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Material und Methoden 49
CD8
CD25
CD45R
Monoklonal,
Ratte-anti-Maus
Monoklonal,
Ratte-anti-CD25
biotiniliert
Monoklonal,
Ratte-anti-CD45R
biotiniliert
keine 1:6000
keine 1:1200
keine 1:2000
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
PBS
1% BSA
ZS
Kaninchenanti-Ratte
/ /
/ /
ZS: Ziegennormalserum, PBS: phosphat buffered saline, BSA: Bovines Serumalbumin, GFAP: saures Gliafaserprotein,
CNPase: 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-Phoshodiesterase, CD: cluster of differentiation, Oberflächenantigene,
BDV-N: BDV-Nukleoprotein, BDV-GP: BDV-Glykoprotein, BDV-N: BDV-Nukleoprotein
3.5.2 Protokolle der immunhistologischen Färbungen (ABC-Methode)
Der Nachweis der Antigene erfolgte in Anlehnung an die von HSU et al. (1981) beschriebene
und von WÜNSCHMANN et al. (1997) modifizierte Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
(ABC)- Methode:
3.5.2.1 Protokoll für Formalin-fixierte und in Paraffin-eingebettete Schnitte
1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost ® plus Objektträger, anschließend im
Wärmeschrank bei 57°C mindestens 30 Minuten trocknen lassen.
2. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe: Rotihistol ® (2 x 5
Minuten), Isopropylalkohol (5 Minuten), 96%iger Alkohol (3 Minuten).
3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml Alkohol + 3 ml 30% H2O2 für 30
Minuten bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer.
4. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS (9.3.1) für je 5 Minuten.
5. Demaskierung der Antigene je nach verwendetem Primärantikörper (Vorbehandlung,
Tab. 6)
6. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.
7. Verbringen der Schnitte in Coverplates TM und Sequenza ® -Einsätze (Thermo Electron,
Dreieich) und Auftragen von 100 µl Blocking-Serum (Tab. 6) zum Blockieren
unspezifischer Bindungsstellen.
8. Auftragen von je 100 µl verdünntem (Tab. 6) Primärantikörper bzw. Kontrollserum
und Inkubation der Schnitte über Nacht bei 4°C im Kühlschrank.