Direktor: Prof. Dr. med. habil. H. von Schwanewede

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Doppelstränge in Einzelstränge. Im zweiten Schritt, dem „Annealing“, erfolgt die
Anlagerung der komplementären Primer an definierte Abschnitte der Einzelstränge.
Die Primer sind synthetische Abschnitte aus einzelsträngiger DNA, die so
ausgewählt sind, dass sie komplementär zu einem bestimmten Abschnitt der
Einzelstränge der nachzuweisenden DNA im Untersuchungsmaterial sind. Die Primer
binden an die komplementären Bereiche der DNA-Einzelstränge und rahmen damit
den gesuchten DNA-Abschnitt ein. Die optimale Temperatur für das Annealing ist
abhängig von der Länge und der Basenfolge der verwendeten Primer und liegt bei
ca. 55°C. Nach Anlagerung der Primer entstehen zwei kurze Abschnitte
doppelsträngiger DNA, an die im dritten Schritt das Enzym Taq Polymerase bindet.
Mit Hilfe der Taq Polymerase erfolgt die Synthese der komplementären DNA-Stränge
zwischen den Primern. Die anschließende Elongation der Primer mit dNTPs zu
einem DNA-Doppelstrang erfolgt bei 72°C, so dass nach Ablauf eines Zyklus‘, zwei
neue, mit der Ausgangs-DNA identische Doppelstränge, entstehen. Wiederholt man
den Zyklus, erzielt man anschließend die vielfache Menge an Ausgangs-DNA
(Mülhardt, 2006).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum Nachweis der DNA von P. jirovecii in den
Probandenproben eine „nested“-PCR verwendet. Dazu wird zunächst eine PCR
durchgeführt und die Amplifikate dieser PCR werden für eine zweite PCR mit neuen
Primern verwendet. Das zweite Primerpaar bindet spezifisch innerhalb des in der
ersten Stufe produzierten DNA-Fragments, so dass unspezifische Amplifikate aus
der ersten Stufe der PCR ausselektiert werden und nochmals eine vielfache
spezifische Vervielfältigung von Pneumocystis DNA stattfindet. Daher lassen sich mit
der „nested“-PCR sehr geringe Mengen der gesuchten DNA nachweisen (Chelly J. et
al.,1989). Die Methode der „nested“-PCR erreicht eine Spezifität von 95% und eine
Sensitivität von 93% (Totet et al., 2003).
In der Bevölkerung ist eine hohe Antikörperprävalenz nachweisbar. Bis zu 90% der
gesunden Normalbevölkerung haben ab dem 10. Lebensjahr Antikörper gegen P.
jirovecii, was auf einen frühen Kontakt mit dem Erreger im Kindes- und Jugendalter
hindeutet (Riebold et al., 2005).