Rezeptortyrosinkinasen regulieren die Oberflächenaggregation des ...

Material und Methoden - 37 -
TEMED 10 µl
Tabelle 9: Zusammensetzung eines 7 %igen Tris-Glyzin Trenngels
Tris-Glyzin Trenngel
ddH 2 O
Tris-HCl pH 6,8
30% Acrylamid/
3,67 ml
1,95 ml
1,75 ml
Bisacrylamid (29:1)
10 % (w/v) SDS 90 µl
10% (w/v) APS 40 µl
TEMED 10 µl
Im Anschluss an die SDS PAGE werden die hier aufgetrennten Proteine im
eigentlichen Blotting Vorgang auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Hierzu
wurde die sogenannte Semi-dry sandwich blotting Methode verwendet.
Hierfür wurden in Blottingpuffer getränktes Whatman-Papier, die
Nitrozellulosemembran sowie das Gel und anschließend wieder Whatman Papier in
Form eines sogenannten Sandwiches angeordnet und in die Blotting-Apparatur mit
der aniodischen Platte unten, sowie der kathodischen Platte oben eingelegt. Es
wurde dann ein konstanter Strom von 2 mA/cm² Membran angelegt durch welchen
die Proteine aus dem Gel auf die Membran übertragen werden.
Im Anschluss an den Blotting Vorgang wurde die Membran entnommen, kurz in 0,1
% TBST gewaschen und mit 5 % Milch/0,1 % TBST für 1 h bei Raumtemperatur
geblockt. Die Membran wurde dann in Antikörperlösungen (alle in 5 % BSA/0,1 %
TBST) zu Detektion spezifischer Protein über Nacht bei 4°C inkubiert. Bevor die
Membran in eine Lösung mit Meerrettichperoxidase gekoppeltem
Sekundärantikörper (in 5 % Milchpulver (w/v) / 0,1% TBST) zur Detektion des
spezifischen Primärantikörpers überführt wurde, wurde sie 3x 5 min in 0,1 % TBST
gewaschen. Die Inkubation mit Sekundärantikörper erfolgte für 1,5 h bei
Raumtemperatur. Die an den Sekundärantikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase
setzt nach Zugabe ihres Substrats (Luminol), dieses in seine oxidierte Form um,
welches dabei luminesziert. Diese Lumineszenz kann mit Hilfe von
Röntgendetektionsfilmen detektiert werden. Vor Zugabe dieses Substrats wird die