Rezeptortyrosinkinasen regulieren die Oberflächenaggregation des ...

Material und Methoden - 35 -
Lösungsmittelkontrolle 30 min vorbehandelt. Im Anschluss daran wurden die Zellen
weitere 30 min mit BDNF (100ng/ml), EphrinA5-Fc (100ng/ml) oder NF166-Fc
(100ng/ml) stimuliert. EphrinA5-Fc aktiviert seinen Rezeptor nur dann effektiv, wenn
es als Oligomer vorliegt. Aus diesem Grund wurden EphrinA5-Fc und NF166-Fc
durch eine Vorinkubation mit einem gegen den Fc-Teil gerichteten Antikörper 30 min
oligomerisiert.
Für die Herstellung der Zelllysate wurden das Medium komplett abgesaugt und die
Zellen anschließend 1-2 x mit eiskaltem PBS gewaschen. Es wurde dann eine
entsprechende Menge IP-Puffer mit 1:25 Protease Inhibitor (Roche, Mannheim) auf
die Zellen gegeben (12-well 40 µl -80 µl, 10 cm Platte 600 µl - 800 µl) und 10 min auf
Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Hilfe eines Zellschabers von der Well-
Platte gelöst und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lysiert. Das Lysat wurde
dann bei 16000x g 10 min zentrifugiert und das Pellet verworfen. Die
Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des BCA Protein Assays (Thermo Scientific,
Bonn) bestimmt.
4.2.1.13 Proteinkonzentrationsbestimmung
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das BCA Protein Assay Kit von
Pierce/Thermo Scientific verwendet. Die Proteinkonzentrationsbestimmung beruht
darauf, dass an Proteine gebundenes Kupfer in alkalischer Umgebung von Cu 2+ auf
Cu 1+ reduziert wird. Die Farbreaktion zur Konzentrationsmessung wird ausgelöst,
indem Bicinchoninsäure (bicinchoninic acid, BCA), welche zur Proteinsuspension
gegeben, wird mit Cu 1+ komplexiert. Die Komplexe aus Kupfer und Bicinchoninsäure
besitzen bei steigender Proteinkonzentration eine starke lineare Abosprtion bei 562
nm, welche spektrometrisch gemessen werden kann. Die Konzentrationsbestimmung
wurde wie in der Anleitung beschrieben durchgeführt. Dabei wurden in eine 96 well
Platte je in Doppelbestimmungen 10 µl der Albumin-Standardlösung
(Konzentrationen von 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 750 µg/ml, 500 µg/ml,
250 µg/ml, 125 µg/ml, 25 µg/ml und 0 µg/ml), sowie der zu bestimmenden
Proteinlösungen pipettiert. Anschließend wurden je 200 µl des working reagent
(Mischung 50:1 Reagent A : Reagent B) zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert.
Zur Analyse wurde die Absorption der Proben in einem Spektrophotometer (Perkin-
Elmer, Rodgau) bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen. Die unbekannte
Proteinkonzentration wurde dann mit Hilfe der Eichgerade der Albumin-