Rezeptortyrosinkinasen regulieren die Oberflächenaggregation des ...

Material und Methoden - 31 -
Tabelle 4: Einstellungen der Polymerasekettenreaktion
Zyklen Temperatur Dauer
1 95°C 2 min
18 95°C
60°C
68°C
20 s
10 s
30 s/kb
1 68°C 5 min
Plasmidgröße
Im Anschluss an die Polymerasekettenreaktion folgt durch Zugabe von 1 µl DpnI
Enzym ein 5 minütiger Verdau. Das DpnI Enzym baut spezifisch das doppelsträngige
DNA-template ab, welches methyliert oder nach dem 1. PCR-Zyklus hemimethyliert
ist. Nachdem nur die ursprünglich verwendeten Plasmide methyliert sind, bleiben auf
diese Art und Weise nur noch die mutierten vervielfältigten dsDNA Plasmidvektoren
übrig, welche keine Methylierung tragen. Diese werden dann in einer
Transformationsreaktion in X10-Gold Ultrakomptene Zellen eingebracht. Hierfür
werden 45 µl X10-Gold Ultrakompetente Zellen 2 µl β-Mercaptoethanol zugegeben
und 2 min auf Eis inkubiert. Anschließend werden 2 µl des DpnI verdauten PCR-
Ansatzes zugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Es folgt ein Hitzeschock bei 42°C
für 30 s. Nach dem Hitzeschock werden die Zellen mit 500 µl NZY+ Medium versetzt
und 1 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss daran werden 200 µl dieses Ansatzes auf
Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausplattiert und ü.N. bei 37°C
inkubiert. Die Präparation der Plasmid-DNA erfolgte wie in Abschnitt 4.2.1.2
beschrieben. Die gewonnen Plasmid-DNA wurde dann sequenziert (4baselab GmbH,
Reutlingen) um so die korrekte Sequenz mit eingefügter Mutation nachzuweisen.
4.2.1.8 RNA Isolation
Für die Isolierung von RNA aus kortikalen Neuronen in Kultur wurde das RNeasy
Mini Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Zellen (aus Versuch 4.2.2.5, Nucleofection) in
einer Dichte von ca. 1 x 10 6 wurden in 350 µl RLT Puffer durch Schaben mit der
Pippettenspitze vom Zellkulturschalenboden entfernt und aufgenommen. Diese
Lösung wurde dann mit 350 µl Ethanol (70 %) gemischt und anschließend in ein
RNeasy Mini-Säulchen geladen. Dieses wurde dann 30 s bei 8000 x g zentrifugiert
und der Durchlauf verworfen. Der erste Waschschritt erfolgte mit 700 µl RW1-Puffer
gefolgt von 2 Waschschritten mit je 500 ml RPE-Puffer. Das Säulchen wurde dann in