Teil 3 - Institut für Analytische Chemie - Universität Wien

Grundlagen der
Chromatographie
Christopher Gerner
Universität Wien

Aufgaben und Ziele chromatographischer Verfahren
• Trennung komplexer Gemische in Einzelsubstanzen
• Reinigung von Einzelsubstanzen von etwaigen Verunreinigungen
• Quantifizierung von Einzelsubstanzen aus komplexen Gemischen
Chromatographie ist das wichtigste Trennverfahren in der analytischen Chemie.
Literaturhinweis: Als Grundlage und Quelle von Abbildungen wurde v.a. herangezogen:
Matthias Otto: Analytische Chemie, Dritte Auflage, WILEY-VCH 2006

• Gedankenexperiment:
homogenisierter Spinat wird in
Schütteltrichter Ether/Wasser
ausgeschüttelt. Welche Substanzen
erwarten wir in welcher Phase und
warum?
Extraktion
Abb.: Wikipedia

Extraktion
Als Extraktion bezeichnet man das Herauslösen eines Stoffes aus einer Lösung
oder aus einem Feststoffgemisch. Dabei wird der in der Phase L'
enthaltene Stoff durch eine zweite Phase L" zu einem bestimmten Anteil
entfernt.
Die Lösung des Stoffes in L" heißt Extrakt, die nach der Extraktion an dem
Stoff verarmte Phase L' heißt Raffinat.

NERNSTscher Verteilungssatz
Ein Stoff verteilt sich so zwischen zwei nicht mischbaren Phasen, dass das
Konzentrationsverhältnis in den beiden Phasen bei konstanter Temperatur
einen konstanten Wert annimmt.
K=c‘‘/c‘
K: NERNSTscher Verteilungskoeffizient
c' bzw. c‘‘ charakterisieren die Konzentrationen (genauer die Aktivitäten)
eines Stoffes in den beiden Phasen L' (Raffinat) bzw. L´´ (Extrakt).
Voraussetzung ist Verteilungsisotherme:
zB. Iod im System Wasser /Kohlenstoffdisulfid
C I2 (CS 2)
(aus: Otto p123)
C I2 (H 2O)

Überlagerte Gleichgewichtsreaktionen:
Gesamtkonzentrationen der verschiedenen Carbonsäureformen in
Benzol und Wasser:
Verteilungsverhältnis D:
(aus: Otto p124)

Einfache und wiederholte Extraktion I
Extraktionszahl, E: Quotient aus den Substanzmassen m' und ‘‘ in den beiden
Phasen
V‘ und V": Volumina der Phasen L ‘ und L"
Trennfaktor für zwei Verbindungen A und B, T A,B : Verhältnis der
Extraktionszahlen für A und B

Einfache und wiederholte Extraktion II
Relative Substanzmasse p und q für die Phasen ´ und ``:
Bei einer einmaligen Ausschüttelung geht also die Menge p in den
Extrakt und die Menge q verbleibt im Raffinat. Bei einer zweiten
Extraktion mit einer frischen Oberphase im gleichen Volumen-
verhältnis wird aber die Menge pq in die Oberphase überführt
und in der Unterphase verbleibt q 2 .

Einfache und wiederholte Extraktion III
Nach n Extraktionen verbleibt im Raffinat:
In den vereinigten Extrakten befindet sich:
Beispiel Substanz mit K=1, Verteilung zwischen Wasser und Ether
für 50ml zu 50ml: für 200ml zu 50ml:

(aus: Otto p127)

CRAIG-Verteilung I
(aus: Otto p129)

CRAIG-Verteilung II
(aus: Otto p130)
Berechnung der
relativen Substanzmenge T n,r
für n-ten Verteilungsschritt
in Fraktion r:

1906 von Botaniker Michael Tswett
(Russland) eingeführt
Ursprünglich Chlorophylle von
Xantophyll Spirilloxanthin
getrennt – daher der Name
(Auftrennung von Farbstoffen)
Chromatographie:
(aus: Otto p435)

Dünnschicht-Chromatographie
Retentionsfaktor R f: Wanderungsweite relativ zum Laufmittel entspricht
Aufenthaltswahrscheinlichkeit in mobiler Phase.
R St entspricht der Retention relativ zu einem internen Standard
R m entspricht dem Logarithmus des Verteilungskoeffizienten, R m -Werte zB. einer Reihe
aliphatischer Carbonsäuren ergeben eine Gerade (aus: Schwedt p394)

Kenngrößen eines Chromatogramms I
Verteilungskoeffizient K, Konzentration in stationärer Phase c s, in mobiler Phase c M
K=c S/c M
tM (Mobilzeit oder besser Durchflußzeit), auch kurz Totzeit, enthält die Verweilzeit vom
effektiven Injektionspunkt bis zum effektiven Detektionspunkt.
Totale Retentionszeit tR: Detektion der gesuchten
Komponente
(aus: Otto p437)

Kenngrößen eines Chromatogramms II
Mittlere Wanderungsgeschwindigkeit einer Komponente, v
bzw. für die Moleküle der mobilen Phase, u:
L: Länge der Säulenpackung
Die Retention einer Substanz entspricht der
Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der mobilen Phase:

Kenngrößen eines Chromatogramms III
Mit Verteilungskoeffizienten, K=c S/c M:
Kapazitätsfaktor, k´‚ (auch Retentionsfaktor), entspricht einen nach experimentellen
Bedingungen korrigierten Verteilungskoeffizienten
Der Quotient V M/V S wird als Phasenverhältnis ß bezeichnet
Oben eingesetzt ergibt :
Damit direkter Zusammenhang
Wanderungsgeschwindigkeit mit Verteilungskoeffizienten

Aus:
Kenngrößen eines Chromatogramms IV
Ergibt sich:
Umgerechnet:
Typischerweise liegt der Kapazitätsfaktor k´ zwischen 1 und 10
Trennfaktor (auch Selektivitätsfaktor):

Die chromatographische Theorie:
Beschreibung der Trennleistung einer Säule
MARTIN und SYNGE (Nobelpries 1952): Einführung der Begriffe Trennstufenhöhe und
Trennstufenzahl. Eine Einstellung des Gleichgewichtes zwischen stationärer und
mobiler Phase entspricht einem „theoretischen Trennstufen-Boden“.
Als Trennstufenhöhe, H, oder theoretische Bodenhöhe wird das Verhältnis der Varianz
des Peaks (Varianz entsprechend einer GAUSS-Verteilung, als Quadrat der
Standardabweichung σ) und der Wanderungsstrecke (Säulenlänge, L, oder
Retentionszeit, t R) verstanden (Länge in cm, Zeit in Sekunden):
Die Trennstufenzahl, N, ergibt sich aus der Trennstufenhöhe, H, und der Länge der
Säule, L, zu:

Beschreibung der Trennleistung einer Säule II
Ermittlung der Standardabweichung σ als Maß für die Peakbreite aus dem
Chromatogramm über die Basislinienbreite w=4 σ t oder die
Halbwertsbreite b 1/2 (Breite des Peaks in halber Peakhöhe h).
Die Trennstufenzahl kann aus einem Chromatogramm praktisch am besten durch
Ausmessen der Retentionszeit und der Halbwertsbreite b 1/2 des Peaks ermittelt
werden: N=5,54(t R/b 1/2) 2
(aus: Otto p440)

Kinetische Theorie: Zusammenhang zwischen Trennstufenhöhe
und Lineargeschwindigkeit
(aus: Otto p442)

Kinetische Einflüsse zur Peakverbreiterung I
Größen, die durch die jeweiligen experimentelle Bedingungen definiert werden:

Kinetische Einflüsse zur Peakverbreiterung II
abgeleitete Größen

Kinetische Einflüsse zur Peakverbreiterung III
Van Deemter-Gleichung
(modifiziert):
Trennstufenhöhe
Massenübertragung
von und zu stationärer Phase
Massenübertragungsterm
der mobilen Phase
Longitudinaldiffusion
(aus: Otto p444)

Effektive Trennungen in kurzen Zeiten:
• Geringe Korngrößen fester bzw. geringe Filmdicken immobilisierter flüssiger
stationärer Phasen
• Homogen Packungen der stationären Phase unter Verwendung engverteilter
Packungsmaterialien
• Kleine Säulendurchmesser
• Große Diffusionskoeffizienten in der stationären Phase und kleine
Diffusionskoeffizienten in der mobilen Phase

Die Auflösung R S als Maß für die Peaktrennung
Trennung von zwei Gauß-artigen
Peaks unter Verwendung ihrer
Basisbreiten ω
Für gilt:
Daraus folgt:
(aus: Otto p446)

Optimierung einer Trennung:
Unabhängige Optimierung der Auflösung
durch Variation von Trennfaktor α,
Kapazitätsfaktor k‘ und
Trennstufenzahl N (bzw. H):
• Variation der Temperatur in GC oder
Zusammensetzung der mobilen Phase bzw.
Wechsel der stationären Phase
in LC für α und k‘
• Säulenlänge für N bzw. Trennstufenhöhe, diese wird beeinflusst durch
Strömungsgeschwindigkeit, Korngröße, Viskosität der Phasen und damit
Diffusionskoeffizienten

Die Peakkapazität gibt die Anzahl
der Peaks wieder, die bei
Aneinanderreihung
basisliniengetrennter Peaks auf
einer definierten Trennstrecke
Platz finden
Peakkapazität
(aus: Otto p449)

Gaschromatographie
Trägergasfluss bei gepackten Säulen 25-150 mL min -1
bei Kapillaren 1-25 mL min -1
(aus: Otto p454)

Liner: Verdampfungsröhrchen
Einspritzvolumen 0.5-20µl
Bei Kapillaren bis zu 1nl möglich
(Splitinjektionssysteme)
Probengeber, Säulen
Trennsäulen: Stahl, Glas, v.a. aber Quarz
(fused silica)
Gepackte Säulen: 3-8mm Durchmesser;
1-3m Länge
Kapillarsäulen: kein Trägermaterial, nur
Oberfläche beschichtet,
0,15-1mm Durchmesser, bis 100m lang
(aus: Otto p455)

Detektoren I
• Wärmeleitfähigkeitsdetektor: Wärmeleitfähigkeit von Helium
oder Wasserstoff (Trägergas) ist 6-10 mal höher als für
organische Verbindungen. Gemessen wird die
Widerstandsänderung an einem Heizdraht.
• Flammenionisationsdetektor: Gemessen wird die Änderung
der elektrischen Leitfähigkeit einer Wasserstofflampe in
einem elektrischen Feld bei der Zuführung organischer
Verbindungen. Solche werden in der Wasserstofflampe
pyrolysiert und bilden bei Oxidation mit Sauerstoff Ionen aus.
Der Ionenstrom wird über eine Sammelelektrode als
Spannungsabfall aufgezeichnet.
• Elektronenanlagerungsdetektor (Electron Capture Detector
ECD): β-Strahler wie Tritium oder 63Ni erzeugen eine
kontinuierliche Elektronenwolke im Trägergas. Organische
Verbindungen mit elektrophilen Gruppierungen (Halogene,
Peroxide, Chinone, Nitrogruppen…) können Elektronen
einfangen.
(aus: Otto p457)

Detektoren II
Spezielle Detektoren:
Thermoionischer Detektor (TID): Hochspezifischer Flammen-Detektor mit Rubidiumhaltiger
Glasperle an glühendem Platindraht, v.a. Nachweis von Stickstoff und Phosphor
Flammenphotometrischer Detektor (FPD): Messung des Emissionslichtes bei
Verbrennung in Wasserstoff-Luft-Flamme
Atomemissionsdetektor (AED): nach Atomisierung und und Anregung in Helium-
Mikrowellenplasma wird Element-spezifisches Emissionslicht im Photometer bestimmt.
Massenspektrometrischer Detektor (MS): Bestimmung von m/z

(aus: Otto p461)
Gas-Flüssig-Chromatographie
WCOT: Wall Coated Open Tubular (Dünnfilmkaplliare)
SCOT: Support Coated Open Tubular (Flüssigkeit befindet sich
auf poröser Trägerschicht)
Desaktivierung von Kieselgeloberflächen: zB. Umsetzung von
Silanolgruppen mit Dichlorsilan und Methanol

Trennflüssigkeiten

Typische Wechselwirkungen zwischen den
Analyten und der stationären Phase
• unspezifische Dispersionskräfte (LONDON-Kräfte), die für die Alkane oder für
Benzol typisch sind;
• Orientierungskräfie (KESSOM-Kräfte) zwischen permanenten Dipolen, z. B. bei
Wasserstoffbrückenbindungen;
• Induktionskräfte (DEBYE-Kräfte) zwischen permanenten und induzierten Dipolen;
• Chemische Bindungskräfte in Form von Ladungs-Übertragungs-Komplexen etwa
zwischen einem Aromat und dem Metallion einer chiralen Phase.

Bestimmung von Retentionsindex nach KOVATS
Definitionsgemäß haben die n-Alkane bei jeder Temperatur auf allen Trennsäulen
einen Index von 100 mal die betrefende Kohlenstoffzahl, (zB n-Hexan: 600)
(aus: Otto p466)

Einfluss von Temperatur/Gradient
(aus: Otto p469)

Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
(aus: Otto p475)

Funktionseinheiten für HPLC
(aus: Otto p477)

(aus: Otto p480, 482)
Detektoren

Elektrochemische Detektoren:
(aus: Otto p483)
Konduktometrische Detektion für Ionenchromatographie
mit Durchflusskonduktometer
Voltammetrische Detektion: Aufzeichnung von Strom-Spannungskurven
Amperometrische Detektion: für alle Stoffe einsetzbar, die sich im Potentialbereich
der Arbeitselektrode oxidieren oder reduzieren lassen.
Nachteil: ev. reaktive Umsetzung (Vergiftung) der Elektrodenoberfläche

Verteilungschromatographie;
Normalphasen/Umkehrphasen- Chromatographie
Normalphase:
stationäre Phase hydrophil
mobile Phase hydrophob
Umkehrphase:
stationäre Phase hydrophob
(C18: Länge der Kohlenstoffkette)
mobile Phase hydrophil
(aus: Otto p486)

Lösungsmittelgemische, eluotrope Reihe

Gelchromatographie
Anwendungen: Größendiskriminierung von
Komplexen, Entsalzung von Proteinlösungen
(aus: Otto p500, 505)

Adsorptionschromatographie
Grundlage der Retention sind nicht verschiedene Löslichkeiten,
sondern Adsorptionsvorgänge an der Oberfläche der stationären Phase
Adsorption läuft lokalisiert an aktiven
Zentren der Oberfläche ab.
Bewertung von Solventien durch
Elutionsstärke ε statt Polaritätsindex.
Die Elutionsstärke ist ein Maß für die
Adsorptionsenergie des Solvens pro
Fläche
Durch Adsorptionschromatographie ist
die Trennung auch von
Stellungsisomeren bzw.
Stereoisomeren möglich

Ionenaustauschchromatographie I
Ionenaustauscher sind Makromoleküle, wie zB Co-Polymerisat aus Sterol und
Divinylbenzol, mit kationischen bzw. anionischen funktionellen Gruppen.

Ionenaustauschchromatographie II
zB. Auftrennung von Metallionen als Chlorokomplexe an basischem
Anionenausauscher
Die Elution erfolgt durch stufenweise geringere Salzsäurekonzentrationen.
Die Reihenfolge entspricht der Stabilität der Chlorokmplexe
(aus: Otto p496)

Ionenchromatographie mit Suppressorsäule
Ionen werden konduktometrisch detektiert, die Konzentration eluierter Ionen
liegt aber oft weit unter der Ionenkonzentration des Eluenten.
Daher: Kopplung mit Suppressorsäule, welche Ionen des Eluenten in
ungeladene Moleküle umwandelt:
Für Bestimmung von Anionen Einsatz von Kationentauscher in der sauren
Form (der Eluent besteht aus NaHCO3/Na2CO3): Die zu bestimmenden Ionen wie Cl - oder NO 3 - gehen im Suppressor keine
Reaktion ein, sie können daher über ihre Leitfähigkeit empfindlich bestimmt
werden.