3. Materialien und Methoden - Martin-Luther-Universität Halle ...

Selektin-Expression für 3 Stunden mit IL-1β stimuliert. Nach der Stimulation wurde zweimal
mit Medium M199 gewaschen und die Liposomen auf die Zellen gebracht. Das Verhältnis
entsprach 15–50pg DNA/HUVEC. Die Zellen wurden für 8 Stunden im Brutschrank
inkubiert. Das Medium M199 enthielt auch während dieser Zeit den üblichen Anteil an Serum
und anderen Komponenten. Nach der Inkubationszeit wurde zweimal mit PBS gewaschen und
Medium hinzugegeben. Die HUVEC wurden weitere 48 Stunden im Brutschrank kultiviert.
Anschließend wurde erneut mit PBS gespült. Es schloss sich eine Zellfixierung an. Dafür
wurden die Zellen für 15 Minuten mit 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Nach doppeltem Spülvorgang mit PBS wurden die wells mit einer Mowiol/Propylgallatlösung
[Longin et al. (1993)] bedeckt. Über Nacht erfolgte die Trocknung dieser Schutzlösung. Die
Aufnahmen der Bilder erfolgten am Fluoreszenzmikroskop Axiovert 135 (Carl Zeiss, Jena,
Deutschland) bei Ex. 485nm/Em. 520nm.
Mowiol-Mounting-Medium:
- 5g Mowiol (Polyvinylalkohol) 488 mit 20ml PBS über Nacht rühren
- 10ml Glycerol zusetzen und über Nacht rühren
- Zentrifugation bei 15000 RPM für 1h
- Überstand bei 4°C aufbewahren
FITC-Anti-Fading:
- 0,625g n-Propylgallat mit 12,5ml PBS und 12,5ml Glycerol über Nacht rühren
- bei 4°C aufbewahren (Haltbarkeit 6 Wochen)
Die fertige Lösung besteht aus 3 Teilen Mowiol und 1 Teil FITC-Anti-Fading.
3.7. Gentransfer mit pH-sensitiven Immunoliposomen
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