NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides - inova

NOVA Lite ® dsDNA Crithidia luciliae Kits/Substrate SlidesPer uso diagnostico In VitroCodice Prodotto: 708200, 708205508200.10, 508205.20, 508205.80Complessità CLIA: elevataFinalità d’usoNOVA Lite ® dsDNA Crithidia luciliae è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e ladeterminazione semi-quantitativa nel siero umano di DNA a doppia elica (dsDNA). La presenza di anticorpi diDNA a doppia elica, assieme ad altri test sierologici ed ai riscontri clinici, più essere di ausilio nella diagnosi dilupus eritematoso sistemico (LES).Riassunto e Spiegazione del testIl test NOVA Lite ® dsDNA Crithidia luciliae è un analisi degli anticorpi alla immunofluorescenza che utilizzacome substrato l’emoflagellato Crithidia luciliae. Questo organismo unicellulare possiede un mitocondriogigante che contiene una massa molto condensata di dsDNA circolare. 1 Questa massa di dsDNA, conosciutacome cinetoplasto, sembra essere privo di istoni e di altri antigeni nucleari di mammifero. 1,2 Viene utilizzatocome substrato sensibile e specifico per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti verso il dsDNA.Gli autoanticorpi verso il dsDNA si riscontrano quasi esclusivamente in pazienti affetti da lupus eritematososistemico (LES) e per questo vengono considerati degli anticorpi marker. Gli Autoanticorpi verso il dsDNAsono stati inclusi nei criteri revisionati per la classificazione del lupus eritematoso sistemico del 1982compilata da un sottocomitato della Arthritis and Rheumatism Association (associazione per patologieartritiche e reumatiche). 3L’analisi comunemente utilizzata Anticorpi Antinucleo (ANA) è un’analisi sensibile di screening per il LES edaltre malattie del tessuto connettivo, ma non è specifica del LES. Per tale motivo tutti i campioni risultatipositivi agli ANA dovrebbero essere analizzati per la ricerca di anticorpi specifici contro il dsDNA. Lapresenza di anticorpi verso il dsDNA indica fortemente la presenza di LES; tuttavia la loro assenza nonesclude il LES in tutti i casi.Nel corso degli anni si sono utilizzati una varietà di metodi per determinare la presenza di anticorpi verso ildsDNA. Questi metodi includono la fissazione del complemento 4 , l’agglutinazione passiva 5 e la RIA. 6-8 Ilvantaggio principale di un test per il dsDNA basato sul C. luciliae è la sua specificità, dovuta alla natura dellamassa di dsDNA circolare fortemente aggrovigliata nel cinetoplasto. 9-11 Questa caratteristica rivesteimportanza vitale per un analisi di un anticorpo markeri.Principio della MetodicaNel test all’immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell’antigene e glianticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specificomarcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando icampioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano unafluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legatol’autoanticorpo.Reagenti1. Crithidia luciliae, Vetrini (dsDNA), 6 o 12 pozzetti/vetrino, con essiccanteSolo kit2. Coniugato anti-IgG umano (capra) senza Evan’s blu, marcato alla fluoresceina in tamponecontenente azoturo di sodio allo 0,09%3. Positivo dsDNA 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi verso il dsDNAda siero umano, prediluito4. Controllo negativo sistema IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ma priva dianticorpi verso il dsDNA da siero umano, prediluito5. Concentrato PBS II (40x)6. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%7. CoprivetriniAvvertenze1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono statetestate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-H I V , p e BsAg r H e per anticorpi anti-HCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completadell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Positivo dsDNA ed ControlloNegativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. 122. La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica seingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piomboo rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità diacqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.1

MetodicaPrima di incominciare1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene.2. Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo ilcontenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata emescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e cometampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2-8°C.3. Diluire i campioni del paziente:a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:10 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere100 µl di siero a 900 µl di tampone PBS II).b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale pertutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:20, 1:40,... 1:640).Esecuzione del test1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino delsubstrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una cameraumida adeguata. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) dei controlli positivi e negativi non diluitirispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) del campione diluito del pazientenei rimanenti pozzetti.2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per 30 + 5 minuti in una camera umida (un tovagliolo dicarta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umiditàadeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d’esame.3. Lavare i vetrini: dopo l’incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta perlavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzionedel flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i varipozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Sevoluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti.4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II II in eccesso. Porre nuovamenteil vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugatofluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori 30 + 5 minuti.5. Lavare i vetrini: ripetere la fase 3.6. Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguentiprocedure sono raccomandate:a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta.b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino.c. Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con ilbordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che ilcollante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d’aria.Controllo di qualitàIl Positivo dsDNA ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo daassicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può prepararedell’ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. Irisultati dell’analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se unoqualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell’esame e si dovrebberipetere il test.1. Il Positivo dsDNA non diluito deve essere > 2+.2. Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo.Interpretazione dei risultatiReazione negativa. Un campione è considerato negativo se la colorazione specifica del cinetoplasto èinferiore rispetto a quella del controllo negativo. La colorazione di altre strutture quali il corpo basale, il flagelloo il nucleo senza una concomitante colorazione del cinetoplasto dovrebbe essere considerata negativa perreattività dsDNA.Reazione positiva. Un campione è considerato positivo se la colorazione specifica del cinetoplasto, oppuredel cinetoplasto più il nucleo, risulta più elevata rispetto al controllo negativo. Tutti i campioni positividovrebbero essere titolati utilizzando diluizioni seriali doppie fino all’estremo.Determinare il grado o l’intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri:4+ Fluorescenza verde chiaro brillante3+ Fluorescenza verde chiara accesa2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazionecinetoplasto rispetto alla fluorescenza di fondo3

Limitazioni del test1. L’utente dovrebbe essere a conoscenza degli effetti dell’eccesso di anticorpo e la possibilità diottenere pattern di colorazione non-dsDNA durante la lettura dei vetrini.2. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio afluorescenza utilizzato, la forza e l’età della lampadina, l’ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato el’osservatore.3. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numeromaggiore di artefatti di colorazione.4. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materialeper scrivere può causare artefatti.5. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante.L’utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti.6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico delpaziente e del risultato degli altri test sierologici.7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.I vetrini venduti separatamente vengono classificati come “Reagenti analita-specifici”.Ad eccezione di un componente del kit NOVA Lite ® dsDNA Crithidia luciliae Kit, le caratteristiche analitiche eprestazionali non sono stabilite.Valori attesiIl substrato NOVA Lite ® dsDNA Crithidia luciliae è stato utilizzato per analizzare una varietà di pazienti affettida malattie del tessuto connettivo ed anche 200 donatori di sangue scelti in maniera casuale. I risultatiappaiono qui di seguito:Gruppo di pazienti Numero Numero di positivi al NOVA Lite ® dsDNA Crithidia luciliaeLES 105 42Lupus indotto da droghe 24 0Artrite reumatoide 40 0Sclerodermia 24 0Dermatomiosite 14 0Sindrome di Sjögren 14 0Normali 200 04

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