3. Materialien und Methoden - Martin-Luther-Universität Halle ...

Cyanurchloridrest konnten in einer späteren Kopplungsreaktion Proteine durch eine
nukleophile Substitutionsreaktion gebunden werden. Die Integrität des Ankers innerhalb der
späteren Liposomenbilayer war durch das Vorhandensein des DPPE-Restes gewährleistet.
Zur synthetischen Darstellung dieses endgruppenfunktionalisierten Lipidankers wurden
200mg DPPE (0,29mmol) in trockenem Chloroform gelöst und mit 160mg Cyanurchlorid
(0,87mmol) und 37mg N,N-Diisopropylethylamin (0,29mmol) versetzt. Der Reaktionsansatz
blieb für 72h unter Rühren bei Raumtemperatur. Eine Kontrolle der stattgefundenen
Umsetzung erfolgte dünnschichtchromatografisch im Laufmittel Chloroform/Methanol/
Wasser im Volumenverhältnis 65/35/0,5 mit anschließender bekannter Detektion in Form der
Sprühreihenfolge von Bromthymolblau und Molybdänspray. Die funktionalisierte
Verbindung Cyanurchlorid-DPPE (Rf 0,7) wurde nun mittels präparativer DC (Kieselgel,
2mm Schichtdicke, Merck) isoliert. Die zweite Umsetzungsreaktion bestand in der
Anknüpfung der PEG-Kette. Dazu wurde das Cyanurchlorid-DPPE in trockenem Chloroform
aufgenommen und mit einer 0,9fachen molaren Menge des heterobifunktionellen α-Amino-ω-
Hydroxy-PEG (3000) versetzt. Dies wurde in Anwesenheit eines äquimolaren Gehaltes an
N,N-Diisopropylamin unter Rühren für 72h bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach
Beendigung der Reaktionszeit erfolgte die Überprüfung der Umsetzung mittels Dünnschichtchromatografie.
Das erhaltene Zwischenprodukt PEG-Cyanurchlorid-DPPE (Rf 0,65) wurde
durch präparative DC abgetrennt.
Die Anknüpfung des terminalen Cyanurchlorids an die funktionalisierte PEG-Kette des
Lipidankers stellte den letzten Schritt der Synthese dar. Das entstandene Zwischenprodukt
wurde dazu mit der dreifach molaren Menge an Cyanurchlorid und einer äquimolaren Menge
an N,N-Diisopropylamin versetzt. Nach weiteren 72h unter Rühren bei Raumtemperatur
erfolgte die Überprüfung des Reaktionsumsatzes mit Hilfe der Dünnschichtchromatografie
(Rf 0,6). Die abschließende Isolierung des Cyanur-PEG-DPPE aus dem Reaktionsansatz
erfolgte mit Hilfe der Säulenchromatografie (Kieselgel 60, Merck). Als Elutionsmittel kam
das Gemisch Chloroform/Methanol im Volumenverhältnis 90/10 bzw. später 70/30 zum
Einsatz. Das fertige Cyanur-PEG-DPPE wurde in einer Stammlösung der Konzentration von
1µmol/ml in Chloroform aufgenommen und bei einer Temperatur von –20°C aufbewahrt.
3.1.3. Präparative Isolierung bakterieller Plasmid-DNA
Das verwendete bakterielle Plasmid stammt aus transfizierten Escherichia coli und
codiert eine Antibiotikaresistenz. Die Trägerorganismen weisen beim Vorhandensein eine
Resistenz gegenüber dem β-Lactamantibiotikums Ampicillin auf. Die Isolierung erfolgte am
Institut für Physiologische Chemie der Medizinischen Fakultät, Martin-Luther-Universität
Halle/Wittenberg. Die Kultivierung und Transformation kompetenter Escherichia coli wurde
freundlicherweise von Dr. D. Glanz vom gleichen Institut durchgeführt, dem an dieser Stelle
nochmals mein persönlicher Dank gilt.
Die Plasmidisolierung aus Escherichia coli erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen
SDS-Lyse [Birnboim et al. (1979)] in leicht modifizierter Form. Die plasmidhaltigen Zellen
(100 ml) wurden dafür durch Zentrifugation (6000 RPM, 15 min, 20°C) vom Medium
abgetrennt. Das resultierende Zellpellet wurde vorsichtig mit 10ml der Lösung 1 in 50ml
Röhrchen aufgenommen. Die Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe von 50µl Lysozym
(10mg/ml). Eine Inkubation für 10 Minuten auf Eis schloss sich an. Durch Zugabe von 20ml
der Lösung 2 und vorsichtigen, langsamen Mischvorgängen kam es zur vollständigen
Zerstörung der Zellen, woran sich eine Inkubation von 10 Minuten auf Eis anschloss. Nun
wurden 15ml der Lösung 3 hinzupipettiert. Es folgte eine weitere Inkubation von 10 Minuten
3.1. Verwendete Substanzen
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