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4. Young Investigator Osteologie Symposium (YIOSS)
V 4.1 Zoledronic acid suppresses the Wnt inhibitor
Dickkopf-1 in breast cancer in vitro and in vivo
tilman Rachner 1 , Andy Goebel 1 , Martina Rachner 1 , Peyman Hadji 2 , lorenz
C. Hofbauer 1
1 Uniklinik Dresden, Medizinische Klinik III, Endokrinologie, Dresden; 2 Uniklinik Marburg,
Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe, Marburg
Introduction: Bone metastases are a serious complication of breast cancer.
Dickkopf-1 (Dkk-1) is an endogenous inhibitor of the Wnt pathway that affects
bone formation by inhibiting osteoblasts. We have previously described
Dkk-1 as a novel target of the mevalonate pathway in breast cancer. However,
the downstream pathway, its inhibitory mode of action on osteoblastogenesis,
and the in vivo relevance of this finding have remained unclear.
Methods: We analyzed the role of the small GTPases Cdc42, RhoA and Rac1
on the regulation of Dkk-1 by zoledronic acid (ZA) using chemical inhibitor
and activator approaches as well as siRNA techniques. Furthermore, we assessed
the potential of breast cancer-derived Dkk-1 to affect OPG signaling in
C2C12 cells. We also evaluated the effect of ZA treatment on Dkk-1 serum levels
in patients with non-metastasized estrogen receptor-negative breast cancer.
Results: We found that Dkk-1 suppression by atorvastatin and ZA was reversed
by GGPP, but not by FPP, indicating a regulation via geranylated proteins.
Hence, C. difficile toxin B, which specifically inactivates Rho, Rac and
Cdc42, was used to treat MDA-231 cells to further differentiate our target protein.
Treatment decreased Dkk-1 expression by more than 50%. Furthermore,
specific inhibitors to RhoA, Rac1 and Cdc42 were used. Here, Cdc42 resulted
in a profound suppression of Dkk-1. The role of Cdc42 was confirmed using
siRNA. On the other hand, Dkk-1 expression was restored in ZA treated
MDA-231 cells, after exposure to a Rho/Rac/Cdc42 activator. The C2C12 myeloblast
cell line is used to study effects of Wnt signaling on osteoblastogenesis.
In the presence of Wnt-3A, there is a strong induction of osteoprotegerin
(OPG) within 48 h. This effect was reversed by recombinant Dkk-1. Supernatants
of breast cancer cell lines with a strong expression of Dkk-1 inhibited
the induction of OPG, whereas cell lines with low Dkk-1 levels did not. When
treating MDA-231 cells with ZA and thereby suppressing Dkk-1, the inhibitory
effects of the supernatant on OPG expression were diminished. We investigated
the effect of repeated treatment with ZA on serum levels of Dkk-1 in patients
with ER- negative breast cancer, but no bone metastases. Dkk-1 serum
levels were reduced in all patients after 6 months (on average by >50%). At the
same time markers on bone turnover were also decreased.
Discussion: The Wnt inhibitor Dkk-1 is suppressed by statins and ZA via the
small GTPase Cdc42. Breast cancer derived Dkk-1 has the ability to inhibit
Wnt-3A induced OPG expression in C2C12 cells and this effect can be reversed
by prior exposure of breast cancer cells to ZA. ZA treatment results in
a robust suppression of Dkk-1 serum levels in patients with ER-negative breast
cancer for 6 to 12 months. The clinical implication of these findings requires
further analyses.
Keywords: breast cancer, dickkopf-1, zoledronic acid, atorvastatin, Cdc42
Korrespondenzadresse: Tilman Rachner, Uniklinik Dresden, Medizinische
Klinik III, Endokrinologie, Fetscherstr. 74, 01307 Dresden, Deutschland, E-
Mail: tilman.rachner@uniklinikum-dresden.de
V 4.2 Zoledronsäure hemmt die αvβ3-Integrin vermittelte
Adhäsion von Brustkrebszellen
Maria Junker1 , Andy Goebel1 , l.C. Hofbauer1 , t.D. Rachner1 1Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Dresden, Medizinische Klinik III,
Endokrinologie, Dresden
Einleitung: Brustkrebs ist die häufigste Todesursache bei Frauen in den westlichen
Staaten zwischen dem 30. und 60. Lebensjahr. Bei ca. 70 % der erkrankten
Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium treten Knochenmetastasen auf,
was zu einer drastischen Verschlechterung der Prognose führt. Bisphosphona-
OSteOlOGIe 2013 Weimar
te gelten als etablierte Therapie von Knochenmetastasen. Neben ihren antiresorptiven
Eigenschaften werden auch direkte anti-Tumor-Effekte diskutiert.
Einige dieser Eigenschaften könnten durch die Hemmung des Mevalonatweges
vermittelt werden. Daher wurde der Einfluss von Zoledronsäure und Atorvastatin,
Inhibitoren des Mevalonatweges, auf das Adhäsionsverhalten von Brustkrebszellen
untersucht.
Methode: Die Brustkrebszelllinien MDA-MD-231 und MDA-Bone wurden
mit Zoledronsäure und Atorvastatin behandelt und mittels Adhäsionsassays
auf 96-Well-Platten mit unterschiedlichen Oberflächen untersucht. Das
Bindungsverhalten der Tumorzellen an spezifische Integrine wurde mit einem
Integrinarray-Combo-Kit analysiert. Durch diese Bindungsanalyse lassen
sich Rückschlüsse auf die Bedeutung einzelner Integrine in Bezug auf das Gesamtadhäsionsverhalten
der Zelllinien treffen. Die erfolgreiche Hemmung des
Mevalonatweges wurde mittels Western Blot nachgewiesen.
Ergebnisse: Die Behandlung mit Zoledronsäure (100 µM) reduzierte die Adhäsion
von MDA-MB-231- und MDA-Bone-Zellen auf Gelatine (einem αvβ3-
Liganden) um bis zu 80%. Die Behandlung mit Atorvastatin (10 µM) führte
zu einer Reduktion der Adhäsion um ca. 60 %. Der Einfluss auf die Adhäsion
war in beiden Fällen dosisabhängig. Auch auf Vitronektin und Fibronektin
beschichteten Platten zeigte sich nach Behandlung eine reduzierte Adhäsion
der MDA-MB-231 Brustkrebszellen. Ähnlich verhielt es sich mit GGTI-298
(5 µM), einem selektiven Inhibitor der Geranylgeranyltransferase I. Hingegen
wurde auf Kollagen Typ I beschichteten Platten (einem α2β1-Ligand) kein negativer
Effekt nachgewiesen. Der antiadhäsive Effekt von Zoledronsäure konnte
durch die gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Geranylgeranylpyrophosphat
vollständig aufgehoben werden. Mevalonat und Farnesylpyrophosphat,
weitere Substrate des Mevalonatweges, zeigten jedoch keinen Effekt. Die effektive
Hemmung des Mevalonatweges bzw. die selektive Hemmung der Farnesylierung
und Geranylierung wurde mittels Western-Blot Analyse von RAS und
RAP1A belegt. Mittels Integrin-Array wurde der Einfluss von Zoledronsäure
auf die Adhäsion der MDA-231-Zellen an spezifische Integrine untersucht.
Nach der Behandlung der Zellen mit Zoledronsäure zeigte sich eine stark reduzierte
Bindung der Zellen an αvβ3.
Diskussion: Unsere Daten deuten darauf hin, dass die αvβ3-abhängige Ad-
häsion von Mammakarzinom-Zellen durch Modulation des Mevalonatweges
beeinflusst wird und geben somit weiteren Aufschluss über die molekularen
Mechanismen möglicher Antitumor-Effekte durch Zoledronsäure.
Keywords: Brustkrebs, Adhäsion, Mevalonatweg
Korrespondenzadresse: Maria Junker, Universitätsklinikum Carl Gustav
Carus Dresden, Medizinische Klinik III , Endokrinologie, Fetscherstraße 74,
01307 Dresden, Deutschland, E-Mail: mariajunker@gmx.net
V 4.3 Fibronektin modifiziert die VeGF-Menge im
tumorgewebe und somit die tumorangiogenese
Anja von Au1 1MPI für Biochemie Martinsried; Uniklinik Heidelberg, Uniklinik Heidelberg, Institut für
Immunologie, Heidelberg
Einleitung: Die Angiogenese ist von der lokalen Expression des Matrixproteins
Fibronektin (FN) abhängig. Die Rolle des zirkulierenden FN bei der Blutgefäßbildung
in Tumoren konnte durch eigene Arbeiten in konditionellen
Knockoutmäusen (cKO) mittels Cre-loxP-System aufgezeigt werden. Der verwendete
Albumin-Promoter schaltet spezifisch Hepatozyten aus und vermindert
das zirkulierende FN um ca. 87%. Den Mäusen wurde die humane Brustkrebskarzinomzelllinie
MDA-MB-231 intratibial injiziert. Das Tumorwachstum
der cKO war gegenüber zu den Kontrollen (CT) aufgrund einer verminderten
Gefäßdichte (53%, p