976; 24: 396-400.2. Stanilova SA, Slavov ES: Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by threeassays - CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-C3 ELISA. J. Immunol. Meth, 2001; 253: 13-21.3. Van Hoeyveld E, Bossuyt X: Evaluation of seven commercial ELISA kits compared with the C1q solidphasebinding RIA for detection of circulating immune complexes. Clin. Chem, 2000; 46:283-5.4. Lambert PH: WHO collaborative study for the evaluation of immune complexes in serum. Clin LabImmunol., 1978; 1: 1-15.5. Espinoza LR and Osterland CK.: Circulating immune complexes. Their clinical significance. Futurepublishing Co., 1983.6. Abrass CK et al.: Correlation and Predictive Accuracy of Circulating Immune Complexes with DiseaseActivity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus . Arthritis Rheum., 1980; 23: 273-282.7. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon,GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute ofHealth, 2007, Fifth Edition.Fabricado por:INOVA Diagnostics, Inc.9900 Old Grove RoadSan Diego, CA 92131United States of AmericaTechnical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950support@inovadx.comRepresentante Autorizado:Medical Technology Promedt Consulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. Ingbert, GermanyTel.: +49-6894-581020Fax.: +49-6894-581021www.mt-procons.com624620PRT August 2012Revision 37