Rezeptortyrosinkinasen regulieren die Oberflächenaggregation des ...

Material und Methoden - 33 -
4.2.1.11 Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)
Mit Hilfe der quantitativen RT-PCR ist es im Gegensatz zum Standard-PCR
Verfahren möglich, das entstehende PCR Produkt direkt quantitativ zu bestimmen.
Die Quantifizierung erfolgt über die Detektion von Fluoreszenzsignalen. Proportional
zur Menge des entstehenden PCR-Produkts nimmt dabei ebenfalls das
Fluoreszenzsignal zu.
Die Quantifizierung erfolgte über die ∆∆C T Methode. Hierbei werden zuerst die C T -
Werte ermittelt, welche den Zyklus angeben, bei dem die Fluoreszenz den Wert der
Hintergrundfluoreszenz überstiegen hat und sich im linearen Anteil des Anstiegs des
Fluoreszenzsignals befindet. Um quantitative Aussagen zu treffen, wurde
anschließend der ∆C T berechnet, welcher sich durch Normierung auf eine definierte
Kontrolle (zum Beispiel die Messung des Haushaltsgens GAPDH) ergibt. Hierbei
wurde der C T Wert des Haushaltsgens vom C T Wert des Gens von Interesse
abgezogen. Um einen ∆∆C T Wert zu erlangen wird ein weiterer Normierungsschritt
eingeführt. Hierbei wurde die Differenz der ∆C T -Werte einer definierten Probe
(Kontrollbehandlung) und der jeweiligen Behandlung von Interesse gebildet. Dieser
∆∆C T -Wert wird dann in die Gleichung 2 -∆∆CT eingesetzt, was den Wert für eine
n-fache relative Expression ergibt.
TaqMan® – quantitative Real-Time (qRT) – PCR
Die TaqMan ® qRT – PCR beruht auf dem gleichen Prinzip wie eine einfache
Standard-PCR. Bei der TaqMan qRT – PCR wird aber zur gleichzeitigen
Quantifizierung der cDNA Mengen die sogenannte FRET (Förster-
Resonanzenergietransfer) Methode angewandt. Das Prinzip der FRET Methode
beruht auf der Übertragung von Energie von einem angeregten Donor-Fluorochrom
(Reporter) auf ein in der Nähe befindliches Akzeptor-Fluorochom (Quencher). Dieser
Quencher wird hierdurch ebenfalls aktiviert und emittiert dann ein bestimmtes
Fluoreszenzsignal. Vergrößert sich der Abstand zwischen Reporter und Quencher
nimmt das FRET Fluoreszenzsignal des Quenchers ab, während das des Reporters
ansteigt. Bei der Methode der TaqMan qRT – PCR werden sogenannte
Oligonukleotid-Sonden verwendet, welche am 3‘-Ende einen Quencher sowie am 5’-
Ende einen Fluoreszenzfarbstoff als Reporter tragen. Die zu den Primerpaaren
komplementären Sequenzen werden durch eine Taq-Polymerase synthetisiert,
welche gleichzeitig eine 5‘-Exonukleaseaktivität beinhaltet. Dies führt dazu, dass die