3. Materialien und Methoden - Martin-Luther-Universität Halle ...

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Die Immunoliposomen wurden mit N-Glut-PE und unspezifischen humanen Antikörpern funktionalisiert. Als FRET-Marker kamen Lissamine ® Rhodamine-B-DPPE und NBD- DPPE zum Einsatz. Beide Fluoreszenzfarbstoffe wurden gemeinsam in die Immunoliposomen zu je 1mol% über die Phasenumkehrmethode symmetrisch eingebaut. Die künstlichen Endosomen kamen ungelabelt zum Einsatz. In die wells wurden je nach Versuchsaufbau ungelabelte und gelabelte Liposomen zur Reaktion gebracht. Die Fluoreszenzmessungen wurden bei pH 7,4 und pH 4,4 in schwarzen 96-well-Platten durchgeführt. Mit Hilfe des Fluostars wurde bei folgenden Wellenlängen gemessen: - Ex.485nm/Em. 520nm - Ex.485nm/Em. 590nm Die Veränderung der Messwerte wurde über 60 Minuten erfasst und ausgewertet. Zur Berechnung der prozentualen Fusionsereignisse wurde im Anschluss Triton-X-100 (1% Endkonzentration) hinzugegeben, wobei der resultierende Fluoreszenzwert als 100%-ige Fusion interpretiert wurde. 3.6.4. In-vitro-Studien 3.6.4.1. Targetierung und fluoreszenzmikroskopische Auswertung Für die Versuche wurden pH-sensitive und pH-insensitive Liposomen bekannter Lipidzusammensetzung verwendet. Um die Beladungskapazität zu erhöhen, wurde die eingesetzte 100mM Calceinlösung (pH 7,4) mit Hilfe der Phasenumkehrmethode in die Liposomen gebracht. In einer weiteren Liposomenpopulation wurde NBD-PE in die Membran als Fluoreszenzmarker eingebaut. An die Liposomen wurde über N-Glut-PE der spezifische humane Anti-E-Selektin-Antikörper gekoppelt. Gelchromatografische Reinigungsschritte mit Sephadex ® bzw. Sepharose ® folgten. Die verwendeten humanen Nabelschnurendothelzellen der 2. bzw. 3. Passage wurden durch Trypsinisieren aus den Kulturschalen geerntet. Es schloss sich ein Ausplattieren auf dünnen Glasplättchen an. Die Plättchen hatten eine Dicke von 0,5mm. Pro Glasplättchen wurden 200000 HUVEC benötigt. Die Zellen wurden auf den Glasplättchen im Brutschrank über Nacht kultiviert und bildeten dabei eine konfluente Monolayer. Am nächsten Tag erfolgte die Stimulierung mit IL-1β. Danach wurden die Zellen mit Liposomen in einem Verhältnis von 2µmol Lipid / 1×10 6 Zellen im Brutschrank für 90 Minuten inkubiert. Ein Spülvorgang mit PBS zur Abtrennung ungebundener Liposomen folgte im Anschluss. Daran schloss sich eine Betrachtung der Zellen im konventionellen Modus eines Fluoreszenzmikroskops an. Da das Fluoreszenzmikroskop Axiovert 135 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) in Kombination mit einem Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 410 invert, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) eingesetzt werden konnte, folgte anschließend eine Betrachtung im konfokalen Modus, wobei Einzelbilder in Schnittebenen zu je 0,5µm entstanden. Die Fluoreszenz des NBD-PE bzw. des freigesetzten Calceins innerhalb der Endothelzellen konnte durch eine Anregungswellenlänge von 488nm gut sichtbar gemacht werden. 3.6. pH-sensitive Immunoliposomen 47
3.6.4.2. Auswirkung von Äquilibrierungsreagenzien Zur quantitativen Unterscheidung der Markerfreisetzung schlossen sich Versuche in schwarzen 96-well-Platten an. Dafür wurden Nabelschnurendothelzellen aus Kulturschalen abtrypsinisiert und in einer Anzahl von je 20000 pro well in Platten ausplattiert. Diese wurden mit 50nmol pH-sensitiver/pH-insensitiver Immunoliposomen für 90 Minuten im Brutschrank inkubiert. Nach Spülvorgängen mit PBS wurde die Fluoreszenz des Calceins am Fluostar bestimmt. Eine erneute Messung folgte nach Detergenzzugabe (Triton-X-100, 1% Endkonzentration), wobei noch intakte Liposomen innerhalb der Zelle zerstört wurden. Dieser Versuchsablauf wiederholte sich anschließend mit einer geringen Modifikation. Einem Teil der Endothelzellen wurde Ammoniumchlorid als Äquilibrierungsreagens hinzugegeben. Dadurch wurde die Azidifizierung der Endosomen/Lysosomen blockiert [Maxfield (1982)]. Das Ammoniumchlorid wurde zu 20mM in Medium gelöst und den Zellen 30 Minuten als Präinkubation hinzugegeben. Die Menge der zugesetzten pH-sensitiven/pH-insensitiven Immunoliposomen blieb unverändert. Auch die Zugabe des Detergenz zur Lyse aller Bestandteile blieb gleich. Im Anschluss daran wurden diese Ergebnisse mit den Versuchen ohne Äquilibrierungsreagenz verglichen. 3.6.4.3. Einschluss von 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid Um das intrazelluläre Schicksal der pH-sensitiven Immunoliposomen abschließend beurteilen zu können, folgte ein Versuch mit lysosomalen Substraten [Yoshimura et al. (1995)]. Das zu verkapselnde Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glykosid wurde als 10mM Pufferlösung über die Phasenumkehrmethode in die Liposomen gebracht. Als Blindprobe wurde wieder die pH-insensitive Lipidmischung ausgewählt (DPPC/CHEMS). Es folgte eine Kopplung des spezifischen Antikörpers über N-Glut-PE an die Liposomenoberfläche und anschließend die Abtrennung freier Antikörpermoleküle über eine Sepharose ® -4B-Säule. In schwarze 96-well-Platten wurden HUVEC ausplattiert (20000 je well) und der IL-1ß- Stimulation unterzogen. Die Immunoliposomen wurden auf die Zellen gegeben und für 90 Minuten im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit erfolgte die Fluoreszenzmessung alle 10 Minuten. Da die Hintergrundfluoreszenz relativ hoch war, mussten die betroffenen wells vor jeder Messung mit PBS gespült und dann vermessen werden. Die Wellenlänge am Fluostar betrug Ex. 320nm und Em. 390nm. 3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen Für einen erfolgreichen selektinvermittelten Gentransfer durch pH-sensitive Immunoliposomen am entzündeten Endothel stellt die Verkapslungsrate des Genmaterials den limitierenden Faktor dar. Deshalb müssen die Liposomen in Bezug auf ihre Einschlusseffizienzen entsprechend der jeweiligen Herstellungsmethode (Kapitel 3.2.1.) näher überprüft werden. Auf die Hydratationsmethode soll hier nicht weiter eingegangen werden, da die ermittelten Verkapslungsraten dort nie 4% überschreiten und somit für den Einsatz hochwertiger Plasmid-DNA inakzeptabel sind. Im Rahmen folgender Untersuchungen sollen sowohl Detergenz- als auch Phasenumkehrmethode durch Modifizierungen in ihrer Einschlussrate optimiert und auf ihre Transfektionsfähigkeit hin untersucht werden. 3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen 48
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Seite 11 und 12: literspritze aufgezogen und in die
Seite 13 und 14: 37°C kultiviert. Während dieser Z
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