Diss Dagmar Toepfer - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Methoden
anschließend verworfen und die RNeasy-Säulen auf 2 ml
Eppendorfreaktionsgefäße ohne Deckel überführt. Die Säulen mit der gebundenen
RNA wurden dann einmal mit 500 µl RW1-Puffer und zweimal mit 500 µl RPE-
Puffer versetzt und nach jedem Schritt für 3 min bei ca. 10000 x g zentrifugiert.
Danach wurden die Säulen in 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt und mit
jeweils 30 µl RNase-freiem Wasser versetzt. Die Proben kamen danach für 5 min
auf den Rüttler und wurden anschließend ein letztes Mal für 3 min bei 10000 x g
zentrifugiert. Die Säulen wurden verworfen und die extrahierte RNA bei
-80 °C gelagert.
3.6.2 Kontrolle der RNA-Qualität
Um die Nativität der extrahierten RNA zu überprüfen, wurde diese in einem
1%igem denaturierenden Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf das
Auftreten der 28S- und 18S-Banden der ribosomalen RNA (rRNA) hin untersucht.
Die Herstellung des Agarosegels ist dem Anhang (9.3) zu entnehmen. Im
Anschluss an die Herstellung des Gels wurden in heißem Zustand 9,6 ml 37%iges
Formaldehyd hinzugefügt und erneut für 30 s aufgekocht. Das Gel wurde in die
Kammer gegossen und polymerisierte innerhalb von 20-30 min. Jeweils 4 µl der
Proben wurden mit 4 µl Ladepuffer versetzt. Als RNA-Größenmarker wurden 2 µl
RNA-Ladder mit 2 µl Ladepuffer verwendet. Die Proben und der Größenmarker
wurden bei 70 °C für 10 min denaturiert und anschließend sofort auf Eis gelagert.
Als Elektrophoresepuffer wurde 1fach MOPS-Lösung (3-(N-morpholino)-
Propansulfonsäure-Lösung) verwendet. Jede Geltasche wurde mit 8 µl
Gesamtvolumen bzw. 4 µl beim Größenmarker gefüllt. Die Elektrophorese lief
konstant für 60 min bei 70 V und 400 mA. Aufgrund der
Ethidiumbromideinlagerungen des Ladepuffers konnte die Auftrennung der RNA in
28S- und 18S-rRNA Untereinheiten unter UV-Licht sichtbar gemacht und
fotodokumentatorisch festgehalten werden.
42