3. Materialien und Methoden - Martin-Luther-Universität Halle ...

3.5.2.2. Aktive Aufnahmemechanismen
Inhibierung aktiver Transportprozesse:
Um aktive Aufnahmeprozesse näher charakterisieren zu können, muss während der
Versuchsdurchführung im Gegensatz zur passiven Fusion eine Temperaturkonstanz von 37°C
gewährleistet sein. Die Auswirkungen metabolischer Inhibitoren stehen im Mittelpunkt der
Untersuchungen. Des Weiteren sollen die Auswirkungen von Spindelgiften und die Blockade
rezeptorvermittelter Aufnahmemechanismen in Bezug auf die Internalisierungsfähigkeit der
Zellen näher untersucht werden.
Verwendete Inhibitoren:
Antimycin A 1µg/ml in Ethanol (Endkonz. max. 1%)
Cytochalasin D 20µg/ml in DMSO (Endkonz. max. 1%)
Formaldehyd 2%
Natriumazid 0,1%
Kaliumentzug „hypotonic shock procedure“
Das Verfahren des Kaliumentzugs stammt von Larkin [Larkin et al. (1983)] und
blockiert selektiv nur rezeptorgesteuerte Aufnahmevorgänge. Dafür wurden die HUVEC
dreimal mit Puffer A (50mM HEPES, 100mM Natriumchlorid, pH 7,4) gespült, 5 Minuten im
hypotonischen Medium (M199 incl. Zusätze: Milli Q 1:1) inkubiert und anschließend einer
weiteren Inkubation von 10 Minuten in Puffer A überlassen. Alle anderen Inhibitoren wurden
in den jeweiligen Konzentrationen in Medium M199 hergestellt. Zum Schutz der HUVEC
erfolgte damit eine Präinkubation von 30 Minuten.
3.6. pH-sensitive Immunoliposomen
3.6.1. pH-abhängiges Freisetzungsverhalten
Die pH-Sensitivität als liposomale Eigenschaft drückt sich grundlegend in einer
besonderen Lipidzusammensetzung aus. Anstelle von SPC/Chol wurde für diese Liposomen
die Zusammmensetzung DOPE/CHEMS gewählt. Sie lagen in einem molaren Verhältnis von
6:4 vor. Als pH-insensitive Lipidmischung (Blindprobe) wurde DPPC/CHEMS (6:4)
verwendet. Alle anderen Parameter (Antikörper, PEG-PE 1-5 mol%, Kopplungsanker) fanden
weiterhin ihre Berücksichtigung und wurden zusätzlich zum molaren Verhältnis der
Grundlipide hinzugegeben. Beide Lipidzusammensetzungen wurden mit einem Gesamtlipidgehalt
von 10µmol/ml über die Phasenumkehrmethode hergestellt. Für diese Untersuchungen
wurde 100mM Calceinlösung hergestellt und auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die
Liposomen wurden zuvor entsprechend der Vorgaben mit Ankermolekülen für spätere
Antikörperkopplungen und PEG-Anteilen modifiziert. Nach Abtrennung von freiem
unverkapselten Calcein durch eine Sephadex ® -G-50-Säule bzw. von ungebundenen
Antikörpern durch eine Sepharose ® -4B-Säule konnten die Liposomen in schwarzen 96-well-
3.6. pH-sensitive Immunoliposomen
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