3. Materialien und Methoden - Martin-Luther-Universität Halle ...

Desoxyribonukleinsäure [Latt et al. (1976)]. Dazu wurde eine Kalibrierkurve im Konzentrationsbereich
1µg bis 100µg/ml erstellt. Von diesen Konzentrationen wurden je 100µl mit
100µl Hoechstfarbstofflösung (10µg/ml) versetzt. Die Fluoreszenz wurde bei den Wellenlängen
Ex. 355nm und Em. 460nm am Fluostar Plattenreader bestimmt. Für diesen Versuch
wurden schwarze 96-well-Platten verwendet. Zur Lyse der Vesikel wurde Triton-X-100 (1%
Endkonzentration) eingesetzt.
3.7.2.2. Elektronenmikroskopische Aufnahmen
Die hergestellten CCL´s und SPLP´s sollten hinsichtlich ihres komplexierten Inhaltes
strukturell charakterisiert werden. Die Aufnahmen basierten auf der Basis der Elektronenmikroskopie.
Alle mikroskopischen Bilder wurden am Institut für Ultrastrukturforschung des
Klinikums der Friedrich-Schiller-Universität Jena aufgenommen. Die Arbeiten standen unter
der Leitung von Dr. W. Richter, dem ich an dieser Stelle nochmals danken möchte. Für die
Probenpräparationen kamen Einrichtungen zum schnellen Einfrieren (dadurch veränderungsfrei)
zum Einsatz. Transmissionselektronische Messungen (TEM) wurden mit einem Philips
CM 120 durchgeführt. Die Gefrierbruch-Präparate („freeze-fracture“) wurden mit Hilfe der
Balzers BAF 400T-Anlage (Balzers, Lichtenstein) erstellt. Präparate für die „cryo-TEM“
wurden als ultradünne Flüssigkeitsschicht sofort in flüssigem Ethan eingefroren. Anschließend
wurden die Proben unter flüssigem Stickstoff mit einem Gatan-Cryo-Halter (Einrichtung
für die direkte Untersuchung von Objekten in dünnen Eisfilmen an einem Elektronenmikroskop)
in ein Philips CM 120 Elektronenmikroskop überführt und näher untersucht.
3.7.2.3. Serumstabilität
In Analogie zur Bestimmung der Serumstabilität bei den pH-sensitiven Immunoliposomen
in Kap. 3.6.2. wurde auch hier 40% Serum eingesetzt. Die CCL´s und SPLP´s
wurden entsprechend Kap. 3.7.1. hergestellt und mit Antikörpern funktionalisiert. Sowohl von
den CCL´s als auch von den SPLP´s wurden plasmidhaltige und leere Vesikel präpariert und
in den Untersuchungen gegenübergestellt. Damit sollte der Einfluss verkapselter Lipoplexe
auf eine eventuell auftretende Seruminstabilität untersucht werden. Da in diesem Teilabschnitt
der Arbeit die Stabilität der Vesikel und nicht deren Targetspezifität im Vordergrund stand,
wurde bei der anschließenden Kopplung von Antikörpern auf die kostengünstigere Variante
des Einsatzes unspezifischer Antikörper zurückgegriffen. Die Präparationen erfolgten jeweils
in einer 100mM Calceinlösung pH 7,4. Die Liposomen wurden nach Abtrennung von freien
Antikörpern (Sepharose ® ) und Calceinlösung (Sephadex ® ) in schwarze 96-well-Platten
pipettiert. Abschließend wurde dort ihr Freisetzungsverhalten in Serum über 2 Stunden bei
37°C entsprechend Kap. 3.6.2. ermittelt.
3.7.2.4. pH-abhängiges Freisetzungsverhalten
Die verwendeten liposomalen Trägersysteme CCL und SPLP wurden entsprechend
Kap. 3.7.1. hergestellt. Es wurden jeweils plasmidgefüllte und leere Vesikel beider
Populationen gegenübergestellt und ausgewertet. Parallel zur Überprüfung der Serumstabilität
kam als wässrige Phase eine zuvor auf pH 7,4 eingestellte 100mM Calceinlösung zum
3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen
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